李衍珂, 李 祥

(上海交通大學(xué) 機(jī)械系統(tǒng)與振動(dòng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200240, E-mail: 1302449799@qq.com)

惡性腫瘤嚴(yán)重威脅人類(lèi)的健康和生命,是人類(lèi)致死疾病的最大病因[1]。嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy, CAR-T)療法被認(rèn)為是治療癌癥最具潛力的治療方法之一[2],該療法的成功實(shí)施需要在體外環(huán)境下制備、擴(kuò)增CAR-T細(xì)胞。盡管具有積極的臨床結(jié)果,但CAR-T細(xì)胞制備成本高昂,超過(guò)25萬(wàn)美元[3],而且制備工藝涉及開(kāi)放的人工手動(dòng)操作流程[4],會(huì)帶來(lái)極大的污染風(fēng)險(xiǎn)和批次質(zhì)量差異等問(wèn)題,因此,全封閉、自動(dòng)化、可溯源的CAR-T細(xì)胞制備系統(tǒng)的研發(fā)迫在眉睫。

目前,歐美國(guó)家已開(kāi)發(fā)出多款CAR-T細(xì)胞自動(dòng)化制備系統(tǒng)。其中,德國(guó)Miltenyi公司的CliniMACS ProdigyTM是迄今為止市面上最符合CAR-T細(xì)胞全自動(dòng)制備準(zhǔn)則的自動(dòng)化、集成化的CAR-T制備與監(jiān)測(cè)系統(tǒng),它將CAR-T細(xì)胞制備過(guò)程中所需的全部制備裝置、監(jiān)測(cè)系統(tǒng)、動(dòng)力系統(tǒng)、液體儲(chǔ)存系統(tǒng)、人機(jī)接口都集成在一個(gè)細(xì)胞制備平臺(tái)上[5],極大降低了成本、簡(jiǎn)化了流程,但是該設(shè)備售價(jià)昂貴,高達(dá)數(shù)百萬(wàn)元,這無(wú)疑極大提高了細(xì)胞治療的門(mén)檻,不利于CAR-T療法的普及。 國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上尚未出現(xiàn)商業(yè)化的CAR-T細(xì)胞自動(dòng)化制備系統(tǒng),東南大學(xué)的肖忠黨教授團(tuán)隊(duì)開(kāi)展了CAR-T 細(xì)胞自動(dòng)化制備系統(tǒng)的設(shè)計(jì)和軟硬件研發(fā)工作,但是該系統(tǒng)缺乏對(duì)溶解氧(Dissolved Oxygen, DO)濃度的監(jiān)測(cè)與控制,并且對(duì)培養(yǎng)環(huán)境中溫度、CO2濃度的監(jiān)測(cè)控制是使用商品化的獨(dú)立模塊,沒(méi)有實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)集成[6]。

根據(jù)CAR-T細(xì)胞制備工藝流程,開(kāi)發(fā)一套符合GMP管理規(guī)范的全封閉自動(dòng)化CAR-T細(xì)胞制備與監(jiān)控系統(tǒng)。該系統(tǒng)的管路部分包括一次性反應(yīng)器、密閉管路和一次性醫(yī)用試劑袋,采用無(wú)菌接合方式,管路通過(guò)0.22 μm過(guò)濾器與大氣相通,實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)整體的全封閉;機(jī)電控制部分由程序控制夾管閥的時(shí)序開(kāi)斷和蠕動(dòng)泵的精確旋轉(zhuǎn),實(shí)現(xiàn)免疫磁珠、培養(yǎng)液、病毒、蛋白等物料的自動(dòng)定量添加,程序控制舵機(jī)驅(qū)動(dòng)條形磁鐵轉(zhuǎn)位機(jī)構(gòu),實(shí)現(xiàn)對(duì)T細(xì)胞的吸附分選;培養(yǎng)環(huán)境核心參數(shù)監(jiān)控部分由下位機(jī)在線采集溫度、pH、CO2濃度、DO濃度傳感器數(shù)據(jù)并實(shí)時(shí)調(diào)控在最適范圍內(nèi)。

1 系統(tǒng)設(shè)計(jì)

1.1 系統(tǒng)原理與CAR-T細(xì)胞制備流程

CAR-T細(xì)胞的制備流程包括采集患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)懸液、免疫磁珠分選、激活、轉(zhuǎn)導(dǎo)、擴(kuò)增CAR-T細(xì)胞、收集CAR-T細(xì)胞并回輸?shù)交颊唧w內(nèi)[7],整個(gè)流程要在符合GMP管理規(guī)范的環(huán)境下進(jìn)行,并要嚴(yán)格做好不同生產(chǎn)環(huán)節(jié)之間的高效、無(wú)菌銜接。

系統(tǒng)原理圖如圖1(a)所示,系統(tǒng)外接PBMC懸液、培養(yǎng)液、生理鹽水、蛋白、磁珠、病毒載體等物質(zhì)的一次性醫(yī)用儲(chǔ)液袋,以及CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品收集袋和廢液收集袋。管道、儲(chǔ)液袋和反應(yīng)器均做到全封閉、一次性,通過(guò)0.22 μm過(guò)濾器與外界相通,既保證了整個(gè)管道系統(tǒng)的氣壓平衡,又防止了外界的污染源進(jìn)入管道系統(tǒng);根據(jù)初始細(xì)胞量和不同階段的增殖量,反應(yīng)器結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)為階梯式,內(nèi)部有各傳感器的固定位置和混合氣體接入口;系統(tǒng)使用夾管閥控制各個(gè)位置管路的開(kāi)合,使用蠕動(dòng)泵驅(qū)動(dòng)液體在管路內(nèi)流動(dòng),使用步進(jìn)電機(jī)柔和振蕩反應(yīng)器使得細(xì)胞可以充分接觸氧氣和養(yǎng)分,且利于細(xì)胞間的通訊[8],磁鐵轉(zhuǎn)位機(jī)構(gòu)使用舵機(jī)驅(qū)動(dòng)條形磁鐵旋轉(zhuǎn)實(shí)現(xiàn)T細(xì)胞分選;細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境監(jiān)控模塊由溫度、pH、CO2濃度、DO濃度傳感器和加熱膜、流量計(jì)構(gòu)成,傳感器通過(guò)數(shù)字口、模擬口和串口與下位機(jī)連接,實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)采集與反饋,配合控制程序調(diào)控培養(yǎng)環(huán)境核心參數(shù)穩(wěn)定在最適范圍內(nèi)。

圖1 系統(tǒng)圖

首先將一次性管路、生物反應(yīng)器等接入系統(tǒng)設(shè)定位置;利用條碼槍掃描患者PBMC儲(chǔ)液袋的條形碼,系統(tǒng)自動(dòng)讀取患者信息;然后,系統(tǒng)按照預(yù)設(shè)程序開(kāi)始CAR-T細(xì)胞的自動(dòng)化制備,自動(dòng)化制備流程如下:泵入患者PBMC至反應(yīng)器,將CD3/28免疫分選磁珠泵入反應(yīng)器并柔和振蕩,促使免疫磁珠與T細(xì)胞的充分結(jié)合,磁鐵轉(zhuǎn)位機(jī)構(gòu)轉(zhuǎn)入反應(yīng)器底部,充分吸附固定磁珠,排出廢液,完成對(duì)T細(xì)胞的分選;泵入15 mL細(xì)胞培養(yǎng)液,自動(dòng)加入病毒載體以轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞;開(kāi)啟細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增,期間持續(xù)柔和振蕩反應(yīng)器,維持液體溫度在(37±0.5)℃范圍內(nèi),實(shí)時(shí)在線監(jiān)控pH、CO2濃度、DO濃度并及時(shí)補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)液、磁珠、蛋白;細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增結(jié)束后,開(kāi)啟細(xì)胞收集,磁鐵轉(zhuǎn)位機(jī)構(gòu)轉(zhuǎn)入反應(yīng)器底部,排出廢液,分離CAR-T細(xì)胞與雜質(zhì),泵入生理鹽水,完成對(duì)CAR-T細(xì)胞的洗滌,將殘留在8 μm濾膜的CAR-T細(xì)胞充分轉(zhuǎn)移至反應(yīng)器內(nèi),最后將CAR-T細(xì)胞泵入細(xì)胞收集袋,CAR-T細(xì)胞制備過(guò)程結(jié)束。系統(tǒng)當(dāng)前所處的CAR-T細(xì)胞制備流程、加入試劑的種類(lèi)與體積、操作者的軟件操作記錄都以日志文件的形式被詳細(xì)記錄下來(lái),便于溯源。CAR-T細(xì)胞自動(dòng)化制備系統(tǒng)原型樣機(jī)實(shí)物圖如圖1(b)所示。

1.2 機(jī)電控制系統(tǒng)架構(gòu)設(shè)計(jì)

機(jī)電系統(tǒng)設(shè)計(jì)架構(gòu)圖如圖2所示,使用電腦作為上位機(jī)、Arduino Mega 2560控制板作為下位機(jī)。上位機(jī)接入條碼槍掃描患者條形碼、讀取患者信息,系統(tǒng)當(dāng)前所處的CAR-T細(xì)胞制備流程、加入試劑的種類(lèi)與體積、操作者的軟件操作記錄都以日志文件的形式被詳細(xì)記錄下來(lái),便于溯源;下位機(jī)連接控制繼電器、步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)器,控制夾管閥、蠕動(dòng)泵、步進(jìn)電機(jī)和舵機(jī)的時(shí)序動(dòng)作;上位機(jī)與下位機(jī)之間通過(guò)串口RS-232進(jìn)行實(shí)時(shí)通信。溫控模塊采用加熱膜、液體溫度傳感器、位式控制技術(shù)將細(xì)胞培養(yǎng)液的穩(wěn)定控制在(37±0.5)℃;pH控制模塊使用pH傳感器和平衡控制程序?qū)崟r(shí)監(jiān)控反應(yīng)器中細(xì)胞培養(yǎng)液的pH值變化,并將pH數(shù)據(jù)實(shí)時(shí)傳送給下位機(jī),維持培養(yǎng)體系的弱堿性;CO2濃度控制模塊使用CO2濃度傳感器配合夾管閥,結(jié)合反饋控制算法,使得反應(yīng)器內(nèi)CO2濃度始終維持在適于細(xì)胞生長(zhǎng)的5%;DO控制模塊使用DO傳感器獲取培養(yǎng)液中DO的實(shí)時(shí)濃度數(shù)據(jù),并結(jié)合CO2濃度數(shù)據(jù)決定氣瓶閥門(mén)的開(kāi)閉以更新反應(yīng)器內(nèi)氣體環(huán)境。

圖2 機(jī)電控制系統(tǒng)架構(gòu)設(shè)計(jì)圖

1.3 生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)

利用Catia軟件建立生物反應(yīng)器三維模型如圖3(a)所示,反應(yīng)器包含一個(gè)液體輸入輸出接頭;根據(jù)初始細(xì)胞量和不同階段的增殖量,設(shè)計(jì)階梯式反應(yīng)器結(jié)構(gòu),確保每個(gè)階段的最佳細(xì)胞密度和懸液容積。如圖3(b)所示為反應(yīng)器內(nèi)部結(jié)構(gòu)圖,初始培養(yǎng)區(qū)位于液體接頭處,該區(qū)域有利于減少磁珠的損耗、增強(qiáng)磁場(chǎng)力對(duì)磁珠的吸附作用,便于細(xì)胞分選過(guò)程的高效進(jìn)行;為了便于控制,使用步進(jìn)電機(jī)[8]帶動(dòng)反應(yīng)器正反旋轉(zhuǎn),配合容器內(nèi)的葉片結(jié)構(gòu),形成對(duì)培養(yǎng)液的柔和振蕩,從而使得細(xì)胞可以充分接觸氧氣和養(yǎng)分,細(xì)胞之間的通訊信號(hào)聯(lián)系更為容易,且使用步進(jìn)電機(jī)具有精度高、速度范圍寬等特點(diǎn)[9]。反應(yīng)器底部的溫控模塊用于對(duì)反應(yīng)器內(nèi)的液體進(jìn)行加熱、保溫,為細(xì)胞增殖提供適宜的溫度環(huán)境。磁鐵轉(zhuǎn)位機(jī)構(gòu)驅(qū)動(dòng)條形磁鐵進(jìn)入反應(yīng)器底部,吸附固定磁珠,實(shí)現(xiàn)分選T細(xì)胞的功能。反應(yīng)器外部有孔徑8 μm的聚丙烯濾膜過(guò)濾器,用于T細(xì)胞的過(guò)濾分離。

圖3 反應(yīng)器圖

2 實(shí)驗(yàn)

2.1 培養(yǎng)環(huán)境核心參數(shù)監(jiān)控實(shí)驗(yàn)

人體細(xì)胞生長(zhǎng)增殖最適宜的溫度范圍為(37±0.5)℃[10],因此需要確保反應(yīng)器中的培養(yǎng)液溫度上升到該范圍內(nèi)并持續(xù)保溫。實(shí)驗(yàn)中間隔向反應(yīng)器通入培養(yǎng)液,使得反應(yīng)器的液體量分別達(dá)到15 mL、30 mL、100 mL、200 mL、300 mL、400 mL,以模擬細(xì)胞增殖過(guò)程中,不斷向反應(yīng)器添加新鮮培養(yǎng)液的過(guò)程。每加入一次培養(yǎng)液后,加熱膜依據(jù)Arduino Mega 2560所采集到的液體溫度數(shù)據(jù)進(jìn)行通斷加熱,使其溫度始終維持在(37±0.5)℃范圍內(nèi)?？販剡^(guò)程采用位式控制技術(shù)并對(duì)溫度范圍分段,設(shè)定細(xì)胞培養(yǎng)液(25～33)℃為快速升溫階段、(33～36.5)℃為緩慢加熱階段、到達(dá)36.5 ℃時(shí)為保溫階段。有機(jī)玻璃薄板溫度過(guò)高容易變形,并且傳熱路徑有熱損耗,因此在快速升溫階段,加熱膜的表面溫度被控制在60 ℃;在緩慢加熱階段,加熱膜的表面溫度被控制在45 ℃;在保溫階段,加熱膜的表面溫度被控制在42 ℃。由于液體具有一定程度的熱慣性[11],達(dá)到保溫階段的液體還會(huì)有較小幅度的溫升,所以溫度控制下限為36.5 ℃。

體外培養(yǎng)人體細(xì)胞最適宜的pH范圍為7.2～7.4[12],過(guò)酸或者過(guò)堿都會(huì)影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng),因此需要控制培養(yǎng)體系的pH穩(wěn)定在該范圍之內(nèi)。以每次加入0.02 mL pH 6.5的磷酸鹽緩沖溶液(Phosphate Buffered Saline, PBS)、每隔5 min加入一次的策略,模擬細(xì)胞在擴(kuò)增狀態(tài)下乳酸的釋放與堆積導(dǎo)致培養(yǎng)體系pH下降的過(guò)程,設(shè)置pH的控制下限為7.15,pH傳感器的讀數(shù)低于控制下限后,加入5 mL pH 7.5的PBS(模擬添加新鮮培養(yǎng)液),一方面使得培養(yǎng)體系的pH回升到適宜細(xì)胞生長(zhǎng)的7.3左右,另一方面起到稀釋細(xì)胞的作用,防止因?yàn)槊芏冗^(guò)大、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏而阻礙細(xì)胞的進(jìn)一步擴(kuò)增,整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中柔和振蕩反應(yīng)器,充分混合內(nèi)部液體。

氣體環(huán)境對(duì)于細(xì)胞的呼吸作用有著重要的作用。體外條件下,氣體環(huán)境應(yīng)該保持為5%CO2[13-14]+95%空氣的混合氣體狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)使用CO2濃度傳感器和閥門(mén)來(lái)控制反應(yīng)器氣體環(huán)境,當(dāng)傳感器讀數(shù)低于設(shè)定值4.9%,下位機(jī)控制閥門(mén)11開(kāi)啟,釋放5%CO2的混合氣體進(jìn)入反應(yīng)器,更新氣體環(huán)境。裝有混合氣體的氣瓶經(jīng)過(guò)減壓閥、流量計(jì)降壓降速至流速(0～100)mL/min,再經(jīng)過(guò)閥門(mén)11連接到反應(yīng)器的氣體接頭,閥門(mén)9常閉,CO2傳感器安裝在反應(yīng)器內(nèi)部,下位機(jī)采集CO2數(shù)據(jù)并據(jù)此控制閥門(mén)11通斷以調(diào)節(jié)CO2濃度,當(dāng)監(jiān)測(cè)到傳感器讀數(shù)低于4.9%時(shí),下位機(jī)控制閥門(mén)11開(kāi)啟3 s,當(dāng)讀數(shù)高于4.9%時(shí),閥門(mén)11保持關(guān)閉狀態(tài)。

充足的氧氣供應(yīng)是細(xì)胞進(jìn)行呼吸作用的必要條件[15]。在CAR-T制備體系中,細(xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)境是培養(yǎng)液,因此需要監(jiān)控培養(yǎng)液中DO濃度。在37 ℃的液體溫度環(huán)境下,本實(shí)驗(yàn)使用DO傳感器研究振蕩過(guò)程對(duì)DO濃度的影響。本實(shí)驗(yàn)在靜態(tài)條件下監(jiān)測(cè)DO濃度,后以5 r/min的轉(zhuǎn)速柔和振蕩反應(yīng)器,在動(dòng)態(tài)條件下監(jiān)測(cè)DO濃度,再重復(fù)一次上述靜態(tài)-動(dòng)態(tài)過(guò)程,采集DO濃度數(shù)值并繪制曲線圖。

2.2 細(xì)胞過(guò)濾分離實(shí)驗(yàn)

CAR-T制備流程中需要多次清洗細(xì)胞產(chǎn)品,去除雜質(zhì)成分。T細(xì)胞屬于懸浮細(xì)胞系,粒徑10 μm左右,本實(shí)驗(yàn)中使用粒徑10 μm、密度1.05 g/cm3的聚苯乙烯乳膠微粒代替T細(xì)胞,測(cè)試基于8 μm濾膜過(guò)濾方案的分離效果。設(shè)x為稀釋倍數(shù),單個(gè)微球體積為V0,人體外周血中T細(xì)胞的密度a為2.4×109/L,乳膠微粒分散體系密度c為25 mg/mL,聚苯乙烯的密度ρ為1.05 g/cm3,微球半徑R為5 μm,由濃度換算關(guān)系得:

(1)

其中:

(2)

得到x=18.958,取x=19。

根據(jù)上述計(jì)算得到的結(jié)果,將50 μL乳膠微粒懸濁液加入950 μL培養(yǎng)液中混勻,作為模擬PBMC懸液使用。將PBMC懸液泵入反應(yīng)器的初始培養(yǎng)區(qū);開(kāi)啟閥門(mén)3和9,泵入4mL培養(yǎng)液;開(kāi)啟閥門(mén)10,反應(yīng)器內(nèi)的液體通過(guò)8 μm濾膜泵出至細(xì)胞培養(yǎng)板中,標(biāo)記為A1;打開(kāi)閥門(mén)3和9,泵入適量的培養(yǎng)液,將殘留在8 μm濾膜的細(xì)胞回流至反應(yīng)器內(nèi)。CAR-T細(xì)胞制備流程中, T細(xì)胞的清洗過(guò)程往往需要三次重復(fù)的清洗步驟,因此再重復(fù)兩次上述操作,液體泵出至細(xì)胞培養(yǎng)板中,分別標(biāo)記為A2、A3;最后向反應(yīng)器泵入5 mL培養(yǎng)液,打開(kāi)閥門(mén)9,泵出反應(yīng)器內(nèi)的所有液體至細(xì)胞培養(yǎng)板中,標(biāo)記為A4,將細(xì)胞培養(yǎng)板放入恒溫箱中干燥48 h,在200倍光學(xué)顯微鏡下拍照并計(jì)數(shù)微球數(shù)量,觀察細(xì)胞過(guò)濾分離效果。

2.3 磁珠吸附固定實(shí)驗(yàn)

獲取患者的PBMC之后,需加入特定抗體修飾的CD3磁珠以分選T細(xì)胞[16]。該過(guò)程有兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn):一是抗體修飾的磁珠能夠準(zhǔn)確識(shí)別T細(xì)胞并牢固結(jié)合,二是磁珠與T細(xì)胞結(jié)合后,外加磁場(chǎng)可以將磁珠牢固吸附在反應(yīng)器底部,使其不會(huì)隨著液體的流動(dòng)而移動(dòng)。磁珠與T細(xì)胞識(shí)別并結(jié)合后,一旦磁珠被吸附固定,相應(yīng)的T細(xì)胞也就完成了分選的過(guò)程。

CAR-T細(xì)胞制備過(guò)程中常用的CD3免疫分選磁珠為直徑5 μm的微球,微球表面偶聯(lián)有CD3抗體以陽(yáng)性分選CD3+T細(xì)胞[17]。與CD3免疫磁珠相似,SiO2磁珠具有超順磁性,與CD3免疫磁珠有著相同的磁場(chǎng)行為,且兩種磁珠的密度相似(1.7 g/cm3左右)。本實(shí)驗(yàn)中采用粒徑5 μm的球形SiO2磁珠(百納泰科,中國(guó))代替CD3免疫磁珠。設(shè)y為稀釋倍數(shù),臨床上的CD3/28免疫分選磁珠的濃度為1.7×108/mL,SiO2磁珠(百納泰科,中國(guó))的濃度為10 mg/mL,磁珠密度為1.82 g/cm3,磁珠半徑為2.5 μm,按照與公式(1)、(2)相同的計(jì)算方法得出y=2。CAR-T制備流程中需要加入200 μL磁珠,根據(jù)上述計(jì)算結(jié)果,將100 μL SiO2磁珠懸濁液泵入反應(yīng)器,開(kāi)啟閥門(mén)3和9,將4.9 mL培養(yǎng)液泵入反應(yīng)器。靜置30 s后,磁鐵轉(zhuǎn)位機(jī)構(gòu)將條形磁鐵轉(zhuǎn)入反應(yīng)器底部。充分吸附2 min后,開(kāi)啟閥門(mén)9,將液體泵入細(xì)胞培養(yǎng)板中,標(biāo)記為B1。磁鐵轉(zhuǎn)位機(jī)構(gòu)轉(zhuǎn)出,開(kāi)啟閥門(mén)3和9,將5 mL培養(yǎng)液泵入反應(yīng)器,柔和振蕩反應(yīng)器并向其中通入空氣產(chǎn)生大量氣泡(模擬吹打細(xì)胞操作以促進(jìn)分散),打開(kāi)閥門(mén)9,將反應(yīng)器內(nèi)的液體全部泵出至細(xì)胞培養(yǎng)板中,標(biāo)記為B2。

3 結(jié)果與分析

3.1 培養(yǎng)環(huán)境核心參數(shù)監(jiān)控實(shí)驗(yàn)

溫度、pH、CO2、DO傳感器讀數(shù)曲線圖如圖4所示。從溫度變化曲線可以看出,培養(yǎng)液一共分為6次加入,最終的液體體積量為400 mL。每一次加入液體的瞬間,液體溫度有較大下降?？刂瞥绦蚣皶r(shí)響應(yīng)使得液體進(jìn)入快速加熱階段,液體立刻以較快速率升溫;當(dāng)液體溫度高于33 ℃時(shí),為了避免控溫超調(diào)、減小液體系統(tǒng)的熱慣性,進(jìn)入緩慢加熱階段,最終維持在(37±0.5)℃的范圍內(nèi),該溫度范圍是細(xì)胞增殖的最適溫度范圍。從pH變化曲線可以看出,初始液體是15 mL pH 7.5的PBS,由于外加pH 6.5 PBS的影響(模擬細(xì)胞在增殖過(guò)程中乳酸產(chǎn)生、堆積的過(guò)程)培養(yǎng)體系的pH會(huì)逐漸下降,當(dāng)?shù)陀诳刂葡孪?.15時(shí),反饋程序調(diào)節(jié)向反應(yīng)器內(nèi)補(bǔ)充5 mL pH 7.5的PBS,其作用一是使得pH回升至最適宜的7.2～7.4,二是起到稀釋細(xì)胞的作用,防止細(xì)胞因過(guò)度密集、養(yǎng)料匱乏而阻礙進(jìn)一步擴(kuò)增。從CO2濃度變化曲線可以看出,初始狀態(tài)下CO2濃度讀數(shù)遠(yuǎn)低于目標(biāo)值5%,程序控制氣閥打開(kāi),CO2氣體迅速進(jìn)入反應(yīng)器,并維持在5%的水平,當(dāng)CO2濃度出現(xiàn)±0.1%的波動(dòng)時(shí),程序控制氣閥自動(dòng)開(kāi)啟以更換反應(yīng)器內(nèi)的氣體,使CO2濃度始終維持在5%。從DO濃度變化曲線可以看出,在37 ℃的液體溫度環(huán)境下,靜態(tài)DO濃度處于比較低的4 mg/L水平;開(kāi)始振蕩(5 r/min)后, DO濃度會(huì)增加到接近6 mg/L的水平,并最終穩(wěn)定在6 mg/L;停止振蕩后,DO濃度又恢復(fù)為4 mg/L;再次開(kāi)始振蕩后,DO濃度仍會(huì)增加并保持穩(wěn)定。說(shuō)明對(duì)反應(yīng)器的柔和振蕩有利于提升培養(yǎng)液中DO濃度。

圖4 培養(yǎng)環(huán)境核心參數(shù)監(jiān)控曲線圖

3.2 細(xì)胞過(guò)濾分離實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞培養(yǎng)板A1、A2、A3、A4標(biāo)記位置的顯微觀察照片如圖5所示。

圖5 A1、A2、A3、A4標(biāo)記位置的顯微觀察照片

A1、A2、A3分別為CAR-T細(xì)胞制備工藝三次洗滌流程結(jié)束后廢液中微球的顯微照片,照片中微球數(shù)量越少,代表廢液中殘留的T細(xì)胞數(shù)量越少;A4為反應(yīng)器內(nèi)部液體中微球的顯微照片,從照片中可以看出,微球密密麻麻鋪滿整個(gè)視野而且分布在不同焦平面層上,數(shù)量十分巨大。采用五點(diǎn)取樣法對(duì)各個(gè)位置的微球密度進(jìn)行計(jì)數(shù),得到各標(biāo)記位置的微球密度如表1所示。

表1 各標(biāo)記位置的微球密度計(jì)算表/(個(gè)/ mm2)

由表1可以得出如下結(jié)果:

(1) 洗滌廢液和反應(yīng)器內(nèi)液體的微球密度,有著數(shù)量級(jí)上的差別。經(jīng)過(guò)三次洗滌過(guò)程,廢液中所包含的微球密度總和約占反應(yīng)器內(nèi)微球密度的2.13%,反應(yīng)器內(nèi)微球占微球總數(shù)的97.91%。

(2) 洗滌過(guò)程中,隨著洗滌次數(shù)的增加,廢液中微球密度成倍數(shù)減少。

實(shí)驗(yàn)表明基于8 μm濾膜的細(xì)胞過(guò)濾分離結(jié)構(gòu)配合液體回流方法能夠?qū)崿F(xiàn)T細(xì)胞與廢液的充分分離。

3.3 磁珠吸附固定實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞培養(yǎng)板B1、B2位置的顯微照片如圖6所示,照片顯示廢液中磁珠數(shù)量很少,只有零星聚集,而反應(yīng)器內(nèi)磁珠數(shù)量很多,在視野中呈分散式均勻分布,磁珠團(tuán)聚較少。對(duì)比兩張圖片,可以看出廢液和反應(yīng)器中磁珠數(shù)目有著很大區(qū)別,并且反應(yīng)器內(nèi)磁珠分散較均勻,團(tuán)聚現(xiàn)象很少出現(xiàn)。綜上所述,條形磁鐵的磁珠吸附固定方案能夠有效地完成對(duì)T細(xì)胞的分選過(guò)程,并且在很大程度上避免磁珠團(tuán)聚,增強(qiáng)磁珠的分散程度。

圖6 磁珠顯微照電

4 結(jié)論

本文研發(fā)了一套符合GMP規(guī)范的封閉式、自動(dòng)化CAR-T細(xì)胞制備與監(jiān)控原型樣機(jī),系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)反應(yīng)器內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)液溫度、pH、CO2濃度、DO濃度等核心參數(shù)的在線監(jiān)測(cè)與調(diào)控;基于8 μm濾網(wǎng)的細(xì)胞過(guò)濾清洗方案和基于磁鐵轉(zhuǎn)位機(jī)構(gòu)的磁珠吸附分選方案,能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)T細(xì)胞的分離清洗和免疫磁珠分選,除此之外該系統(tǒng)還具有物料自動(dòng)定量添加、細(xì)胞收集等功能。

綜上所述,本文所開(kāi)發(fā)的全封閉、自動(dòng)化CAR-T細(xì)胞制備與監(jiān)控原型樣機(jī)能滿足CAR-T細(xì)胞制備的基本要求,應(yīng)用于CAR-T細(xì)胞的自動(dòng)化生產(chǎn)有廣闊的前景。