裴佳歡 盛萬里 鄒明強 齊小花*

（1.中國檢驗檢疫科學研究院& 國家市場監(jiān)管重點實驗室（食品質量與安全） 北京 100176；2.北京工業(yè)大學環(huán)境與生命學部；3.呼和浩特海關技術中心）

0 引言

β-受體激動劑類物質（別名瘦肉精）是一類具有腎上腺素功能的化合物， 對動物體內(nèi)營養(yǎng)再分配具有促進作用，可促進蛋白質合成[1]。 這類物質通常按結構可分為苯胺型、苯酚型和苯二酚型等三大類，在臨床上主要用于治療哮喘、 慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）等呼吸系統(tǒng)疾病， 在動物飼養(yǎng)中， 由于具有減少脂肪積累、促進蛋白質生成和提高飼料轉化率的作用，曾被添加到動物飼料中以提高牲畜瘦肉率[2]。

常見的β-受體激動劑類物質有萊克多巴胺、沙丁胺醇、克倫特羅、西馬特羅等[3]。 該類物質被錯誤地應用于動物養(yǎng)殖中，引發(fā)一系列因食用含β-受體激動劑的食物而中毒的事件， 導致人體心血管和神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生嚴重不良反應，嚴重危害健康[4]。 豬肉中的瘦肉精在豬體內(nèi)的使用已被大多數(shù)國家和地區(qū)（如美國、日本和歐盟）禁止。為了確保動物源性食品安全，我國農(nóng)村農(nóng)業(yè)部在2020 年頒布的《食品動物中禁止使用的藥品及其他化合物清單》 中明令禁止使用該類藥物，規(guī)定在動物源性食品中不得檢出。但是，仍有一些不法商家受利益驅動，在養(yǎng)殖過程中違法添加。 2021 年的“央視3·15 晚會”再次曝光了某省黑心養(yǎng)殖戶為提高出肉率， 增加利潤而在飼養(yǎng)過程中添加“瘦肉精”的違法行為。該類事件屢次發(fā)生，引起了公眾的廣泛關注。因此，有必要盡快建立動物源性食品中β-受體激動劑類物質的檢測方法，為食品安全檢測提供技術支持。

目前，β-受體激動劑常見的檢測方法有氣相色譜-質譜法[5]、液相色譜-串聯(lián)質譜法[6]、高效液相色譜法[7]、酶聯(lián)免疫法[8]、表面增強拉曼光譜法[9]和電化學法[10]等。常用的色譜法存在一定的缺陷，如操作復雜、成本較高、前處理繁瑣、實驗儀器復雜等。 因此，建立一種簡單高效、 靈敏度高且適用于現(xiàn)場快檢的獸藥殘留方法尤為重要[11]。

表面增強拉曼光譜作為一種快速檢測化學危害物的工具，能夠提供豐富的目標物分子指紋圖譜，并且靈敏度高， 已用于肉類中獸藥殘留的檢測[12]。SERS 技術是指待測分子處于貴金屬表面， 在電磁場和化學增強的作用下， 產(chǎn)生拉曼散射信號顯著增強的現(xiàn)象[13]。 SERS 技術因其靈敏度高、簡單快捷的優(yōu)點， 被廣泛應用于檢測農(nóng)獸藥殘留和非法添加劑等領域[14]。 從理論上講，SERS 檢測技術與其他檢測方法相比具有極大優(yōu)勢， 特別是在復雜的環(huán)境基質中， 納米結構SERS 襯底和便攜式設備的進展將推動拉曼光譜檢測技術在快速現(xiàn)場分析中發(fā)揮重要作用[15-18]。 本研究以膠體金溶液為SERS 基底，使用便攜式拉曼光譜儀對豬肉中的克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇進行檢測，建立β-受體激動劑與SERS 強度的標準曲線。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

氯金酸（HAuCl4，99%）、檸檬酸三鈉（99.8%）（Sigma 公司）；克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇標準品（BIOFOUNT 范德（北京）生物科技有限責任公司）；甲醇、乙酸乙酯（色譜純，北京化工廠）；鹽酸、碳酸鈉（分析純， 麥克林）。 所有溶液配制使用超純水（18.3 MΩ）。

1.2 儀器

便攜式拉曼光譜儀（奧譜天成（廈門）科技有限公司）；Renishaw invia 共聚焦拉曼光譜儀（Renishaw公司）；XH-100A 微波合成萃取儀（北京祥鵠科技有限公司）；JEM-2100 透射電子顯微鏡（JEOL 公司）；U-3310 雙光束紫外分光光度計（Hitachi Limited 公司）。

本研究采用的便攜式拉曼光譜儀參數(shù)設置為激光功率500 mW，積分時間為10 s。 雙光束紫外分光光度計采集膠體金的光譜范圍為400～850 nm。

1.3 膠體金的合成

AuNPs 的合成如FRENS[19]所描述，利用改良的檸檬酸三鈉還原法制備膠體金（AuNPs）。將1%的氯金酸溶液1 mL 加入99 mL 去離子水中，在微波合成萃取儀中加熱攪拌；溫度上升至98℃時，穩(wěn)定溫度5 min， 隨后迅速加入1%檸檬酸三鈉溶液1.4 mL，繼續(xù)保持溫度，加熱攪拌5 min；顏色呈酒紅色后取出，冷卻至室溫，存放在4℃冰箱內(nèi)備用。

1.4 樣品標準溶液的配制

分別稱取0.01 g 的克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇的標準品于3 支10 mL 的離心管中，用甲醇溶劑[20]分別配制成1 mg/mL 的標準儲備液，密閉保存?zhèn)溆?。實驗過程中，再用超純水稀釋成所需濃度使用液。

1.5 光譜采集

在采集樣品光譜時，先將200 μL 的標準品水溶液和pH 值為4 濃度為1%的NaCl 水溶液混合均勻，再將800 μL 的膠體金加入到混合液中進行檢測。加入NaCl 溶液可使膠體金顆粒發(fā)生聚沉。 每種β-受體激動劑選取5 個樣品的不同濃度梯度進行拉曼光譜采集，每個樣品采集5 次。

1.6 樣品前處理

基于液-液萃取[21]方法進行，并簡化步驟。 稱取從市場選購的新鮮生豬肉 （不取白色脂肪組織）2.00 g 樣品，充分剪碎后放入15 mL 離心管中；加入2 mL 10%的碳酸鈉溶液， 將混合物渦旋混合2 min；加入2 mL 乙酸乙酯溶劑， 混合1 min； 將萃取液以10 000 r/min 離心2 min， 取上清液1 mL 于2 mL 離心管中；加入1mL 0.05mol/L 的鹽酸，渦旋混合1 min；自然靜置分層，棄去上層液，取下層液體為待測液，冷凝至干燥。 在使用時， 加入2 mL 超純水重新溶解，存放于4℃冰箱內(nèi)備用。

用超純水將1 mg/mL 的標準儲備液稀釋成2、4、6、8、10 μg/mL 4 個不同濃度。 取200 μL 4 個不同濃度的標品溶液加入到處理后的樣品中，制備含有2、4、6、8、10 μg/mL β-受體激動劑的豬肉樣品，用實際添加的β-受體激動劑與豬肉質量的質量比計算制備豬肉樣品中的β-受體激動劑含量。每種濃度制備3 個平行豬肉樣品，并取其平均值。

2 結果與討論

2.1 膠體金的表征

膠體金的光學性質可以用紫外/可見吸收光譜進行表征，如圖1 所示，紫外可見吸收峰的出峰位置在520 nm 處。 利用峰的位置和峰寬可以估計膠體金的粒徑和分散性，隨著顆粒尺寸的增大，膠體金的吸收峰逐漸紅移，吸收峰也越來越小[22]，尺寸和分散性隨之增加。膠體金的TEM 圖像如圖2 所示，可見膠體金的大小和形狀是均勻的，同時也具備較好的分散性。

圖1 膠體金的紫外-可見吸收光譜Fig.1 UV-VIS absorption spectrum of colloidal gold

圖2 Au NPs 的TEM 圖像Fig.2 TEM images of Au NPs

2.2 固體β-受體激動劑SERS 光譜

當目標物被吸附或者靠近金屬納米的表面時，拉曼信號強度會明顯放大[23]。3 種β-受體激動劑的標準品拉曼光譜如圖3 所示，從圖3 可以看出，原始光譜出現(xiàn)了漂移現(xiàn)象， 表明固體標準品粉末分散在硅片上進行檢測時易受到多種因素的干擾而出現(xiàn)漂移現(xiàn)象，會對后續(xù)建立定量分析方法造成誤差，故選用液相基質的檢測環(huán)境，以更好地實現(xiàn)定性定量檢測。

圖3 3 種β-受體激動劑固體拉曼光譜圖Fig.3 Solid Raman spectra of three beta-agonists

2.3 β-受體激動劑SERS 光譜分析

克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇都屬于傳統(tǒng)的瘦肉精[24]，這3 種β-受體激動劑在化學結構上具有一定的相似度， 在SERS 檢測中也存在相似的信號特征峰， 在強度上各有不同。 由于苯環(huán)上取代基不同，3 種β-受體激動劑有不同的SERS 特征峰?？藗愄亓_特征峰有382、787、1 260、1 478、1 602 cm-1等波段，382cm-1處的峰由苯環(huán)耦合C-C-Cl 彎曲振動引起，787 cm-1處的峰由C-Cl 伸縮振動引起，1 260 cm-1處的峰由C-N 伸縮引起，1 478 cm-1處的峰由-CH3彎曲振動引起，1 602 cm-1處的峰由苯環(huán)上C=C 拉伸。萊克多巴胺的特征峰有831、1 170、1 265、1 502、1 592 等波段，831 cm-1處的峰由苯環(huán)中C-H 非平面彎曲振動引起。 沙丁胺醇特征峰有621、814、1 253、1 489、1 609 cm-1等波段，621 cm-1處的峰由脂肪族的扭動引起，1 253 cm-1處的峰由C-C3伸縮振動、C-N 伸縮振動以及O-H 彎曲振動引起。由特征峰數(shù)據(jù)對比可得，β-受體激動劑結合膠體金的拉曼光譜與固體標準品粉末光譜曲線相比， 拉曼位置存在偏移，這可能是由于某些化學鍵的水解所致。而膠體金在400～2 500 cm-1范圍內(nèi)無明顯特征峰， 故不會影響目標物的檢測。 β-受體激動劑吸附于膠體金表面形成“熱點”，結合后產(chǎn)生表面增強現(xiàn)象。

拉曼光譜強度受膠體金與樣品體積比和活性劑濃度的影響。 首先， 對膠體金與樣品體積比進行優(yōu)化，實驗發(fā)現(xiàn)，3∶1 的體積比為最優(yōu)條件，此時各波段的拉曼強度最大，增強效果呈現(xiàn)先增后減的情況，這是因為隨著待測樣品體積的增加， 金納米顆粒會逐漸被稀釋，不利于“熱點”的形成。 另外，隨著總體積的增大，散射光會被納米球表面反射，穿透樣品后造成一定程度的丟失，致使拉曼光譜強度降低。

NaCl 可以改變金納米顆粒與待測物之間的電荷平衡，促進顆粒之間的聚集。 一定量的NaCl 溶液可以增強拉曼光譜信號，當濃度超過某一臨界點時，高濃度的NaCl 溶液會使金納米顆粒開始積聚沉淀，無法實現(xiàn)信號增強的效果。因此，金納米、待測樣品、NaCl 三者的體積比為3∶1∶1， 此時3 種β-受體激動劑的信號增強效果最好。

在最優(yōu)條件下， 配置了濃度為1～105ng/mL 的樣品標準溶液，均選用便攜式光譜儀進行檢測?？藗愄亓_不同濃度的拉曼光譜如圖4 可見， 峰強隨濃度降低而降低，以1 260 cm-1處特征峰峰面積（y）對應標準溶液濃度（x）繪制標準曲線，結果如圖5，標準曲線為y=0.014 28+0.390 21lgx，R2=0.994 65。

圖4 克倫特羅拉曼光譜圖Fig.4 Kraent Rohmann spectrogram

圖5 克倫特羅標準曲線Fig.5 Kraent standard curve

沙丁胺醇不同濃度的拉曼光譜如圖6 可見，峰強隨濃度降低而降低，以1 609 cm-1處特征峰峰面積（y）對應標準溶液濃度（x）繪制標準曲線，結果如圖7 所示， 標準曲線為y=0.005 99+0.009 681lgx，R2=0.991 46。

圖6 沙丁胺醇拉曼光譜圖Fig.6 Salbutamol Raman spectra

圖7 沙丁胺醇標準曲線Fig.7 Salbutamol standard curve

萊克多巴胺不同濃度的拉曼光譜如圖8 可見，以831 cm-1處特征峰峰面積（y）對應標準溶液濃度（x）繪制標準曲線，結果如圖9 所示，標準曲線為y=0.003 87+0.006 863 1lgx，R2=0.996 61。

圖8 萊克多巴胺拉曼光譜圖Fig.8 Ractopamine Raman spectra

圖9 萊克多巴胺標準曲線Fig.9 Ractopamine standard curve

2.4 豬肉中β-受體激動劑定量分析

豬肉作為一類復雜的食品類別，含有的蛋白質、脂肪多種成分易對拉曼信號造成嚴重影響，導致目標物分子與金溶膠無法完全結合，將目標物拉曼特征峰信號減弱或者掩蓋。 因此，樣品前處理是很關鍵的一步。我們分別制備了3 種β-受體激動劑的不同濃度（2、4、6、8、10 μg/g）豬肉樣品進行分析，經(jīng)過方法優(yōu)化，最終選用乙酸乙酯和10%碳酸鈉溶液作為萃取劑，以金溶膠為增強底物，1% NaCl 溶液為聚集物，采集SERS 光譜，計算回收率。乙酸乙酯可以去除豬肉組織中多余的脂肪，在較短的時間里，去除雜質，并且其本身具有揮發(fā)性，與金溶膠混合后，迅速揮發(fā)。 選取乙酸乙酯作為提取劑，對整個實驗結果不會造成影響和干擾。 以3 種β-受體激動劑在1 260 cm-1、1 609 cm-1、831 cm-1的峰進行定性定量， 計算各自的平均回收率，每個水平重復測量5 次。結果如表1 所示。 回收率均在80.3%～98.9%，RSD 在1.12%～3.26%，豬肉中克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇的檢出限為1 ng/mL。

表1 3 種β-受體激動劑檢出限、回收率和相對標準偏差（n=5）Table 1 Detection limits，recovery rates and relative standard deviations of three beta-agonists （n=5）

3 結論

本研究建立了一種基于表面增強拉曼光譜快速檢測豬肉中3 種β-受體激動劑殘留物的方法。該方法利用檸檬酸三鈉還原氯金酸制備膠體金顆粒，結合快速前處理技術，操作步驟簡單，分析速度快。在最優(yōu)條件下，建立了3 種β-受體激動劑殘留物特征峰拉曼強度與濃度（1～105ng/mL）的良好線性關系（R2值均在0.99 以上），開發(fā)了一種簡便、靈敏的快速檢測方法，可用于市場上精豬肉的快速篩查，對提升動物源性食品的風險監(jiān)測能力發(fā)揮支撐作用。