閆麗，王愷悅，王喜良，于月新

（北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，沈陽 110016）

卵巢早衰 （premature ovarian failure，POF） 是指女性40歲前出現(xiàn)卵巢功能減退，出現(xiàn)閉經(jīng)、促性腺激素過高和雌激素缺乏現(xiàn)象，是一種常見的婦科內(nèi)分泌疾病，嚴(yán)重影響患者身體健康［1］。POF的誘發(fā)因素主要有遺傳、免疫、醫(yī)源性、環(huán)境、心理等因素［2］。目前，激素替代療法是治療POF的最常用方法，通過服用激素模擬人體激素分泌，可以改善POF癥狀［3］。近年來研究［4］發(fā)現(xiàn)，腸道菌群與多種疾病密切相關(guān)，如精神分裂癥、帕金森病、肥胖和代謝性疾病等。其中，腸道菌群與生殖系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。動物研究［5］結(jié)果顯示，高脂飼料喂養(yǎng)的成年雄性小鼠中，腸道菌群影響精液微生物群的產(chǎn)生，進(jìn)而影響精液的質(zhì)量。在多囊卵巢綜合征患者中，腸道菌群組成紊亂，藥物治療后腸道菌群的多樣性和豐度明顯改善［6］。但是，腸道菌群與POF的相關(guān)性尚未見研究報道。

本課題組前期研究建立了POF小鼠模型，并分析了其腸道菌群的變化，結(jié)果顯示，POF小鼠腸道菌群組成的多樣性及個別種屬菌群的豐度發(fā)生顯著改變。為進(jìn)一步探究腸道菌群與POF的相關(guān)性，本研究采用最常用的激素替代療法 （戊酸雌二醇片/雌二醇環(huán)丙孕酮片） 對POF小鼠模型進(jìn)行干預(yù)，分析腸道差異菌群，探究此治療方案對腸道菌群紊亂的回調(diào)作用，旨在從腸道微生態(tài)層面探究戊酸雌二醇片/雌二醇環(huán)丙孕酮片的作用機(jī)制，為臨床探討POF的發(fā)病機(jī)制和藥物治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：SPF級雌性C57BL/6小鼠24只，8周齡，由遼寧長生生物公司提供［SCXK （遼） 2020-0001］。保持室溫在20～24 ℃，飼養(yǎng)于北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院實驗動物部［SYXK （遼） 2018-0021］，給予全價營養(yǎng)飼料，自由飲水和進(jìn)食。

1.1.2 主要試劑和設(shè)備：戊酸雌二醇片/雌二醇環(huán)丙孕酮片 （拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司），環(huán)磷酰胺 （德國Baxter Oncology GmbH公司），水合氯醛（北納生物有限公司），雌二醇酶聯(lián)免疫檢測試劑盒、促卵泡生成素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒 （上海江萊生物），BY-600A型離心機(jī) （北京白洋醫(yī)療器械有限公司），BX51顯微鏡 （日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 POF小鼠模型的建立和分組：將C57BL/6雌鼠隨機(jī)分為對照組、模型組和治療組，每組8只。對照組不作任何處理。模型組和治療組建立POF模型，小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺 （50 mg·kg-1·d-1） ，連續(xù)注射15 d。卵泡刺激素 （follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH） 升高，雌二醇 （estradiol，E2） 水平降低，各級卵泡顯著減少，表明POF模型構(gòu)建成功。造模結(jié)束7 d后，治療組小鼠給予戊醇雌二醇片/雌二醇環(huán)丙孕酮片灌胃處理，5 d為1個周期，共3個周期。將戊酸雌二醇片/雌二醇環(huán)丙孕酮片溶于ddH2O，灌胃第1～2天，給予戊酸雌二醇0.13 mg·kg-1·d-1，第3～4天，給予戊酸雌二醇0.13 mg·kg-1·d-1，雌二醇環(huán)丙孕酮0.065 mg·kg-1·d-1，第5天不做處理。

1.2.2 小鼠一般狀況觀察：造模和治療過程中，觀察小鼠精神狀態(tài)、活動情況、毛發(fā)光澤度和進(jìn)食情況，記錄體質(zhì)量變化。

1.2.3 動物取材和處理：小鼠10%水合氯醛腹腔注射進(jìn)行麻醉，摘眼球采血。小鼠處死后，取雙側(cè)卵巢置于中性福爾馬林中固定。取小鼠結(jié)腸端糞便，保存于無菌凍存管，-80 ℃保存。

1.2.4 血清激素水平檢測：采用ELISA法檢測血清FSH、E2的水平，按照試劑盒說明書操作。

1.2.5 卵巢形態(tài)學(xué)觀察：小鼠卵巢經(jīng)固定后進(jìn)行石蠟包埋，切成5 μm的切片，HE染色后觀察卵巢形態(tài)，統(tǒng)計各級卵泡數(shù)量。

1.2.6 腸道菌群多樣性分析：每組隨機(jī)選取5個糞便樣本送至上海偉寰生物公司進(jìn)行腸道菌群多樣性檢測。提取樣本總DNA，對細(xì)菌16S rRNA基因的V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列：341F，5’-ATGCGTAGCCGACCTGAGA-3’；805R，5’-CGTC AGACTTTCGTCCATTGC-3’。構(gòu)建Miseq文庫，應(yīng)用Illumina NovaSeq PE250平臺進(jìn)行高通量測序，得到序列信息，處理后形成擴(kuò)增子序列變異 （amplicon sequence variant，ASV），對其進(jìn)行聚類、注釋和一系列綜合性分析，其中厚壁菌門與擬桿菌門的相對豐度含量比值 （F/B） 是一個能反映機(jī)體健康或炎癥狀態(tài)的指標(biāo)，F(xiàn)/B越低，機(jī)體越健康，F(xiàn)/B越高，炎癥反應(yīng)越嚴(yán)重。

1.2.6.1 α多樣性分析 使用Shannon指數(shù)反映樣本的微生物α多樣性。Shannon指數(shù)越大，樣本中微生物種類越豐富，多樣性水平越高。

1.2.6.2 β多樣性分析 β多樣性主要反映組間差異，使用ANOSIM分析檢驗組間差異是否顯著大于組內(nèi)差異，采用主坐標(biāo) （principal co-ordinates analysis，PCoA） 分析、非度量多維尺度法 （non-metric multidimensional scaling，NMDS） 分析反映微生物群落的相似性。每個點代表1個樣本，相同顏色為1組，點之間的距離越近，相似度越高。

表1 小鼠體質(zhì)量的比較Tab.1 Comparison of body mass in mice

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料用表示，采用t檢驗進(jìn)行比較。P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般情況比較

對照組小鼠精神狀態(tài)好，毛發(fā)光滑，反應(yīng)靈敏。模型組小鼠精神萎靡，活動性差，出現(xiàn)一定程度的脫毛，身形消瘦。治療組小鼠進(jìn)食量增加，毛發(fā)稍有光澤，反應(yīng)較為敏捷，體質(zhì)量較模型組增加。

2.2 小鼠體質(zhì)量比較

實驗前 （Day 0），3組小鼠比較，體質(zhì)量無統(tǒng)計學(xué)差異 （P> 0.05）。腹腔注射環(huán)磷酰胺15 d后 （Day 15），與對照組比較，模型組和治療組小鼠體質(zhì)量明顯降低 （P< 0.05）。經(jīng)戊酸雌二醇片/雌二醇環(huán)丙孕酮片灌胃治療15 d 后 （Day 37），與對照組比較，模型組小鼠體質(zhì)量明顯降低 （P< 0.05）；與模型組比較，治療組小鼠體質(zhì)量明顯升高 （P< 0.05）。見表1。

2.3 小鼠血清激素水平比較

與對照組比較，模型組FSH水平明顯升高，E2水平明顯降低 （P< 0.05）；與模型組比較，治療組FSH水平明顯降低，E2水平明顯升高 （P< 0.05）。見表2。

表2 小鼠血清激素水平和卵泡數(shù)量的比較Tab.2 Comparison of serum hormone levels and follicle number in mice

2.4 小鼠卵巢卵泡數(shù)量比較

與對照組比較，模型組小鼠卵巢發(fā)育卵泡、成熟卵泡明顯減少，閉鎖卵泡明顯增加 （P< 0.05）；與模型組比較，治療組發(fā)育卵泡明顯增加，閉鎖卵泡明顯減少 （P< 0.05），成熟卵泡數(shù)量無明顯變化 （P>0.05）。見表2。

2.5 各組小鼠腸道菌群多樣性比較

2.5.1 腸道菌群測序分析：對每組小鼠的5個糞便樣本進(jìn)行16S rRNA測序，得到ASV信息。共獲得1 040個ASV，其中對照組555個，特有的ASV 212個；模型組455個，特有的ASV 181個；治療組611個，特有的ASV 240個。3組共有的ASV 176個。見圖1。

圖1 小鼠腸道菌群ASV韋恩圖Fig.1 Venn diagram of ASV of the intestinal flora in mice

2.5.2 α多樣性分析：本研究中，各樣本的Goodscoverage指數(shù)接近于1，表明測序深度已基本覆蓋到樣本所有的物種 （圖2A）。隨著樣本序列數(shù)的增加，曲線逐漸趨于平坦，表明測序數(shù)據(jù)量足夠反映樣本中絕大部分的序列信息，結(jié)果可信度高 （圖2B）。對照組、模型組、治療組的Shannon指數(shù)分別為4.60±0.232、5.60±0.426、5.78±0.381。結(jié)果表明，與對照組比較，模型組和治療組小鼠腸道中微生物種類多樣性增加 （P< 0.05）。

圖2 小鼠腸道菌群的α多樣性分析Fig.2 α diversity analysis of intestinal flora in mice

2.5.3 β多樣性分析：ANOSIM分析結(jié)果為R= 0.671，P= 0.001，表明3組間物種豐富度有顯著差異 （圖3A）。腸道菌群PCoA分析和NMDS分析反映組間微生物群落的差異程度。結(jié)果顯示，對照組與模型組菌群明顯分開，表明2組菌群結(jié)構(gòu)有顯著差異；治療組位于2組之間，表明戊酸雌二醇片/雌二醇環(huán)丙孕酮片灌胃治療對小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)差異有回調(diào)作用 （圖3B、3C、3D）。

圖3 小鼠腸道菌群的β多樣性分析Fig.3 β diversity analysis of intestinal flora in mice

2.5.4 物種組成豐度分析：采用柱形累加圖 （圖4）表示3組小鼠糞便中的腸道菌群在不同分類水平上物種的相對豐度。與對照組比較，模型組F/B明顯升高，Muribaculaceae豐度明顯降低，Lachnospiraceae、Alistipes豐度明顯升高 （均P< 0.05）；與模型組比較，治療組F/B明顯降低，Muribaculaceae豐度明顯升高，Lachnospiraceae、Alistipes豐度明顯降低 （均P<0.05）。見表3。

圖4 小鼠腸道菌群的相對豐度Fig.4 Relative abundance of intestinal flora in mice

表3 小鼠腸道菌群豐度比較Tab.3 Comparison of abundance of intestinal flora in mice

3 討論

腸道菌群與人類健康密切相關(guān)，是腸道的重要組成部分，在多種疾病的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色，或可作為綜合防治策略之一。本研究建立環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的POF模型，并給予戊酸雌二醇片/雌二醇環(huán)丙孕酮片治療，探究其對小鼠激素水平和腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，通過分析腸道菌群的變化，從腸道菌群的角度為治療POF提供科學(xué)依據(jù)。

卵巢內(nèi)分泌水平能夠間接反映卵巢功能。通過下丘腦-垂體-性腺軸調(diào)控各種激素的分泌，下丘腦通過分泌促性腺激素釋放激素 （gonadotropin releasing hormone，GnRH） 作用于垂體；垂體釋放FSH，正反饋作用于卵巢，刺激分泌E2；E2過高時會通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)GnRH和FSH的水平，維持機(jī)體激素的動態(tài)平衡［7］。E2和FSH 可作為評價卵巢功能的重要指標(biāo)。E2是成熟卵泡分泌的一種雌激素，能夠促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖、分化，調(diào)控顆粒細(xì)胞的凋亡，調(diào)節(jié)類固醇激素水平。FSH主要起到促進(jìn)卵泡顆粒細(xì)胞分化成熟、控制卵泡發(fā)育的作用，F(xiàn)SH激素水平較高時，會造成卵泡早熟和提前排出，導(dǎo)致卵泡衰竭。當(dāng)E2分泌水平過低且FSH分泌水平過高時，可初步評估卵巢的儲備功能，對判斷POF有重要作用［8］。本研究中，與對照組比較，模型組小鼠血清E2水平顯著降低，F(xiàn)SH水平顯著升高，體質(zhì)量降低，卵巢中發(fā)育卵泡、成熟卵泡減少，閉鎖卵泡增加，表明環(huán)磷酰胺會對下丘腦-垂體-性腺軸產(chǎn)生干擾，影響小鼠生長和發(fā)育，降低卵巢儲備功能。與模型組比較，治療組E2水平顯著升高，F(xiàn)SH水平顯著降低，體質(zhì)量增加，發(fā)育卵泡增加，閉鎖卵泡減少，表明戊酸雌二醇片/雌二醇環(huán)丙孕酮片能夠改善小鼠的激素紊亂和卵巢功能衰退。

血液中激素水平也與腸道菌群有關(guān)，菌群組成紊亂影響小鼠的腸肝循環(huán)，使代謝產(chǎn)物β-葡萄糖醛酸酶影響結(jié)合雌激素與游離雌激素二者的轉(zhuǎn)換過程，從而影響血清中雌激素的水平［9］。腸道菌群一般處于動態(tài)平衡中，與宿主相互作用，通過調(diào)節(jié)糖、脂質(zhì)和氨基酸等物質(zhì)的代謝，影響疾病的發(fā)生、發(fā)展，菌群失調(diào)將會導(dǎo)致相關(guān)疾病的發(fā)生，如腸炎、阿爾茨海默病、肥胖等［10-11］。本研究采用16S rRNA測序技術(shù)分析小鼠腸道菌群的變化，與模型組相比，治療組F/B降低，表明小鼠腸道炎癥反應(yīng)有所緩解。與模型組比較，治療組優(yōu)勢菌群Muribaculaceae的豐度恢復(fù)。Muribaculaceae作為有益菌，與纖維降解有關(guān)，可產(chǎn)生琥珀酸、乙酸和丙酸，與維持腸道穩(wěn)態(tài)和改善炎癥性疾病有關(guān)［12］。與模型組比較，治療組Lachnospiraceae的豐度降低。Lachnospiraceae與代謝紊亂、糖尿病的發(fā)生有關(guān)，其豐度與葡萄糖或脂代謝呈正相關(guān)，豐度越高，炎癥反應(yīng)越嚴(yán)重［13］。以上結(jié)果表明，戊酸雌二醇片/雌二醇環(huán)丙孕酮片能夠改善POF小鼠腸道的炎癥反應(yīng)，在維持腸道穩(wěn)態(tài)上發(fā)揮重要作用。與模型組比較，治療組Alistipes豐度降低。在致病性方面，Alistipes與抑郁癥、焦慮癥、結(jié)腸癌有關(guān)，Alistipes的增加可能通過破壞腸-腦軸來減少血清素的可利用性，引發(fā)抑郁癥［14］。本研究中，模型組小鼠精神萎靡可能與該菌群豐度增加有關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，戊酸雌二醇片/雌二醇環(huán)丙孕酮片能夠緩解小鼠的激素紊亂和卵巢功能衰退，減輕POF小鼠的腸道炎癥反應(yīng)，改變腸道黏膜的通透性，增加有益菌Muribaculaceae的豐度，減少有害菌Lachnospiraceae、Alistipes的定植，對小鼠腸道菌群紊亂有一定的改善作用。本研究從腸道微生態(tài)層面上探究了戊酸雌二醇片/雌二醇環(huán)丙孕酮片治療POF的作用機(jī)制，為臨床探討POF的發(fā)病機(jī)制和藥物治療提供了理論依據(jù)。