馮琳琳,郝莉花*,郭思嘉,鞏 凡,衛(wèi)潤(rùn)鑫,楊龍松

(1.河南省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)技術(shù)研究院,河南鄭州 450000;2.河南省食品安全數(shù)據(jù)智能重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南鄭州 450000)

喹諾酮類抗生素是通過(guò)抑制 DNA 旋轉(zhuǎn)酶活性殺滅細(xì)菌的一類人工合成化合物,常見的喹諾酮類抗生素主要有恩諾沙星、氧氟沙星、培氟沙星、諾氟沙星、沙拉沙星等。喹諾酮類藥物以其抗菌譜廣、吸收好、價(jià)格低廉等特點(diǎn),在臨床方面得到了較廣泛的應(yīng)用。但是不合理的用藥可導(dǎo)致喹諾酮類藥物及其代謝產(chǎn)物在動(dòng)物機(jī)體組織中的殘留。因此人食用動(dòng)物組織后抗生素在人體內(nèi)會(huì)殘留、蓄積,造成人體對(duì)該藥物的耐藥性,破壞腸道菌群,影響人體免疫系統(tǒng)[1],具有潛在的致癌、致突變的作用[1-2]。所以,世界各國(guó)都對(duì)該類藥物在畜禽肉中的殘留制定了嚴(yán)格的限量。因此,對(duì)于動(dòng)物源性食品中喹諾酮類藥物檢測(cè)顯得尤為重要。

目前檢測(cè)喹諾酮類抗生素比較常用的方法有高效液相色譜法 (high performance liquid chromatography,HPLC)[3-4]、液相色譜-質(zhì)譜法 (liquid chromatography mass spectrometry,LC-MS)[5]、微生物法(microbial inhibitions test,MIT)[6]等。HPLC 和 LC-MS 法結(jié)合了色譜的分離能力和質(zhì)譜的定性能力,可對(duì)復(fù)雜化合物進(jìn)行更精準(zhǔn)、簡(jiǎn)便的定性和定量分析,靈敏度比較高[7],但樣品前處理、操作過(guò)程較為煩瑣,檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng),對(duì)試驗(yàn)操作人員技術(shù)要求較高。MIT 法可操作性非常強(qiáng)、成本較低,但靈敏度低、敏感性差,易受其他抗生素干擾[6,8]。這些方法存在前處理復(fù)雜、操作技術(shù)性強(qiáng)、檢測(cè)成本高等缺陷[9]。因此,開發(fā)快速、簡(jiǎn)便的喹諾酮類抗生素篩查方法具有較好的應(yīng)用價(jià)值。

目前,藥物殘留快速篩查方法主要有膠體金免疫層析技術(shù)[10]、傳感器[11]、表面增強(qiáng)拉曼光譜法[12]、原位直接電離質(zhì)譜等。這些方法靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)時(shí)間短,可實(shí)現(xiàn)藥物殘留的現(xiàn)場(chǎng)快速定量檢測(cè),但易受人為因素干擾導(dǎo)致假陽(yáng)性或假陰性,且不適合多種待測(cè)物的高通量快速檢測(cè)。直接離子化質(zhì)譜或原位直接電離質(zhì)譜,可在大氣壓環(huán)境中實(shí)現(xiàn)原位、直接和快速的樣品分析,不需要復(fù)雜的樣品制備過(guò)程,并可節(jié)大量的資源和時(shí)間[13-14]。在各種原位質(zhì)譜電離源中,實(shí)時(shí)直接分析(direct analysis in real time,DART)離子源是一種非表面接觸的熱解析大氣壓電離技術(shù),結(jié)合了等離子體技術(shù)的簡(jiǎn)單性和靈敏性,可直接分析固體、液體和氣體[15-19]。DART離子源具有高檢測(cè)速度和強(qiáng)大的抗干擾能力,可高通量和直接分析復(fù)雜基質(zhì)樣品的特性[17],DART包含了大氣壓電離源類的軟電離特性,與傳統(tǒng)離子源(如電子轟擊電離等)以及電噴霧電離源相比,不僅具有離子化效率高、靈敏度高、準(zhǔn)分子離子峰豐度高、碎片離子少等優(yōu)點(diǎn),還可以抗基質(zhì)干擾,實(shí)現(xiàn)樣品的原位、無(wú)損、低碳、實(shí)時(shí)、直接和快速分析。使用DART離子源不需要繁雜冗長(zhǎng)的樣品制備過(guò)程,極大地縮短了分析時(shí)間,節(jié)省了人力、物力資源,以實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室高通量分析。近年來(lái),利用DART-MS方法可對(duì)乳制品進(jìn)行高通量和全自動(dòng)的檢測(cè),還經(jīng)常用于火鍋底料和一些調(diào)味料中罌粟殼生物堿的檢測(cè),操作過(guò)程簡(jiǎn)單省時(shí),為食品安全的監(jiān)測(cè)工作帶來(lái)了有力的技術(shù)支持[20]。目前關(guān)于DART離子源質(zhì)譜檢測(cè)喹諾酮類抗生素的研究很少。該研究通過(guò)對(duì)豬肉基質(zhì)的溶劑提取和簡(jiǎn)單凈化,DART離子源直接離子化,采用三重四極桿液質(zhì)儀分析測(cè)定,實(shí)現(xiàn)喹諾酮類藥物殘留實(shí)時(shí)快速直接分析,建立一套獸藥殘留的快速篩查分析方法,以期為風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)和監(jiān)督抽檢工作提供指導(dǎo)方向。

1 材料與方法

1.1 試材與試劑豬肉(市售)。乙腈(色譜純,德國(guó) Merck 公司); 5982-0032萃取鹽包 (美國(guó)Agilent公司); 5982-4950 凈化包(美國(guó)Agilent公司); PRiME HLB固相萃取小柱(美國(guó)waters公司); 有機(jī)微孔濾膜(孔徑0.22 μm,美國(guó)Agilent公司)。標(biāo)準(zhǔn)品:環(huán)丙沙星、達(dá)諾沙星、雙氟沙星、恩諾沙星、洛美沙星、氧氟沙星、奧比沙星、培氟沙星、沙拉沙星、司帕沙星(100 μg/mL,天津阿爾塔科技有限公司)。

1.2 儀器與設(shè)備電子天平(感量0.10 mg,METTLER TOLEDO ME104E;感量0.01 mg,METTLER TOLEDOXA205);Milli-Q去離子水發(fā)生器(美國(guó)Millipore公司);QL 866漩渦混合器(海門市其林貝爾儀器制造公司); SB-25-12DT超聲波發(fā)生器(寧波新芝生物科技有限公司);Velocity 18R Pro 離心機(jī)(澳大利亞 Dynamica 公司);N-Evap 氮吹儀(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司);AB 4500 三重四極桿液質(zhì)儀 (美國(guó)AB SCIEX公司);DART SVP 離子源、樣品傳動(dòng)軌道、進(jìn)樣玻璃棒(美國(guó)Ion-Sense公司);隔膜泵(德國(guó) Vacuubrand公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1樣品前處理。市售豬肉均質(zhì)勻漿后制成豬肉空白樣品。

直接提取法:稱取豬肉空白樣品2.5 g試樣于50 mL 塑料離心管中,加入10 mL乙腈,劇烈振蕩2 min。超聲提取20 min,于10 000 r/min離心5 min。取2 mL上清液,40 ℃下氮吹至干。加入0.5 mL 20%(體積分?jǐn)?shù))乙腈水復(fù)溶,渦旋30 s,超聲5 min充分溶解,過(guò)0.22 μm有機(jī)微孔濾膜,得到基質(zhì)提取液,待測(cè)。

分散固相萃取凈化法:稱取豬肉空白樣品2.5 g試樣于50 mL塑料離心管中,加入10 mL乙腈,劇烈振蕩2 min。加入5 g萃取鹽包,渦旋,于10 000 r/min離心5 min。取6 mL上清液于5982-4950 凈化包中,渦旋30 s,4 000 r/min離心10 min。取2 mL上清液,40 ℃氮吹至干。加入0.5 mL 20%(體積分?jǐn)?shù))乙腈水復(fù)溶,渦旋30 s,超聲5 min充分溶解,過(guò)0.22 μm有機(jī)微孔濾膜,得到凈化包提取液,待測(cè)。

固相萃取柱凈化法:稱取豬肉空白樣品2.5 g試樣于50 mL塑料離心管中,加10 mL乙腈,劇烈振蕩2 min,于10 000 r/min離心5 min。取5 mL上清液轉(zhuǎn)移至PRiME HLB凈化小柱上,洗脫收集2 mL上清液,40 ℃氮吹至干。加入0.5 mL 20%(體積分?jǐn)?shù))乙腈水復(fù)溶,渦旋30 s,超聲5 min充分溶解,過(guò)0.22 μm有機(jī)微孔濾膜,得到凈化柱提取液,待測(cè)。

1.3.2儀器參數(shù)。質(zhì)譜條件:掃描模式為全掃描模式(MRM);氣簾氣(CUR)137.9 kPa; 碰撞氣(CAD)為Medium;離子源溫度 (IHT)250 ℃;碰撞室脫離電壓 (CXP)6 V;碰撞室入口電壓(EP)10 V。DART 離子源條件:正離子模式;解離氣體溫度350 ℃;柵網(wǎng)電極電壓 200 V;樣品軌道傳動(dòng)速度1.0 mm/s;隔膜泵壓力12.0 kPa。工作氣體和預(yù)備氣體均為高純度氮?dú)?99.999%),進(jìn)樣裝置為玻璃棒進(jìn)樣;用移液槍準(zhǔn)確吸取液體2 μL于玻璃棒中,氦氣打在玻璃棒上,離子化之后進(jìn)入質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)。待測(cè)化合物定量離子對(duì)、定性離子對(duì)及碰撞能量見表1。

表1 待測(cè)化合物定量離子對(duì)、定性離子對(duì)及碰撞能量

1.3.3標(biāo)準(zhǔn)溶液配制。

1.3.3.1標(biāo)準(zhǔn)混標(biāo)儲(chǔ)備液。分別量取1 mL環(huán)丙沙星、達(dá)諾沙星、雙氟沙星、恩諾沙星、洛美沙星、氧氟沙星、奧比沙星、培氟沙星、沙拉沙星、司帕沙星于10 mL容量瓶中,用乙腈定容并混勻,配制成10 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)混標(biāo)儲(chǔ)備液。

1.3.3.2標(biāo)準(zhǔn)混合中間液。取1 mL標(biāo)準(zhǔn)混標(biāo)儲(chǔ)備液于10 mL 容量瓶中,用乙腈定容并混勻,配制成1 000 μg/L中間液。

1.3.3.3標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。取10、20、50、80、100 μL標(biāo)準(zhǔn)混合中間液分別用乙腈、基質(zhì)提取液、凈化包提取液、凈化柱提取液定容至1 mL,配制成10、20、50、80、100 μg/L標(biāo)準(zhǔn)濃度系列工作液。

1.3.4數(shù)據(jù)處理。取配制好的系列工作液進(jìn)行測(cè)定,分別測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)系列工作液定量離子相應(yīng)的豐度,以標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度為橫坐標(biāo)、豐度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,外標(biāo)法定量,數(shù)據(jù)采用Excel處理。

前處理過(guò)程總基質(zhì)效應(yīng)以ME值評(píng)價(jià),基質(zhì)效應(yīng)計(jì)算參照文獻(xiàn)[21]的方法:

ME=B/A×100%

(1)

式中:ME為前處理過(guò)程總基質(zhì)效應(yīng)(%);A為目標(biāo)化合物在純?nèi)軇┗|(zhì)中檢測(cè)的峰面積;B為目標(biāo)化合物在陰性樣品處理液基質(zhì)中檢測(cè)的峰面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理凈化效果分析空白豬肉樣品按照“1.3.1”樣品前處理得到基質(zhì)提取液、凈化包提取液、凈化柱提取液。取100 μL標(biāo)準(zhǔn)混合中間液分別用乙腈、基質(zhì)提取液、凈化包提取液、凈化柱提取液定容至1 mL,按照“1.3.2”儀器參數(shù)對(duì)上述3種基質(zhì)標(biāo)進(jìn)行測(cè)定,每個(gè)樣品測(cè)定4次,最終結(jié)果以平均值計(jì),并按照公式(1)計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)(ME),見表2。選取洛美沙星作為典型的提取離子流圖,見圖1。

圖1 0.1 μg/mL乙腈中洛美沙星提取離子流圖Fig.1 Ion flow diagram of lomefloxacin extraction in 0.1 μg/mL acetonitrile

表2 不同凈化方式的ME

基質(zhì)效應(yīng)(ME)可以反映基質(zhì)效應(yīng)的程度。通常ME>100%為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng),ME<100%為基質(zhì)減弱效應(yīng),ME=100%則不產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)。從表2可以看出,10 種化合物在豬肉中均受到不同的基質(zhì)效應(yīng),在基質(zhì)提取液中,其中環(huán)丙沙星、達(dá)諾沙星、培氟沙星、沙拉沙星這4種為增強(qiáng)效應(yīng),雙氟沙星、恩諾沙星、洛美沙星、氧氟沙星、奧比沙星、司帕沙星為抑制效應(yīng);環(huán)丙沙星受到基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)最強(qiáng),奧比沙星受到基質(zhì)抑制效應(yīng)最弱。在凈化柱提取液中,10 種化合物均為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。在凈化包提取液中,除了奧比沙星外,其余均為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。大多數(shù)化合物在凈化柱提取液和凈化包提取液中的ME均大于在基質(zhì)提取液中的ME,這說(shuō)明基質(zhì)采取2種方法凈化均能夠提高M(jìn)E,即凈化減少了雜質(zhì)的含量,減少雜質(zhì)與獸藥化合物競(jìng)爭(zhēng)離子化,因而提高了獸藥化合物的離子化效率。此外,10種喹諾酮類化合物在凈化柱提取液ME大于凈化包提取液中的ME,這說(shuō)明凈化柱的凈化效果優(yōu)于凈化包,通過(guò)凈化柱能夠除掉更多的雜質(zhì),提高了獸藥化合物的離子化效率。

獸藥化合物在基質(zhì)中的ME小于100%說(shuō)明雜質(zhì)與獸藥化合物競(jìng)爭(zhēng)離子化,因而降低了獸藥化合物的離子化效率。獸藥化合物在基質(zhì)中的ME大于100%,可能的原因是雜質(zhì)與獸藥化合物離子化后,在離子源與質(zhì)譜間的通道被吸附,雜質(zhì)與獸藥化合物競(jìng)爭(zhēng)吸附,從而抑制了獸藥化合物在通道的損失,增加了獸藥化合物通路,提高了響應(yīng)值,當(dāng)競(jìng)爭(zhēng)吸附大于競(jìng)爭(zhēng)離子化的作用,宏觀表現(xiàn)為ME大于100%。同一種基質(zhì)經(jīng)不同的方式凈化后,對(duì)喹諾酮類化合物產(chǎn)生不同的基質(zhì)效應(yīng)。這一方面可能是由于不同前處理方式的凈化效果和去除雜質(zhì)種類不一致,導(dǎo)致目標(biāo)化合物受到的基質(zhì)干擾程度存在差異;另一方面可能是喹諾酮類化合物基本骨架均為氮雜雙并環(huán),但不同化合物的分子和空間結(jié)構(gòu)存在一定差異,可能導(dǎo)致其受到基質(zhì)影響不同。

2.2 檢出限空白豬肉樣品按照“1.3.1”樣品前處理得到基質(zhì)提取液、凈化包提取液、凈化柱提取液。取10 μL標(biāo)準(zhǔn)混合中間液分別用乙腈、基質(zhì)提取液、凈化包提取液、凈化柱提取液定容至1 mL,按照“1.3.2”儀器參數(shù)對(duì)上述3種基質(zhì)標(biāo)進(jìn)行測(cè)定,每個(gè)樣品測(cè)定4次,最終結(jié)果以平均值計(jì),另取空白基質(zhì)檢測(cè),各化合物定量離子對(duì)響應(yīng)結(jié)果見表3。

表3 檢出限及空白基質(zhì)定量離子對(duì)響應(yīng)

從表3可以看出,10種喹諾酮在10 μg/kg均有響應(yīng),在0 μg/kg時(shí),基質(zhì)提取液、凈化包提取液、凈化柱提取液中10種喹諾酮均沒有產(chǎn)生響應(yīng)值。因此,直接使用基質(zhì)提取液提取不進(jìn)行凈化,10種喹諾酮均能夠在10 μg/kg檢出,滿足了GB 31650—2019 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》判定要求,能夠?qū)崿F(xiàn)不合格產(chǎn)品的快速篩查。

2.3 線性范圍取10、20、50、80、100 μL標(biāo)準(zhǔn)混合中間液分別用乙腈、基質(zhì)提取液、凈化包提取液、凈化柱提取液定容至1 mL,配制10、20、50、80、100 μg/L標(biāo)準(zhǔn)濃度系列,按照“1.3.2”儀器參數(shù)對(duì)上述3種基質(zhì)標(biāo)進(jìn)行測(cè)定,每個(gè)樣品測(cè)定4次,最終結(jié)果以平均值計(jì),見表4。從表4可以看出,在10～100 μg/L,10種喹諾酮線性決定系數(shù)(R2)在0.700 0～0.970 0,線性關(guān)系良好。

表4 10種喹諾酮的線性方程、決定系數(shù)和線性范圍

2.4 精密度空白豬肉樣品按照“1.3.1”樣品前處理得到基質(zhì)提取液、凈化包提取液、凈化柱提取液。取10、20、50、80、100 μL標(biāo)準(zhǔn)混合中間液分別用乙腈、基質(zhì)提取液、凈化包提取液、凈化柱提取液定容至1 mL,配制10、20、50、80、100 μg/L 標(biāo)準(zhǔn)濃度系列,按照“1.3.2”儀器參數(shù)對(duì)上述3種基質(zhì)標(biāo)進(jìn)行測(cè)定,每個(gè)樣品測(cè)定4次,最終結(jié)果以平均值計(jì)。精密度以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)計(jì),10種喹諾酮的檢測(cè)精密度結(jié)果見表5。

表5 喹諾酮檢測(cè)精密度RSD

從表5可以看出,4種不同處理方式RSD為61.98%～185.26%, 溶劑提取液、基質(zhì)提取液、凈化柱提取液、凈化包提取液的RSD平均值分別為112.36%、109.97%、69.70%、86.39%,凈化柱提取液RSD明顯低于其他基質(zhì)的RSD,因此在檢測(cè)肉品中喹諾酮時(shí),采用凈化柱凈化能夠獲得較好的精密度。

3 結(jié)論與討論

該研究通過(guò)對(duì)豬肉基質(zhì)的溶劑提取和簡(jiǎn)單凈化,并使用DART 離子源與三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(DART-QQQ),實(shí)現(xiàn)了10種喹諾酮實(shí)時(shí)快速直接分析。

該研究比較了基質(zhì)提取液、凈化包提取液、凈化柱提取液中基質(zhì)對(duì)目標(biāo)物檢測(cè)的基質(zhì)效應(yīng),結(jié)果表明凈化柱的凈化效果最好,能夠獲得較好的精密度。上述3種處理方法10種喹諾酮均能夠在10 μg/kg檢出,能夠?qū)崿F(xiàn)不合格產(chǎn)品的快速篩查。10種喹諾酮在10 ～100 μg/L線性決定系數(shù)(R2)在0.700 0～0.970 0,線性關(guān)系良好。

因此,采用DART-QQQ檢測(cè)豬肉中10種喹諾酮作為快檢和對(duì)市售喹諾酮不合格豬肉的篩查,方法準(zhǔn)確性、靈敏度好,并且能夠擴(kuò)展更多種類獸藥高通量篩查,因此在多獸藥高通量快檢領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。