陳佳雯,劉捍寧,吳 媛,胡 星,莊 鑫,郭俊杰,肖井雷

長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,吉林長春 130117)

朝鮮淫羊藿為小檗科(Berberidaceae)淫羊藿屬(EpimediumLinn.)多年生草本植物,植株高15～40 cm,大多生長在海拔400～1 500 m的林下或灌叢中。目前對朝鮮淫羊藿植物僅有少量相關(guān)研究,但已證實朝鮮淫羊藿中存在可產(chǎn)黃酮類成分的微生物[1],而藥材質(zhì)量除受產(chǎn)地和采收期等非生物因素影響外,微生物也是影響藥材品質(zhì)的因素之一,可見生物因素對朝鮮淫羊藿次生代謝產(chǎn)物的合成和積累具有一定的影響,因此深入開展朝鮮淫羊藿微生物群落組成相關(guān)研究,進(jìn)一步分析微生物與活性成分之間的關(guān)系具有重要的意義。

根際土壤真菌也可產(chǎn)生一些對植物生長具有較大影響的植物激素,如吲哚乙酸[2]。有相關(guān)研究已表明根際土壤真菌對宿主植物次生代謝產(chǎn)物的合成和積累也具有一定積極的作用,如接種叢枝菌根真菌對牧豆樹根中葫蘆巴堿成分和黃花蒿中青蒿素和揮發(fā)油成分均有不同程度的提高[3-4],而在刺五加植物中,接種滅活后的角坦菌對刺五加苷E的合成和積累具有一定的促進(jìn)作用[5]。植物內(nèi)生真菌通過與植物長期的協(xié)同進(jìn)化,可產(chǎn)生某些與宿主植物相似或相同的代謝物質(zhì),如生物堿、萜類、芳香類、多肽類、黃酮類等成分[6],如內(nèi)生真菌Fusariumsp.可提高大戟的大戟素和大戟醇的含量,促進(jìn)其萜類成分的合成[7]。目前,已從眾多植物中分離得到相關(guān)微生物并進(jìn)行相關(guān)試驗研究證實其對植物生長具有一定積極的作用,如在菊花中分離得到球毛殼菌,可提高菊花植株的生物量和抗逆性[8];也有部分菌株可調(diào)控植物赤霉素、吲哚乙酸等內(nèi)源性激素的分泌[9],同時也可自身產(chǎn)生植物激素[10]。有學(xué)者對刺五加[9]、古側(cè)柏[11]的內(nèi)生真菌研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)生真菌可促進(jìn)植物種子萌發(fā)?；谝陨涎芯砍晒?推測被孢霉屬的相對豐度在朝鮮淫羊藿生長初期相對豐度最高,對朝鮮淫羊藿藥用成分的正向影響最顯著;柱隔孢屬為朝鮮淫羊藿的致病菌屬,隨著時間的推移相對豐度減少。為了驗證這些假設(shè),該研究采用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù),對吉林省臨江市的朝鮮淫羊藿葉片中內(nèi)生菌和根際微生物群落的多樣性進(jìn)行研究,分析潛在的核心微生物菌群,尤其是不同生長時期的差異菌群和相對豐度的變化,以期為朝鮮淫羊藿的仿生態(tài)栽培提供了科學(xué)依據(jù),也為植物生長發(fā)育中根際和內(nèi)生菌群落的復(fù)雜性分析提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料采用“抖落取樣法”于2020年5—7月在吉林省臨江市地區(qū)采集朝鮮淫羊藿根際土壤(MT)和葉片內(nèi)生真菌(MY),每個采集地選取5個采樣點,共10個點5個時期(MY1、MY2、MY3、MY4、MY5、MT1、MT2、MT3、MT4、MT5),每隔15 d采樣1次。

1.2 主要儀器與試劑見表1。

表1 儀器與試劑

1.3 試驗方法

1.3.1高通量測序分析。

1.3.1.1DNA提取。根際土壤總DNA提取參照OMEGA試劑盒E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit說明書進(jìn)行,采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性,并利用Qubit 3.0 DNA檢測試劑盒檢測純度和濃度。

1.3.1.2PCR擴(kuò)增。以根際土壤和葉片內(nèi)生真菌總DNA為模板,共進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增。第一輪PCR反應(yīng)體系:正反引物ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)各1 μL,2×Hieff? Robust PCR Master Mix 15 μL,Template DNA 10～20 ng,補ddH2O至30 μL。PCR反應(yīng)條件:94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s,45 ℃ 20 s,65 ℃ 30 s,5個循環(huán);94 ℃ 20 s,55 ℃ 20 s,72 ℃ 30 s,20個循環(huán);72 ℃ 5 min,10 ℃停止。第二輪PCR反應(yīng)體系:正反引物TS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)各1 μL,2×Hieff? Robust PCR Master Mix 15 μL,Template DNA 20～30 ng,補ddH2O至30 μL。PCR反應(yīng)條件:95 ℃ 3 min;94 ℃ 20 s,55 ℃ 20 s,72 ℃ 30 s,5個循環(huán);72 ℃ 5 min,10 ℃停止。擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測其片段大小,用DNA Clean Beads對DNA進(jìn)行純化,純化產(chǎn)物用Qubit 3.0熒光定量儀進(jìn)行濃度測定,之后進(jìn)行Miseq測序。測序部分由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.3.2供試品溶液的制備。取全部過3號篩朝鮮淫羊藿粉末約0.2 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入稀乙醇20 mL,稱重,超聲(500 W,40 kHz)處理1 h,再稱量,用稀乙醇補足減失的量,搖勻,過濾,取續(xù)濾液即得。

1.3.3色譜條件。色譜柱為Inertsil? ODS-3(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動相為乙腈(B)-水(A),梯度洗脫(0～37 min,24%B;37～47 min,24%～38%B;47～60 min,38%～24%B);流速1 mL/min;檢測波長270 nm;柱溫30 ℃;進(jìn)樣量10 μL。理論塔板數(shù)按淫羊藿苷峰計算不低于1 500[1-2]。

1.3.4線性關(guān)系考察。取對照品混合溶液2、4、6、8、10 μL注入儀器,按照“1.3.3”色譜條件進(jìn)行測定,以進(jìn)樣量(X,μg)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、決定系數(shù)(R2)和線性范圍見表2。

表2 4個總黃酮醇苷類成分的回歸方程

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析使用Usearch 11.0.667 軟件對有效序列按照97%相似性進(jìn)行OTU聚類,再將每個OTU的代表序列真菌UNITE數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對,獲得代表性序列在各分類水平的物種注釋信息,多組間差異分析和制圖則采用LefSe 1.1.0軟件進(jìn)行。兩組間差異分析則采用STAMP 2.1.3軟件進(jìn)行分析和制圖。使用Excel 2016和SPSS 21.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計,對樣品組間的差異采用單因素方差檢驗分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 根際土壤與葉片內(nèi)生真菌類樣品OTU聚類和物種注釋通過對MT類5組樣品高通量測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控過濾,共得到有效序列278 515條和4 915個OTU。由圖1A可知,5組樣品共有OTU數(shù)目674個,占全部OTU數(shù)目的13.71%;MT1、MT2、MT3、MT4和MT5樣品特有OTU數(shù)目分別為310、297、145、447和475個。從門到屬對5組樣品所獲得的OTU進(jìn)行物種注釋,除去未分類的,共得到16門57綱154目341科935屬真菌。

圖1 朝鮮淫羊藿不同生長階段根際土壤(A)和葉片內(nèi)生真菌(B)Pan/Core 曲線圖Fig.1 A Pan/Core plot of the rhizosphere soil(A)and leaf endophyte fungi(B)at the different growth stages of Epimedium koreanum Nakai

通過對MY類5組樣品高通量測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控過濾,共得到有效序列253 799條和2 934個OTU。由圖1B可知,5組樣品共有OTU數(shù)目96個,占全部OTU數(shù)目的3.27%;MY1、MY2、MY3、MY4和MY5樣品特有OTU數(shù)目分別為217、104、165、384和548個。從門到屬對5組樣品所獲得的OTU進(jìn)行物種注釋,除去未分類的,共得到12門47綱137目299科753屬真菌。

2.2 根際土壤與葉片內(nèi)生真菌類樣品屬水平物種組成分析MT 類樣品屬水平上的物種組成和相對豐度(平均相對豐度>1%)見圖2A,除去未分類和其他,5組樣品主要由蠟殼耳屬(Sebacina)、被孢霉屬(Mortierella)、棉革菌屬(Tomentella)、粒塊菌屬(Discosia)和濕傘屬(Hygrocybe)等菌屬組成。其中蠟殼耳屬、被孢霉屬和棉革菌屬為核心菌屬。雖5個時期屬水平物種組成具有相似部分,但所占比例受生長階段不同影響較大,MT1和MT2時期被孢霉屬為第一優(yōu)勢菌屬,其次蠟殼耳屬、濕傘屬、Sistotrema、Paraphoma等菌屬相對豐度也較高;而MT3和MT5時期蠟殼耳屬為第一優(yōu)勢菌屬,且該屬在MT5時期占比高達(dá)64.08%,占有絕對優(yōu)勢,其次相對豐度較高的菌屬有被孢霉屬和棉革菌屬等;MT4時期第一優(yōu)勢菌屬為粒塊菌屬,其次為蠟殼耳屬、Hydnobolites和Setoscypha等。其中MT1時期Paraphoma為該時期特有優(yōu)勢菌屬,MT2時期特有優(yōu)勢菌屬為Sistotrema,MT4時期特有優(yōu)勢菌屬為粒塊菌屬和Setoscypha。被孢霉屬和Paraphoma均為MT1時期相對豐度較高且隨著生長階段的加長而逐漸減少;蠟殼耳屬隨著生長階段變化其相對豐度變化波動較大,相對豐度以MT5時期最高,高達(dá)64.08%;棉革菌屬相對豐度則呈先增加后減少趨勢,MT2時期占比最高,MT5時期最低。分析結(jié)果表明,朝鮮淫羊藿根際土壤真菌群落組成和占比與生長階段密切相關(guān)。

圖2 不同生長時期朝鮮淫羊藿根際土壤(A)與葉片內(nèi)生真菌(B)優(yōu)勢物種分布比例Fig.2 Distribution proportion of dominant species in rhizosphere soil(A)and leaf endophytic fungi(B)of Epimedium koreanum Nakai at different growth stages

MY類樣品屬水平上的物種組成和相對豐度(平均相對豐度>1%)見圖2B,除去未分類和其他,主要由柱隔孢屬(Ramularia)、亞球殼屬(Sphaerulina)、蠟殼耳屬(Sebacina)、外瓶柄霉屬(Exophiala)、曲霉屬(Aspergillus)、被孢霉屬(Mortierella)等菌屬組成,5組樣品的核心菌屬為亞球殼屬。MY1時期被孢霉屬(11.61%)為第一優(yōu)勢菌屬,其次為亞球殼屬(6.27%)、Amphinema(5.22%)等;MY2時期則曲霉屬(15.22%)為第一優(yōu)勢菌屬,其次為亞球殼屬(5.60%)、短柄霉屬Aureobasidium(3.80%)等;MY3時期亞球殼屬(13.34%)為第一優(yōu)勢菌屬,其次為柱隔孢屬(9.78%)、Dissoconium(6.78%)、Mycodiella(6.72%)等菌屬;MY4和MY5時期柱隔孢屬為第一優(yōu)勢菌屬,其次為蠟殼耳屬、外瓶柄霉屬等菌屬。其中MY1時期Amphinema為該時期特有優(yōu)勢菌屬,曲霉屬為MY2時期特有優(yōu)勢菌屬,Dissoconium和Articulospora為MY3時期特有優(yōu)勢菌屬。

2.3 根際土壤與葉片內(nèi)生真菌類樣品組間差異分析由圖3A可知,以LDA score>4為標(biāo)準(zhǔn)。MT1時期與其他時期具有顯著差異的真菌群落主要為被孢霉屬、濕傘屬、紅菇屬等;MT2時期為Plectosphaerella、Archaeorhizomyces;MT3時期則為外瓶柄霉屬、Cladophialophora;MT4時期為粒塊菌屬、Hydnobolites、Setoscypha等;MT5時期為蠟殼菌屬、Membranomyces、柱隔孢屬等。

圖3 不同生長階段朝鮮淫羊藿根際土壤真菌(A)和葉片內(nèi)生真菌(B)組間菌屬差異分析Fig.3 Analysis of the differences in fungal genera between the rhizosphere soil fungi(A)and leaf endophytic fungi(B)of Epimedium koreanum at different growth stages

由圖3B可知,以LDA score>4為標(biāo)準(zhǔn)。MY1時期與其他時期具有顯著差異的真菌群落主要為被孢霉屬、Amphinema、棉革菌屬;MY2時期為曲霉屬、伊薩酵母屬、短柄霉屬;MY3時期則為Mycodiella、Articulospora等;MY4時期為蠟殼耳屬、Dioszegia、Hyphozyma、Agaricomycetes等;MY5時期為柱隔孢屬、外瓶柄霉屬、Cyphellophora、Chaetothyriales等。

如圖4所示,柱隔孢屬在MY1～MY5時期隨著生長階段的加長,相對豐度逐漸增加。由圖5可知,被孢霉屬在MT1和MY1時期相對豐度最高。

圖4 柱隔孢屬的朝鮮淫羊藿不同生長階段根際土壤真菌ANOVA方差分析Fig.4 Ramularia analysis of variance of ANOVA in rhizosphere soil at different growth stages of Epimedium koreanum Nakai

圖5 被孢霉屬的朝鮮淫羊藿不同生長階段根際土壤真菌(A)和葉片內(nèi)生真菌(B)ANOVA方差分析Fig.5 Mortierella analysis of variance of ANOVA in rhizosphere soil(A)and leaf endophytes(B)at different growth stages of Epimedium koreanum Nakai

2.4 根際土壤真菌、葉片內(nèi)生真菌與黃酮類成分相關(guān)性分析各組樣品黃酮類成分測定結(jié)果見表3。采用R 3.6.0軟件對不同生長階段朝鮮淫羊藿根際土壤真菌主要菌屬與黃酮類成分進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果表明(表4),被孢霉屬與總黃酮和淫羊藿苷呈極顯著正相關(guān)(P<0.01);Paraphoma與淫羊藿苷呈顯著正相關(guān)(P<0.05);紅菇屬與總黃酮呈顯著正相關(guān)(P<0.05);除上述菌屬外,蠟殼耳屬、粒塊菌屬、Hydnobolites、Archaeorhizomyces、Sistotrema、Cladophialophora、Mycoarthris、Setoscypha與黃酮類化學(xué)成分呈不同程度的負(fù)相關(guān)。

表3 各組樣品黃酮類成分測定結(jié)果(n=3)

表4 不同生長階段根際土壤真菌主要菌屬與黃酮類成分相關(guān)系數(shù)

2.5 內(nèi)生真菌與黃酮類成分相關(guān)性分析由表5可知,不同生長階段朝鮮淫羊藿內(nèi)生真菌中,被孢霉屬與朝藿定A、朝藿定B和總黃酮醇苷呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),與淫羊藿苷呈顯著正相關(guān)(P<0.05);曲霉屬與總黃酮、朝藿定B和總黃酮醇苷呈顯著正相關(guān)(P<0.05),與淫羊藿苷呈極顯著正相關(guān)(P<0.01);Aureobasidium與總黃酮呈顯著正相關(guān)(P<0.05);Amphinema與朝藿定A呈顯著正相關(guān)(P<0.05),與朝藿定B呈極顯著正相關(guān)(P<0.01);畢赤氏酵母屬與總黃酮和淫羊藿苷呈極顯著正相關(guān)(P<0.01);其他菌屬與黃酮類成分呈不同程度的負(fù)相關(guān)。

表5 不同生長階段內(nèi)生真菌主要菌屬與黃酮類成分相關(guān)系數(shù)

3 討論

在朝鮮淫羊藿不同生長階段的根際土壤真菌研究中得出,柱隔孢屬與黃酮類成分呈不同程度的負(fù)相關(guān),且該菌屬隨著朝鮮淫羊藿生長階段的加長,相對豐度逐漸升高。柱隔孢屬作為一種季節(jié)晚期疾病的病原體,與宿主從營養(yǎng)階段到生殖階段的發(fā)育變化以及單果衰老期間宿主抗氧化系統(tǒng)的下降有關(guān)[12]。柱隔孢屬的葉斑病是一個晚期疾病,最初作為一個內(nèi)生菌,可以保持在無癥狀狀態(tài)幾周,但經(jīng)過長時間的潛在發(fā)展,它可以開發(fā)成為一個積極的壞死性病原體[13]。朝鮮淫羊藿不同生長階段的根際土壤真菌和葉片內(nèi)生真菌與藥用成分相關(guān)性分析表明,被孢霉屬與黃酮類成分呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。被孢霉屬真菌是一種重要的腐殖生物,生活在多種有機基質(zhì)上,如土壤、植物碎片和動物糞便[14-16]。 相關(guān)研究表明被孢霉屬(Mortierella)真菌具有良好的抗真菌、抗腫瘤活性,同時也可產(chǎn)生Brefeldin A代謝物質(zhì)[17],推測出朝鮮淫羊藿植物中可能是有類似抗真菌菌株存在,抑制了部分植株體內(nèi)的病原菌,促進(jìn)了內(nèi)在化學(xué)成分的合成。此外,紅菇屬、Amphinema、畢赤氏酵母屬、曲霉屬均不同程度地對朝鮮淫羊藿藥用成分有正向作用。 紅菇屬可能具有復(fù)雜土壤有機質(zhì)的分解能力[18-19],Amphinema可以提高宿主植物其他營養(yǎng)物質(zhì)的水平和生長[20],畢赤氏酵母是一種很有前途的家禽益生菌[21],曲霉屬是現(xiàn)階段較為公認(rèn)的具有促進(jìn)生長作用的菌屬之一[22]。這些研究為朝鮮淫羊藿生物肥料開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

該研究初步顯示了朝鮮淫羊藿不同生長階段的真菌群落的豐富程度,對真菌群落和藥用成分進(jìn)行分析,得出根際土壤真菌和葉片內(nèi)生真菌在朝鮮淫羊藿生長的不同時期起到了不同的生長代謝作用,對朝鮮淫羊藿的品質(zhì)變化值得進(jìn)一步探索。下一步工作重點從以下幾個方面進(jìn)行:①繼續(xù)深入研究不同省份朝鮮淫羊藿的根際微生物和內(nèi)生菌資源,探究其根際微生物和內(nèi)生菌群地理分布規(guī)律,為深入探索藥材道地性品質(zhì)奠定基礎(chǔ);②分離朝鮮淫羊藿根際土壤和內(nèi)生菌菌株,研究菌株對朝鮮淫羊藿的促生作用;③建立生物肥特性菌株篩選體系,評估其對朝鮮淫羊藿生長過程中生物量增加情況,篩選獲得農(nóng)業(yè)應(yīng)用潛質(zhì)的生防菌株。

4 結(jié)論

該研究檢測不同生長時期的朝鮮淫羊藿樣品,采用第二代高通量測序技術(shù)分析朝鮮淫羊藿根際土壤真菌和葉片內(nèi)生真菌多樣性;采用紫外-可見分光光度法和高效液相色譜法對藥用成分進(jìn)行測定。結(jié)果表明,朝鮮淫羊藿根際土壤真菌共得到有效序列278 515條和16門57綱154目341科935屬真菌;葉片內(nèi)生真菌共得到有效序列253 799和12門47綱137目299科753屬真菌。柱隔孢屬可能是阻礙朝鮮淫羊藿生長代謝的病原菌之一;被孢霉屬對朝鮮淫羊藿黃酮類成分的正向影響最顯著。