郝延芝，焦元清，劉章銘，馬惠榮，4，杜惠蘭，4，馬玉聰，4，宋翠淼，4

（河北中醫(yī)藥大學(xué) 1. 中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院中西醫(yī)婦產(chǎn)科學(xué)教研室； 2. 第一附屬醫(yī)院宣傳部； 3. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室； 4. 河北省中西醫(yī)結(jié)合生殖疾病協(xié)同創(chuàng)新中心，石家莊 050200）

超促排卵是體外受精-胚胎移植 （in vitrofertilization-embryo transfer，IVF-ET） 的重要組成部分。盡管可獲取更多的卵母細(xì)胞，但超促排卵可能對(duì)子宮內(nèi)膜容受性產(chǎn)生負(fù)面影響，是制約IVF-ET成功的關(guān)鍵［1］。免疫反應(yīng)是子宮容受性的重要中介，免疫細(xì)胞［主要是子宮自然殺傷 （uterine natural killer，uNK）細(xì)胞］對(duì)于子宮內(nèi)膜容受性、胚胎發(fā)育和植入至關(guān)重要［2］。胎盤(pán)蛋白14 （placenta protein 14，PP14） 被認(rèn)為是子宮內(nèi)膜容受性的重要標(biāo)志物，參與母胎界面復(fù)雜的免疫調(diào)節(jié)過(guò)程［3］。如何改善超促排卵對(duì)子宮內(nèi)膜容受性的負(fù)面影響、提高IVF-ET植入成功率是目前的研究熱點(diǎn)。中醫(yī)認(rèn)為，腎藏精，主生殖，腎在胞宮蓄經(jīng)、育胎中具有重要的調(diào)節(jié)作用。本課題組前期研究［4-5］發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎法可提高不孕癥患者IVFET臨床妊娠率，改善超促排卵小鼠胚胎著床。為了更好地治療不孕癥，提高IVF-ET植入成功率，明確補(bǔ)腎法在超促排卵中對(duì)子宮內(nèi)膜的作用至關(guān)重要。本研究以補(bǔ)腎助孕方為補(bǔ)腎法的代表方，通過(guò)建立超促排卵小鼠模型，從著床窗口 （window of implantation，WOI） 子宮內(nèi)膜組織形態(tài)、uNK細(xì)胞、PP14及血清雌二醇 （estradiol，E2）、孕酮 （progesterone，P） 和外周血CD4+T、CD8+T細(xì)胞方面，探討補(bǔ)腎助孕方改善胚胎著床的免疫機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雌性昆明小鼠80只 （清潔級(jí)），8周齡，體質(zhì)量 （25±5） g；成年雄性昆明小鼠45只 （清潔級(jí)），體質(zhì)量 （30±5） g。由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK （冀） 2013-1-003。本研究已通過(guò)河北中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)審核 （DWLL2016031）。

1.1.2 藥物：補(bǔ)腎助孕方［5］（熟地黃20 g，當(dāng)歸10 g，山藥15 g，山萸肉12 g，淫羊藿10 g，枸杞子12 g，黃芪15 g，紫石英先煎15 g，菟絲子12 g，白芍9 g，丹參10 g，香附6 g等） 購(gòu)自石家莊樂(lè)仁堂藥房，常規(guī)水煎、離心。小鼠灌胃藥物劑量參照《藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)》中人與動(dòng)物間按體表面積折算的等效用量，配置成1.5 g生藥/mL藥液，滅菌后于4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。醋酸阿拉瑞林（GnRH-a，25 μg/支，批號(hào)444954） 購(gòu)自上海吉爾生化有限公司，人絕經(jīng)期促性腺激素 （human menopausal gonadotropin，HMG，75 IU，批號(hào)150802） 及人絨毛膜促性腺激素 （human chorionic gonadotropin，hCG，2 000 IU，批號(hào)150810） 購(gòu)自麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠。

1.1.3 試劑和儀器：E2（天津市協(xié)和醫(yī)藥科技集團(tuán)有限公司，批號(hào)S10950204）；P （天津市協(xié)和醫(yī)藥科技集團(tuán)有限公司，批號(hào)S10950202）；VECTASTAIN ABC KIT （美國(guó)VECTOR LABORATORIES公司，批號(hào)PK-4001）；DAB （德國(guó)Sigma-Aldrich公司，批號(hào)D5905）；蘇木素染液 （北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)ZLI-9610）；anti-PP14 （英國(guó)EterLif公司，批號(hào)EL915048）、anti-mouse CD4 FITC、anti-mouse CD8a PE、anti-mouse CD49 （integrin alpha2） （美國(guó)eBioscience公司，批號(hào)4292227、01036-1636、4277527）；RM2135石蠟切片機(jī) （德國(guó)萊卡公司）；Gallios流式細(xì)胞儀 （美國(guó)貝克曼公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組與給藥：80只雌性小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)，于每天上午9：00陰道脫落細(xì)胞涂片，連續(xù)10 d，選取60只周期規(guī)律的小鼠按隨機(jī)數(shù)字表分為正常組、模型組 （GnRH-a+hMG+hCG） 和補(bǔ)腎組 （GnRH-a+hMG+hCG+補(bǔ)腎助孕方），每組20只。模型組、補(bǔ)腎組小鼠在動(dòng)情后期腹腔注射GnRH-a 40 μg/100 g，1次/d，連續(xù)9 d。用藥5 d后陰道脫落細(xì)胞涂片出現(xiàn)周期紊亂，提示垂體抑制，第9天注射HMG 40 IU/100 g，48 h后注射hCG 100 IU/100 g，制備超促排卵模型［5-6］。補(bǔ)腎組小鼠注射GnRH-a/HMG同時(shí)給予補(bǔ)腎助孕方藥液1.5 mL/100 g （2.4 g生藥/100 g） 灌胃，正常組、模型組小鼠以等體積蒸餾水灌胃，1次/d，連續(xù)11 d至注射hCG日［5］。于注射hCG日16：00，正常組 （動(dòng)情期）、模型組和補(bǔ)腎組小鼠按照雌雄2∶1比例分別合籠飼養(yǎng)，次日晨雌鼠見(jiàn)陰栓即為孕第1天。預(yù)實(shí)驗(yàn)給予4.8 g生藥/100 g灌胃，小鼠瘦弱，子宮蒼白細(xì)小，無(wú)胚胎著床。

1.2.2 標(biāo)本獲取及檢測(cè)方法：孕第4天 （小鼠胚胎著床窗口）［7］取小鼠子宮觀察，每組選取10只小鼠斷頭取血，用于E2、P、CD4+T、CD8+T細(xì)胞測(cè)定，無(wú)菌摘取子宮，用4%多聚甲醛固定左側(cè)子宮，行HE染色和免疫組織化學(xué)檢測(cè)；刮取右側(cè)子宮內(nèi)膜，行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。孕第8天斷頭取血處死各組其余10只小鼠，觀察兩側(cè)子宮胚胎發(fā)育和著床情況，陰栓率 （%） =每組見(jiàn)栓小鼠數(shù)/每組小鼠總數(shù)×100，妊娠率 （%） =每組妊娠小鼠數(shù)/每組小鼠總數(shù)×100，平均胚胎著床數(shù)=每組胚胎著床總數(shù)/每組小鼠總數(shù)。

1.2.3 小鼠子宮組織形態(tài)觀察：HE染色后，應(yīng)用高分辨度彩色病理圖文分析系統(tǒng) （HMIAS-2000） 測(cè)量子宮內(nèi)膜厚度。

1.2.4 小鼠子宮內(nèi)膜CD49b+uNK細(xì)胞檢測(cè)：制備子宮內(nèi)膜細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為107/mL，取0.1 mL分別加入熒光標(biāo)記的小鼠抗CD49b+單克隆抗體，振蕩混勻，室溫避光放置30 min，離心并用PBS洗滌后，用流式細(xì)胞儀分析子宮內(nèi)膜CD49b+百分率。

1.2.5 小鼠外周血CD4+T、CD8+T細(xì)胞檢測(cè)：收集外周血白細(xì)胞，離心并用PBS洗滌2次。100 μL重懸細(xì)胞，加入anti-mouse CD4 FITC和anti-mouse CD8a PE抗體，避光孵育30 min，離心，PBS洗滌1次，流式細(xì)胞儀分析外周血CD4+T、CD8+T細(xì)胞百分率。

1.2.6 小鼠血清E2、P水平的檢測(cè)：采用γ放射免疫分析法。

1.2.7 小鼠子宮內(nèi)膜PP14表達(dá)檢測(cè)：每組隨機(jī)選取4只小鼠子宮，制石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，95 ℃檸檬酸緩沖液抗原修復(fù)，3% H2O2消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，3%牛血清白蛋白室溫封閉，加入PP14抗體（1∶200稀釋?zhuān)? ℃過(guò)夜。洗滌后滴加生物素標(biāo)記二抗，室溫反應(yīng)40 min，充分洗滌后加ABC試劑，室溫反應(yīng)30 min，洗后DAB顯色，沖洗，蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化。每只小鼠選1張切片 （10個(gè)視野） 計(jì)數(shù)陽(yáng)性著色細(xì)胞，應(yīng)用病理圖文分析系統(tǒng)分析PP14表達(dá)的平均光密度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。計(jì)量資料用表示，滿足正態(tài)分布且方差齊者組間比較采用LSD檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用百分?jǐn)?shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠孕第4、8天胚胎發(fā)育和著床情況

孕第4天時(shí)，各組小鼠子宮未見(jiàn)胚胎著床。孕第8天，與正常組比較，模型組小鼠子宮較細(xì)且蒼白，胚胎發(fā)育緩慢，妊娠率和平均胚胎著床數(shù)降低 （P<0.05）。與模型組比較，補(bǔ)腎組小鼠子宮充血明顯，胚胎發(fā)育較好，在子宮兩側(cè)不均勻分布，妊娠率和平均胚胎著床數(shù)增加 （P< 0.05）。各組小鼠陰栓率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P> 0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠孕第4天和第8天胚胎發(fā)育和著床情況Fig.1 Observation of embryo development and implantation on the 4th day and 8th day of pregnancy

2.2 各組小鼠WOI子宮內(nèi)膜組織結(jié)構(gòu)

與正常組比較，模型組小鼠子宮內(nèi)膜發(fā)育延遲變薄，腺體數(shù)量減少 （P< 0.05）。與模型組比較，補(bǔ)腎組小鼠子宮內(nèi)膜腺體增粗、彎曲呈乳頭狀，且數(shù)量增加，內(nèi)膜增厚，血管增生，接近分泌期變化 （P<0.05），子宮內(nèi)膜組織結(jié)構(gòu)改善。見(jiàn)圖2。

圖2 各組小鼠WOI子宮內(nèi)膜組織形態(tài)Fig.2 Morphology of WOI endometrial tissue of mice in each group

2.3 各組小鼠WOI外周血T細(xì)胞及子宮內(nèi)膜uNK細(xì)胞水平

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠外周血CD8+T細(xì)胞和子宮內(nèi)膜CD49b+uNK細(xì)胞水平降低 （P< 0.05）。與模型組比較，補(bǔ)腎組小鼠外周血CD8+T細(xì)胞和子宮內(nèi)膜CD49b+uNK細(xì)胞水平升高 （P< 0.05）。各組小鼠外周血CD4+T細(xì)胞水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P> 0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 各組小鼠WOI外周血T細(xì)胞及子宮內(nèi)膜uNK細(xì)胞水平Fig.3 The levels of WOI peripheral blood T cells and endometrial uNK cells of mice in each group

2.4 各組小鼠WOI血清E2、P水平

與正常組E2［ （34.42±2.189） pg/mL］和P ［ （53.82±4.625） ng/mL］水平比較，模型組小鼠血清E2［ （23.05±1.254） pg/mL］、P ［ （22.95±1.723） ng/mL］水平均降低 （均P< 0.05）；與模型組比較，補(bǔ)腎組小鼠血清E2［ （31.74±1.340） pg/mL］、P ［ （33.23±1.828） ng/mL］水平均升高 （均P< 0.05）。

2.5 各組小鼠WOI子宮內(nèi)膜PP14表達(dá)情況

與正常組比較，模型組小鼠子宮內(nèi)膜上皮和基質(zhì)細(xì)胞PP14表達(dá)降低 （P< 0.05）；與模型組比較，補(bǔ)腎組小鼠子宮內(nèi)膜上皮和基質(zhì)細(xì)胞PP14表達(dá)升高（P< 0.05）。見(jiàn)圖4。

圖4 各組小鼠WOI子宮內(nèi)膜PP14表達(dá)Fig.4 Expression of PP14 in WOI endometrium of mice in each group

3 討論

目前，中醫(yī)藥療法已應(yīng)用于輔助生殖技術(shù)治療不孕癥的各環(huán)節(jié)。中醫(yī)認(rèn)為腎藏精，主生殖。精滿則子宮易于攝精，血足則子宮易于容物，皆有子之道也。子宮內(nèi)膜WOI所處的經(jīng)前期精血充盛，陰平陽(yáng)秘，則可攝精種子育胎，受孕后精血下聚以養(yǎng)胎。補(bǔ)腎法的代表方補(bǔ)腎助孕方由歸腎丸合五子衍宗丸加減化裁而成。方中熟地黃滋補(bǔ)肝腎，填精益髓，滋養(yǎng)調(diào)控胞宮為君藥。菟絲子、山藥、紫石英，陽(yáng)中求陰，溫養(yǎng)腎氣；山萸肉、枸杞子等滋補(bǔ)腎精、調(diào)養(yǎng)沖任；當(dāng)歸、白芍養(yǎng)血和血，3組共為臣藥。香附疏肝理氣而為佐使。諸藥合用，共奏滋腎陰、助腎陽(yáng)、填精血、調(diào)沖任，調(diào)節(jié)子宮內(nèi)環(huán)境使之易于容物，以助胚胎順利著床的作用。

IVF-ET治療中，WOI子宮內(nèi)膜缺陷是導(dǎo)致妊娠失敗的主要原因。在某些情況下，這種子宮內(nèi)膜缺陷被認(rèn)為是由治療過(guò)程中超促排卵本身造成的［1］，而超促排卵是IVF-ET中極為關(guān)鍵的一步。本研究根據(jù)臨床IVF-ET過(guò)程中超促排卵方法制作超促排卵小鼠模型，采用GnRHa進(jìn)行垂體降調(diào)節(jié)，促黃體生成素 （luteinizing hormone，LH）、E2下降，通過(guò)注射外源性HMG調(diào)控多個(gè)卵泡同時(shí)被募集發(fā)育，hCG扳機(jī)誘發(fā)排卵，以獲得更多數(shù)量的卵子。結(jié)果顯示，超促排卵后，小鼠胚胎發(fā)育緩慢，WOI子宮內(nèi)膜基質(zhì)和腺體發(fā)育延遲變薄，腺體數(shù)量減少，血清E2、P水平降低；經(jīng)補(bǔ)腎助孕方治療后，胚胎得以較好地發(fā)育，但在子宮內(nèi)分布不均，血清E2、P水平升高，在E2作用的基礎(chǔ)之上，P使子宮內(nèi)膜增厚，腺體數(shù)量增加彎曲，血管豐富，接近分泌期變化。表明補(bǔ)腎助孕方具有促進(jìn)超促排卵小鼠胚胎發(fā)育和著床，改善子宮內(nèi)膜組織結(jié)構(gòu)的作用。子宮內(nèi)膜腺體產(chǎn)生并分泌一系列組織營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，包括氨基酸、葡萄糖和生長(zhǎng)因子，參與滋養(yǎng)外胚層活化、侵襲和植入胚胎的營(yíng)養(yǎng)和存活［8-9］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，補(bǔ)腎助孕方中的當(dāng)歸、丹參可活血化瘀［10-11］，可增加子宮內(nèi)膜的血供；菟絲子、黃芪、枸杞子有類(lèi)雌激素樣作用［12-13］，能促進(jìn)子宮內(nèi)膜增厚，腺體和血管增生。可見(jiàn)，補(bǔ)腎助孕方通過(guò)改善WOI子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)及腺體產(chǎn)生的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和豐富的血液供應(yīng)，為胚胎著床提供適宜的環(huán)境和物質(zhì)基礎(chǔ)，有助于胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育和植入。

胚胎在植入過(guò)程中不被母體排斥，主要依賴于母體免疫激活和胚胎抗原耐受之間的平衡［14］。WOI期間適當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)在子宮內(nèi)膜容受性中起著重要作用［15］。免疫細(xì)胞，尤其uNK細(xì)胞，是獲得和維持母胎界面免疫耐受性至關(guān)重要的組成部分。小鼠來(lái)源的uNK細(xì)胞表面特異性表達(dá)CD49b+［16］。研究［17］表明，胚胎通過(guò)多種通路介導(dǎo)調(diào)控uNK細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，從而維持免疫耐受。uNK細(xì)胞可通過(guò)產(chǎn)生胚胎發(fā)育所必需的促生長(zhǎng)因子直接刺激胎兒生長(zhǎng)［18］。小鼠外周血T細(xì)胞主要分為輔助性CD4+T細(xì)胞和抑制性CD8+T細(xì)胞2個(gè)亞群。PP14被認(rèn)為是重要的子宮內(nèi)膜容受性標(biāo)志物，是參與免疫耐受的重要分子之一，WOI子宮內(nèi)膜PP14表達(dá)顯著增加［3］。PP14可減弱母胎界面uNK細(xì)胞毒性，影響T細(xì)胞和B細(xì)胞對(duì)抗原受體的敏感性和對(duì)胎兒的排斥，以維持母胎界面的免疫穩(wěn)態(tài)［19-20］。

本研究結(jié)果顯示，PP14主要在子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。超促排卵后，小鼠WOI子宮內(nèi)膜uNK細(xì)胞和PP14表達(dá)減少，外周血CD8+T細(xì)胞減少，胚胎發(fā)育緩慢，與ZHANG等［21］的研究結(jié)果相似。經(jīng)補(bǔ)腎助孕方治療后，子宮內(nèi)膜uNK細(xì)胞和PP14的表達(dá)明顯增加，外周血CD8+T細(xì)胞獲得一定程度恢復(fù)，胚胎得到較好的發(fā)育。現(xiàn)代藥理學(xué)研究［22-23］表明，補(bǔ)腎助孕方中的熟地黃、黃芪具有補(bǔ)血和免疫調(diào)節(jié)的作用。因此，補(bǔ)腎助孕方一方面可能通過(guò)調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜uNK細(xì)胞分泌促生長(zhǎng)因子促進(jìn)胚胎發(fā)育，另一方面可能通過(guò)調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜uNK、PP14的表達(dá)及外周血CD8+T細(xì)胞，維持母胎界面免疫耐受，恢復(fù)免疫穩(wěn)態(tài)和子宮內(nèi)膜容受性，保護(hù)胚胎不被母體排斥，最終促進(jìn)胚胎著床，從而提高了超促排卵小鼠的妊娠率和平均胚胎著床數(shù)。本研究為補(bǔ)腎法治療不孕癥提高輔助生殖技術(shù)的妊娠率提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，豐富了“腎主生殖”的理論內(nèi)涵。