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        紅甜菜和糖甜菜塊根中萜類代謝物的比較分析

        2023-11-01 09:34:50趙雯雯劉乃新梁文召韓廣源
        中國糖料 2023年4期

        趙雯雯,劉乃新,梁文召,韓廣源

        (1.黑龍江大學現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學院,哈爾濱 150080;2.哈爾濱海關(guān)技術(shù)中心, 哈爾濱 150023)

        0 引言

        甜菜體內(nèi)含有豐富的營養(yǎng)成分,包含鉀、鎂、鐵等微量元素,以及甜菜果膠、皂苷、甜菜堿、黃酮、萜類[1]等物質(zhì)。同時,甜菜具有很好的藥用價值,具有抑菌、抗炎癥[2]、抗腫瘤[3]、抗心律失常、抗人類致病原體和植物致病原體,緩解疲勞、抑制脂質(zhì)氧化、清除氧自由基等[4]生物學功能。

        萜類也稱萜烯,是一類由2個以上異戊二烯單位構(gòu)成,頭尾連接或尾尾連接的化合物,是植物次生代謝產(chǎn)物的重要組成部分。萜類種類豐富,是天然產(chǎn)物的最大家族,屬于不含脂肪酸的不可皂化脂,很多具有重要生理活性。到目前為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了95 000多種結(jié)構(gòu)不同的萜類化合物。萜類具備抗炎[5]、抗菌[6]、防治關(guān)節(jié)炎[7]、增強抗氧化能力[8]、治療胰島素抵抗和2型糖尿病[9]、抗腫瘤[10]、體外和體內(nèi)抗錐蟲[11]等特性。此外,對于植物來說,萜類化合物常常在植物中作為防御機制,保護植物免受紫外線輻射、寄生蟲、真菌、細菌和病毒等有害因素的侵害,能響應多種生物脅迫和非生物脅迫,萜類物質(zhì)不僅可以作為防御物質(zhì),還可以協(xié)同有益微生物促進植物的生長與發(fā)育。因此無論從甜菜根中萜類成分的生物活性價值還是從甜菜抗逆性方面,研究甜菜根中萜類成分都具有一定的實際意義。

        目前,紅甜菜和糖甜菜根中的萜類成分的比較研究在我國尚未有報道。本研究采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry,UPLC-MS)技術(shù),結(jié)合代謝組學分析方法[12],以紅甜菜和糖甜菜根為研究材料,分析萜類化合物的種類和含量差異。為進一步開發(fā)具有萜類活性成分的甜菜種質(zhì)資源,培育甜菜新種質(zhì)提供理論基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 試驗材料

        選取紅甜菜(B.vulgarisvar.crucenta)和糖甜菜(B.vulgarisvar.Saccharifera)2種栽培型甜菜為試驗材料。紅甜菜品系‘一品紅’由哈爾濱工業(yè)大學食品科學與工程學院程大友教授提供;糖甜菜品系‘HD802’由黑龍江大學現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學院吳則東研究員提供。

        1.2 試劑與儀器

        試劑:甲醇、乙腈、甲酸,均為色譜純,甲醇、乙腈品牌為Merck,甲酸品牌為Aladdin。儀器:研磨儀(MM 400),德國Retsch公司;超高效液相色譜(1290 UHPLC),品牌Agilent;串聯(lián)色譜(Applied Biosystems 6500 QTRAP),美國AB Sciex公司;色譜柱(SB-C181.8 μm,2.1 mm×100 mm),品牌Agilent。

        1.3 試驗方法

        1.3.1 樣品采集和預處理

        選取同一大田,同一生長環(huán)境下的糖甜菜(‘HD802’)和紅甜菜(‘一品紅’)塊根作為試驗材料,為減小試驗誤差,每個栽培種選取6株長勢一致的甜菜根,處理備用。

        將甜菜塊根斜45°,取甜菜塊根1 cm直徑的圓柱體,置于凍干機進行真空冷凍干燥處理;再移至研磨儀30 Hz條件下研磨1.5 min,至粉末狀;萬分之一天平稱取50 mg凍干粉末,將其溶解于1.2 mL 70% 甲醇提取液中,每間隔30 min的時間渦旋1次,1次漩渦時間為30 s,共進行6次渦旋;然后將樣品放置于離心機中,轉(zhuǎn)速12 000 rpm離心3 min,取上清液,0.22 μm微孔濾膜過濾上清液,保存于進樣瓶中,用于UPLCMS/MS分析。

        1.3.2 色譜條件

        色譜柱:Agilent SB-C18(2.1 mm×100 mm,1.8 μm);流速0.35 mL/min;柱溫40 ℃;進樣量2 μL。流動相:A相為超純水(加入0.1%的甲酸),B相為乙腈(加入0.1%的甲酸),梯度洗脫見表3。

        表1 梯度洗脫Table 1 Gradient elution

        1.3.3 質(zhì)譜條件

        電噴霧離子源(electrospray ionization,ESI)溫度500 ℃,離子噴霧電壓(IS)5500 V(正離子模式)/-4500V(負離子模式),離子源氣體I(GSI)、氣體II(GSII)和氣簾氣(CUR)分別設(shè)置為50、60和25 psi,碰撞誘導電離參數(shù)設(shè)置為高。QQQ掃描使用MRM模式,并將氣體(氮氣)設(shè)置為中等。通過進一步去簇電壓(declustering potential,DP)和碰撞能(collision energy,CE)優(yōu)化,完成了各個MRM離子對的DP和CE。根據(jù)每個時期內(nèi)洗脫的代謝物,監(jiān)測一組特定的MRM離子對,以獲得檢測峰圖。

        1.3.4 萜類化合物分析

        利用軟件Analyst進行數(shù)據(jù)采集,基于MWDB(metware database)數(shù)據(jù)庫,根據(jù)混樣質(zhì)控樣本(quality control,QC)的總離子流圖及MRM代謝物檢測多峰圖,對樣品的代謝物進行質(zhì)譜定性分析。利用三重四極桿質(zhì)譜的多反應監(jiān)測模式完成萜類物質(zhì)定量分析,分析方法為:計算一級質(zhì)譜中的提取離子色譜峰的峰面積,對所有物質(zhì)質(zhì)譜峰進行峰面積積分,并對其中同一代謝物在不同樣本中的質(zhì)譜出峰進行積分校正,比較分析甜菜塊根萜類化合物的含量。

        1.4 數(shù)據(jù)分析

        使用Microsoft Office Excel 2016和SPSS 23.0(IBM Corporation,Armonk,NY,USA)及正交偏最小二乘法判別分析法(Orthogonal Partial Least Squares-Discriminant Analysis,OPLS-DA)進行統(tǒng)計分析。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 樣本質(zhì)控

        樣品經(jīng)HPLC-MS分析,鑒定出的萜類化合物的保留時間、m/z、MS/MS 碎片離子等信息。結(jié)果顯示代謝物檢測總離子流的曲線重疊性高,即保留時間和峰強度均一致,表明質(zhì)譜對同一樣品不同時間檢測時,信號穩(wěn)定性較好。儀器的高穩(wěn)定性為數(shù)據(jù)的重復性和可靠性提供了重要的保障。從總離子流圖中可看出峰的純度高,達到試驗數(shù)據(jù)后期的分析要求。正/負離子模式下的總離子流圖見圖1、圖2。

        圖1 混樣樣品質(zhì)譜分析總離子(正離子)流圖Fig.1 Totalion flow pattern analysis by mixed essence spectrum (positive)

        圖2 混樣樣品質(zhì)譜分析總離子(負離子)流圖Fig.2 Totalion flow pattern analysis by mixed essence spectrum (negative)

        2.2 正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)

        OPLS-DA分析結(jié)果顯示,2組甜菜樣本處于95%置信區(qū)間內(nèi),分別處于置信區(qū)間的左側(cè)和右側(cè)。紅甜菜的樣本點間距離更接近,整組的聚集程度要略強于糖甜菜樣本。本次分析共得到2個主成分。糖甜菜、紅甜菜分析結(jié)果:R2X=0.411,R2Y=0.972,Q2=0.828(圖3),Q2值處于0.5~1,說明OPLS-DA模型的預測好,不存在過擬合現(xiàn)象。由OPLS-DA得分可看出2種樣品代謝存在明顯種間代謝差異。

        圖3 糖甜菜(One-CK)與紅甜菜(Two-CK)對比的OPLS-DA模型分散點圖Fig.3 OPLS-DA model scatter point diagram for comparison of sugar beet (One-CK) and red beet (Two-CK)

        2.3 紅甜菜和糖甜菜塊根中萜類物質(zhì)分析

        紅甜菜和糖甜菜中共檢測出萜類物質(zhì)48種,分成6種類型(見表2)。13種倍半萜,種類占2種甜菜塊根中萜類物質(zhì)種類的27.08%;7種單萜,種類占2種甜菜塊根中萜類物質(zhì)種類的14.58%;13種二萜,種類占2種甜菜塊根中萜類物質(zhì)種類的27.08%;7種三萜,種類占2種甜菜塊根中萜類物質(zhì)種類的14.58%;7種三萜皂苷,種類占2種甜菜塊根中萜類物質(zhì)種類的14.58%;1種名為布盧門醇C的其他萜類物質(zhì)。

        表2 紅甜菜和糖甜菜塊根中萜類物質(zhì)相對含量分析Table 2 Analysis on the relative contents of terpenoids in roots of red beet and sugar beet

        2.4 紅甜菜和糖甜菜塊根中萜類物質(zhì)差異分析

        比較紅甜菜和糖甜菜塊根中萜類物質(zhì)的相對含量,結(jié)果表明:紅甜菜和糖甜菜差異代謝物共有6種。紅甜菜塊根中高于糖甜菜塊根的萜類成分有4種,包括去氫木香內(nèi)酯,30-去甲常春藤皂苷元、地膚子皂苷Ic和齊墩果酸-3-O-木糖基(1→3)葡萄糖醛酸苷。糖甜菜塊根的萜類成分中高于紅甜菜塊根有2種,分別是女貞苦苷和異雞蛋花素(見表3),其他沒有顯著性差異的萜類代謝物有42種(見圖4)。

        圖4 2組樣本差異代謝物比對火山圖Fig.4 Comparison of differential metabolites between two sample groups using a volcano plot

        表3 紅甜菜和糖甜菜塊根中萜類差異代謝物Table 3 Differential metabolites of terpenoids in roots of red beet and sugar beet

        3 討論

        紅甜菜主要作為一種蔬菜,在我國南方地區(qū)較為盛行。而糖甜菜主要作為制糖原料廣泛種植在我國的東北、西北和華北地區(qū)。從2種甜菜中共檢測出48個萜類物質(zhì),在這48個萜類成分中去氫木香內(nèi)酯、女貞苦苷、齊墩果酸、地膚子皂苷等萜類成分具有一定的生物活性和藥用價值。

        去氫木香內(nèi)酯是一種天然倍半萜化合物,具有抗氧化、抗炎[13-14]、抗菌[15]、抑制慢性髓系白血病[16]以及抑制喉癌[17]、膠質(zhì)瘤[18]等多種腫瘤細胞的增殖活性,誘導腫瘤細胞凋亡等功能。本研究結(jié)果表明,紅甜菜根中去氫木香內(nèi)酯的含量約是糖甜菜中含量的9.72倍。此外,去氫木香內(nèi)脂和木香烴內(nèi)酯作為木香主要的有效成分,具備調(diào)節(jié)消化系統(tǒng)作用[19],改善胃腸道功能[20]等生物活性。

        女貞苦苷是一種環(huán)烯醚萜類物質(zhì)。環(huán)烯醚萜類作為許多中藥的天然有效的生物活性成分,具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗原蟲、保護活性神經(jīng)、免疫調(diào)節(jié)、降血糖及保肝活性[21]。本研究中,糖甜菜塊根中女貞苦苷的含量是紅甜菜塊根中含量的2.28倍。

        齊墩果酸存在于多種植物,具有抗病毒、防骨質(zhì)疏松、治療銀屑病、修復潰瘍皮膚疤痕等功能[22],還能夠抗高血糖[23],改善脂肪肝病[24],延緩細胞衰老[25],促進骨折愈合[26],治療銀屑病[27],抗癲癇[28],增強果實抗病性[29]。本研究表明紅甜菜塊根中齊墩果酸的含量為糖甜菜塊根中含量的6.62倍。

        地膚子皂苷是一種天然三萜皂苷,能夠抗前列腺癌[30],保護胃損傷[31]。還可作為祛濕止癢顆??桂W、抗炎、抗過敏的主要有效成分[32-35]。天然植物地膚子乙醇提取物對羥基,DPPH和ABTS+自由基均有一定的清除能力[36]。本研究結(jié)果表明,紅甜菜塊根中地膚子皂苷的含量約是糖甜菜中含量的3.73倍。

        此外,已有研究表明萜類物質(zhì)可以在植物感染病原菌后被誘導并釋放出來,達到提高植物抗逆性的作用。在本研究中,從甜菜根中檢測出的48個萜類物質(zhì)是否對甜菜根抗病性有影響尚未有報道,因此可以作為新的研究課題進行深入研究。

        4 結(jié)論

        紅甜菜和糖甜菜共鑒定得到6類48種萜類代謝物。包括13種倍半萜,7種單萜,13種二萜,7種三萜,7種三萜皂苷以及布盧門醇C。紅甜菜和糖甜菜中的萜類差異代謝物有6種,紅甜菜塊根中相對含量高的成分是去氫木香內(nèi)酯、30-去甲常春藤皂苷元、地膚子皂苷Ic和齊墩果酸-3-O-木糖基(1→3)葡萄糖醛酸苷,糖甜菜塊根中相對含量較高的成分是女貞苦苷和異雞蛋花素。明確不同甜菜根中萜類代謝物的差異,可以為新藥物研發(fā)以及培育具有特殊活性成分的新甜菜品種提供研究基礎(chǔ),萜類成分的植物防御功能有待進一步研究。

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