馬俊杰，安韶光，梅靜宇，張磊，張浩軒，陸進(jìn)

（蚌埠醫(yī)學(xué)院 1. 臨床醫(yī)學(xué)院2020級(jí)； 2. 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院2019級(jí)； 3. 第二附屬醫(yī)院腫瘤外科； 4. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，安徽 蚌埠 233030）

腎細(xì)胞癌 （renal cell carcinoma，RCC） 是泌尿生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，占成人腎臟腫瘤的85% 以上［1］。2020年RCC新發(fā)病例達(dá)43萬(wàn)，死亡患者約18萬(wàn)例［2］。腎透明細(xì)胞癌 （kidney renal clear cell carcinoma，KIRC） 是RCC的主要組織學(xué)亞型，約占80%［3］。目前，對(duì)于早期KIRC患者，手術(shù)切除仍然是主要和最有效的治療方法，但發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的KIRC患者手術(shù)和放化療效果不明顯，5年生存率<10%，且復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)較高［4］。因此，挖掘KIRC的新型生物標(biāo)志物對(duì)于患者的診斷與治療具有積極作用。

拓?fù)洚悩?gòu)酶 Ⅱα （topoisomerase Ⅱα，TOP2A） 屬于DNA 解鏈因子，在細(xì)胞增殖、DNA 復(fù)制以及染色體濃縮和分離等多種生物學(xué)過(guò)程 （biological process，BP） 中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其表達(dá)具有明顯的細(xì)胞周期依賴性［5］。TOP2A表達(dá)或結(jié)構(gòu)異常時(shí)可導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定以及腫瘤的發(fā)生，如在卵巢癌和肺癌中TOP2A表達(dá)異常導(dǎo)致患者不良預(yù)后［6-7］，但其在KIRC中的作用目前仍待商榷。因此，本研究旨在通過(guò)生物信息學(xué)方法分析TOP2A在KIRC中的表達(dá)、預(yù)后和免疫學(xué)等有關(guān)分子機(jī)制，為KIRC的診斷和治療探索新的生物分子標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

KIRC單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)來(lái)自基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù) （Gene Expression Omnibus，GEO） GSE111360隊(duì)列的GSM3029087 （p87）、GSM3029088 （p88） 和GSM 3029091 （p91） 3個(gè)樣本，根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)過(guò)濾樣本中的細(xì)胞和基因：（1） 基因表達(dá)量200～50 000；（2） 線粒體基因百分比<15%；（3） 表達(dá)基因數(shù)量200～5 000；（4） ≥3個(gè)細(xì)胞中表達(dá)的基因。其余分析所使用的數(shù)據(jù)均為各數(shù)據(jù)庫(kù)默認(rèn)來(lái)源。

1.2 TOP2A差異表達(dá)與預(yù)后分析

TOP2A基因差異表達(dá)、臨床分期及總生存期（overall survival，OS） 的Kaplan-Meier （K-M） 曲線通過(guò)GEPIA （http：//gepia.cancer-pku.cn/） 在線工具分析；TOP2A在正常腎組織和KIRC組織中的免疫組化結(jié)果應(yīng)用HPA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行獲取。

1.3 TOP2A單細(xì)胞分析

單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)通過(guò)R包“Seurat”進(jìn)行分析，首先通過(guò)NormalizeData函數(shù)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，再通過(guò)FindIntegrationAnchors函數(shù)對(duì)3個(gè)患者樣本識(shí)別錨點(diǎn)進(jìn)行整合，然后通過(guò)RunPCA函數(shù)計(jì)算數(shù)據(jù)的主成分，選取前20個(gè)主成分通過(guò)K-最鄰近分布進(jìn)行聚類分析，細(xì)胞類型根據(jù)標(biāo)記基因通過(guò)CellMarker數(shù)據(jù)庫(kù) （http：//bio-bigdata.hrbmu.edu.cn/CellMarker/） 和文獻(xiàn)收集進(jìn)行注釋。

1.4 TOP2A免疫分析

TOP2A基因表達(dá)與KIRC免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平之間的相關(guān)性通過(guò)TIMER2.0 （http：//timer.cistrome.org/）分析；利用Sangerbox探究TOP2A基因表達(dá)與免疫和基質(zhì)評(píng)分的關(guān)系，利用GEPIA2021的EPIC算法分析CD8+T細(xì)胞 （cut-off=80%）、CD4+T細(xì)胞 （cut-off=60%）、B細(xì)胞 （cut-off=84%）、NK細(xì)胞 （cut-off=85%）、巨噬細(xì)胞 （cut-off=70%） 和調(diào)節(jié)T （Tregs） 細(xì)胞 （cut-off=50%）的浸潤(rùn)水平與KIRC患者OS的關(guān)系。

1.5 TOP2A列線圖

將TOP2A基因和患者的臨床特征納入Aclbi進(jìn)行單因素Cox回歸分析，將P< 0.05的因素納入模型進(jìn)行列線圖的構(gòu)建，并通過(guò)校準(zhǔn)曲線和受試者操作特征 （receiver operating characteristic，ROC） 曲線下面積 （area under the curve，AUC） 進(jìn)行驗(yàn)證。

1.6 TOP2A相關(guān)基因篩選

通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)檢索TOP2A基因的200個(gè)相關(guān)表達(dá)基因。然后，通過(guò)GEPIA2.0篩選 TCGA-KIRC數(shù)據(jù)集中表達(dá)上調(diào)的基因 （logFC≥1且q<0.05） 和TOP2A相關(guān)基因，共得到586個(gè)表達(dá)上調(diào)基因 （以q值由小到大排序） 和1 000個(gè)TOP2A相關(guān)基因 （按相關(guān)性由大到小排序）；最后，各取前200個(gè)基因進(jìn)行韋恩圖繪制，得到11個(gè)與TOP2A相關(guān)的基因。

1.7 TOP2A相關(guān)基因富集分析

將獲得的TOP2A及相關(guān)基因?qū)階clbi分析其相關(guān)性；然后，通過(guò) Sangerbox探究TOP2A及相關(guān)基因的基因本體論 （Gene Ontology，GO） 和京都基因與基因組數(shù)據(jù)庫(kù) （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG） 通路富集；最后，通過(guò)Sangerbox以KEGG通路基因集為參考，根據(jù)TOP2A基因表達(dá)中位值分為高、低表達(dá)組，對(duì)不同表達(dá)組進(jìn)行基因集富集分析 （gene set enrichment analysis，GSEA）。

1.8 TOP2A相關(guān)基因預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型構(gòu)建

將TOP2A及相關(guān)基因?qū)階clbi在線分析工具進(jìn)行LASSO回歸分析，將篩選出的基因進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分 （風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=基因表達(dá)量×系數(shù)） 計(jì)算，根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的中位值將患者分為高、低風(fēng)險(xiǎn)組進(jìn)行下游分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

單細(xì)胞數(shù)據(jù)通過(guò)R4.2.1軟件進(jìn)行分析，其余分析為各數(shù)據(jù)庫(kù)默認(rèn)軟件。采用單向方差分析檢驗(yàn)TOP2A基因在KIRC和正常組織差異表達(dá)，不同腫瘤分期表達(dá)采用F檢驗(yàn)比較差異，免疫細(xì)胞和上皮細(xì)胞差異表達(dá)采用Wilcoxon檢驗(yàn)，采用K-M法和logrank檢測(cè)進(jìn)行生存分析，采用Spearman相關(guān)性分析基因表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的水平相關(guān)性；P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TOP2A差異表達(dá)

TOP2A在KIRC組織中表達(dá)上調(diào)，且TOP2A基因的表達(dá)水平隨患者臨床分期的增高而增加 （P<0.05，圖1A、1B）。TOP2A基因的高表達(dá)水平不利于患者的OS （圖1C）；GSEA分析結(jié)果顯示，高表達(dá)的TOP2A主要富集在細(xì)胞周期、不匹配修復(fù)和孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟等與細(xì)胞增殖相關(guān)通路 （圖1D）。同樣，HPA數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果顯示，TOP2A在腎癌組織中的蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào) （圖1E）。

圖1 TOP2A差異表達(dá)、預(yù)后和GSEA分析Fig.1 TOP2A differential expression，prognosis and GSEA analysis

2.2 TOP2A基因單細(xì)胞表達(dá)分析

根據(jù)各聚類的標(biāo)記基因可將各細(xì)胞分為上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞2種類型 （圖2A、2B），且TOP2A基因在免疫細(xì)胞中的表達(dá)量高于上皮細(xì)胞 （圖2C）。

由于TOP2A基因主要在免疫細(xì)胞中表達(dá)，進(jìn)一步對(duì)免疫細(xì)胞亞型進(jìn)行聚類。根據(jù)各亞型的標(biāo)記基因，共得到6種細(xì)胞類型 NK細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、常規(guī)T細(xì)胞、Tregs、B細(xì)胞和肥大細(xì)胞 （圖2D、2E）。TOP2A在多種免疫細(xì)胞中均有表達(dá) （圖2F）。

2.3 TOP2A免疫相關(guān)分析

TIMER2.0數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)TOP2A基因表達(dá)與各免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，TOP2A與大多數(shù)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)呈正相關(guān) （圖3A）。GEPIA2021數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果顯示，CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞的高浸潤(rùn)水平與KIRC患者較好的預(yù)后相關(guān)，而B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞及Tregs細(xì)胞在KIRC高浸潤(rùn)水平均為KIRC患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素 （圖3B）。

圖3 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平與TOP2A基因表達(dá)及患者預(yù)后的關(guān)系Fig.3 Relationship between immune cell infiltration level and TOP2A gene expression and patient prognosis

2.4 TOP2A預(yù)后列線圖

將TOP2A及患者的臨床特征納入單因素Cox回歸分析，結(jié)果顯示，TOP2A基因可做為KIRC患者預(yù)后影響因素 （圖4A），TOP2A基因及患者臨床特征所構(gòu)建的列線圖可預(yù)測(cè)KIRC患者的1、3和5年的生存狀況，且隨著列線圖得分的增高，患者的生存率降低 （圖4B）。校準(zhǔn)曲線顯示其具有較好的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性 （圖4C），且1年AUC 為0.86、3年AUC為0.80、5年AUC為0.75，表明列線圖可良好地預(yù)測(cè)患者的生存狀況 （圖4D）。

2.5 TOP2A相關(guān)基因分析

TOP2A基因的相關(guān)基因進(jìn)行韋恩圖分析，共篩選出12個(gè)基因，且TOP2A基因及其相關(guān)基因的相關(guān)性較高 （圖5A）。對(duì)包括TOP2A在內(nèi)的12個(gè)基因進(jìn)行GO功能注釋和KEGG富集分析，結(jié)果顯示，其KEGG通路主要富集在細(xì)胞周期、p53信號(hào)通路和細(xì)胞衰老等 （圖5B）；分子功能 （molecular function，MF） 主要包括腺苷酸結(jié)合、蛋白激酶活性和微管結(jié)合等；細(xì)胞構(gòu)成 （cellular component，CC） 主要包括微管細(xì)胞骨架、染色體和微管組織中心等；BP主要包括細(xì)胞周期相變的調(diào)節(jié)、微管細(xì)胞骨架組織和細(xì)胞器調(diào)節(jié)等 （圖5C）。

圖5 TOP2A及其相關(guān)基因的富集分析Fig.5 Enrichment analysis of TOP2A and its related genes

2.6 TOP2A及其相關(guān)基因的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型

將TOP2A及其相關(guān)基因?qū)隠ASSO回歸模型進(jìn)行10倍交叉驗(yàn)證，得到最小λ值為0.013 8，篩選出包括TOP2A在內(nèi)的 9個(gè)特征基因，再根據(jù)基因表達(dá)量及相關(guān)系數(shù)構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分 （圖6A）。根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分中位值將患者分為高、低風(fēng)險(xiǎn)組，結(jié)果顯示，隨著風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的增高患者的死亡率增高 （圖6B），與低風(fēng)險(xiǎn)組相比，高風(fēng)險(xiǎn)組的OS顯著縮短 （圖6C）。且該模型預(yù)測(cè)患者OS ROC的AUC值1年為0.685、3年為0.655以及5年為0.659，具有較好的預(yù)測(cè)能力 （圖6D）。

3 討論

KIRC是目前腎臟惡性腫瘤中最常見的組織學(xué)亞型，由于腫瘤的高度異質(zhì)性，KIRC在不同患者中呈現(xiàn)多樣化的臨床表現(xiàn)，且晚期患者對(duì)于常見的化療藥物敏感性不高［8-9］。因此，迫切需要新的分子標(biāo)志物評(píng)估患者臨床的治療和預(yù)后。目前，TOP2A已被證實(shí)與多種惡性腫瘤的進(jìn)展和不良預(yù)后有關(guān)［10-11］。但其在KIRC中的相關(guān)研究甚少。

TOP2A基因在KIRC組織中的表達(dá)顯著上調(diào)，并且與患者的不良預(yù)后和臨床分期增高有關(guān)。此外，高表達(dá)的TOP2A主要富集在細(xì)胞周期和錯(cuò)配修復(fù)等過(guò)程，SMITH等［12］研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞由靜止期進(jìn)入細(xì)胞周期時(shí)，TOP2A的合成激活促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，這可能是其促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的原因之一。差異分析和富集分析結(jié)果顯示，TOP2A的表達(dá)可能與KIRC的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。

對(duì)KIRC患者的單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，TOP2A基因在多種免疫細(xì)胞中表達(dá)，且與多種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平呈正相關(guān)，與XU等［13］在腎乳頭狀細(xì)胞癌中的研究結(jié)果一致。不同的是在KIRC中，各免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)水平長(zhǎng)期增高反而不利于患者的預(yù)后。研究［14］顯示，正常人體中CD4/CD8細(xì)胞比例處于特定的范圍，二者的比例失調(diào)可導(dǎo)致機(jī)體免疫功能的異常。此外，巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞也可能由于其在腫瘤中被誘導(dǎo)產(chǎn)生不同分化表型導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖或腫瘤免疫逃避的產(chǎn)生［15-16］。TOP2A的表達(dá)不僅有利于KIRC的發(fā)生與轉(zhuǎn)移，還可激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)。腫瘤微環(huán)境是由腫瘤細(xì)胞與腫瘤間質(zhì)細(xì)胞、免疫細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、血管組織和信號(hào)分子等相互作用形成的動(dòng)態(tài)系統(tǒng)，各成分的相對(duì)比例改變也可能導(dǎo)致腫瘤侵襲性增高及患者的不良預(yù)后［17-18］，這可能是TOP2A基因誘導(dǎo)KIRC患者不良預(yù)后的原因之一。

總之，本研究基于生物信息學(xué)方法探究了TOP2A基因在KIRC的表達(dá)和免疫浸潤(rùn)等有關(guān)分子機(jī)制，建立了預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型，并應(yīng)用列線圖預(yù)測(cè)了TOP2A基因在KIRC中的有關(guān)預(yù)后作用，表明TOP2A可作為KIRC的預(yù)后分子標(biāo)志物，對(duì)臨床治療和預(yù)后提供參考。本研究還需要相關(guān)的基礎(chǔ)和臨床實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，以便更加準(zhǔn)確地探究有關(guān)分子機(jī)制及預(yù)后意義。