周 晗,黃 瑜,簡紀常,蔡 佳,黃浦江

(1.廣東海洋大學水產(chǎn)學院/廣東省水產(chǎn)動物病害防控與健康養(yǎng)殖重點實驗室,廣東湛江 524088;2.深圳市漁業(yè)發(fā)展研究中心,廣東深圳 518108)

黃喉擬水龜(Mauremysmutica),別名石金錢,隸屬爬行綱(Reptilia),20世紀80年代以后被引入日本,成為外來入侵種。與世界許多生物一樣,過度捕獵和棲息地喪失等因素導致其野生資源幾近枯竭。現(xiàn)如今規(guī)?；B(yǎng)殖目前已經(jīng)形成,在飼養(yǎng)過程中,黃喉擬水龜易發(fā)生大規(guī)模暴發(fā)性疾病,病龜食欲不振,行動遲緩,器官受病菌感染,最終衰竭死亡,給養(yǎng)殖戶帶來極大的經(jīng)濟損失。資料顯示,黃喉擬水龜曾在2000和2016年均被記錄為瀕危物種,在2010年被記錄為極度瀕危物種[1],在國際貿(mào)易中受到嚴格管控[2]。黃喉擬水龜?shù)氖秤?、藥用和觀賞價值較高,在人工養(yǎng)殖條件下,細菌類疾病是導致黃喉擬水龜發(fā)病的主要原因[3]。目前,有關龜類的病害防治受到重視,不同癥狀的龜類其病原菌的鑒定結果不同。王苗等[4]曾在草龜身上分離出一株致病菌,經(jīng)鑒定結果為維氏氣單胞菌的一株;時少坤等[5]于患有紅脖子病黃喉擬水龜中分離到嗜水氣單胞菌。已有相關報道表明維氏氣單胞菌已逐漸成為威脅人類健康的重要病原菌[6],維氏氣單胞菌可污染畜禽等肉類、水產(chǎn)品、人,可引發(fā)人患胃腸炎、腹膜炎、腦膜炎、敗血癥、泌尿道和外傷感染。國內(nèi)外對維氏氣單胞菌的研究與其他人畜共患的病原菌相比并不成熟[7]。廣東省深圳市福田區(qū)某養(yǎng)殖場患病龜主要癥狀有食欲不振、精神萎靡、行動遲緩、眼睛腫大、充血、全身或局部感染、排便增多、水便、急性腹瀉等,身體伴有明顯異味。筆者對從原始發(fā)病黃喉擬水龜?shù)姆?、脾臟、肝臟中進行病原菌分離,經(jīng)生理生化試驗、16S rDNA序列分析動物回歸感染試驗判斷其生物學地位及致病性,并通過藥敏試驗分析病原菌的藥物敏感性,以期為控制該病原菌感染和致病機理研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料對廣東深圳某養(yǎng)龜場患病黃喉擬水龜采樣并采購同一養(yǎng)殖場的健康黃喉擬水龜(體重80～90 g),實驗室條件下飼養(yǎng)15 d確定健康后用于回歸感染試驗。

革蘭氏染色試劑盒、培養(yǎng)基、細菌生理生化鑒定試劑盒、藥敏試劑盒購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;分子生物學測序鑒定分析由華大基因科技有限公司完成。

1.2 病原菌的分離純化無菌條件下,從肺、脾臟、肝臟病灶組織進行細菌分離純化,在營養(yǎng)瓊脂(NA)培養(yǎng)基上劃線[8],28 ℃過夜培養(yǎng),挑取生長良好、形態(tài)規(guī)格一致且數(shù)量多的菌落進行傳代培養(yǎng),并進行后續(xù)鑒定分析。

1.3 病原菌的鑒定

1.3.1革蘭氏染色。挑取單克隆菌落涂布在滴有無菌生理鹽水的載玻片上,自然風干,在酒精燈火焰上固定加熱。按照革蘭氏染色試劑盒說明書進行染色觀察。

1.3.2生理生化鑒定。生理生化試驗按照環(huán)凱科細菌生化編碼鑒定管試劑盒說明書進行。

1.3.3細菌16S rDNA鑒定。用CTAB法提取單克隆菌落的DNA,利用華大基因科技有限公司合成的16S rDNA通用引物27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)、1492R(GGTTACCTTGTTACGACTT)。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測[4],隨后將PCR產(chǎn)物送至華大基因科技有限公司進行序列測定。

1.3.4構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。利用NCBI的BLAST功能進行測序獲得的16S基因比對分析并進行系統(tǒng)進化樹構建。

1.4 病原菌藥敏試驗將目標病原菌畫線接種于NA培養(yǎng)基,28 ℃過夜培養(yǎng)至穩(wěn)定期,挑取3～5個菌落于1 mL滅菌生理鹽水,振蕩均勻,用無菌棉簽沾取菌液均勻涂布于MH固體培養(yǎng)基中,每個平板均勻貼布5片藥敏片,28 ℃培養(yǎng)箱過夜后觀察并測量,根據(jù)說明書對比抑菌圈的直徑來判斷對抗生素的敏感程度。

1.5 病原菌感染試驗試驗龜用無菌生理鹽水清洗。將已培養(yǎng)至穩(wěn)定期病原菌株,用分光光度計進行菌液濃度測定,并根據(jù)陸專靈等[9]的方法用無菌磷酸鹽(PBS)緩沖液將菌液稀釋成109、108、107、106、105、104、103CFU/mL 7個梯度,腹腔注射龜體,每組8只,每只100 μL,對照組注射等量PBS緩沖液100 μL,接種后觀察龜?shù)陌l(fā)病情況,并分離鑒定病原菌和重復感染試驗。

2 結果與分析

2.1 患病黃喉擬水龜剖檢自然患病黃喉擬水龜腹甲腫脹,剖檢后體內(nèi)肝臟充血變脆并伴有腐臭,脾、腸道等器官充血(圖1)。

注:a.健康未感染龜;b.脾臟充血;c.肝臟腫脹變脆;d.肺部出血;e.肺部腫大;f.消化道充血。Note:a. Healthy, uninfected turtles; b.Hyperemia of the spleen;c.The liver becomes swollen and brittle;d.Bleeding in the lungs;e.Lung enlargement; f.Hyperemia of the digestive tract.圖1 患病死亡黃喉擬水龜剖檢Fig.1 Necropsy of diseased and dead Mauremys mutica

2.2 生理生化鑒定從患病黃喉擬水龜病灶分離純化出數(shù)量最多、長勢最好的菌株,命名為GZW01;革蘭氏染色結果顯示為桿狀,革蘭氏陰性菌(圖2),在普通固體瓊脂培養(yǎng)基上形成圓形,光滑,邊緣整齊,灰白色菌落(圖3)。

圖2 分離菌株革蘭氏染色Fig.2 Gram staining of isolated strain

圖3 菌落形態(tài) Fig.3 Colonial morphology

將分離純化后的單菌落接種于生化鑒定管,37 ℃培養(yǎng)24～48 h后進行觀察(不同項目培養(yǎng)時間不同,需參照說明書),菌株GZW01的VP試驗、MR試驗陽性,3% NaCl三糖鐵試驗顯示不能產(chǎn)生硫化氫,能分解蔗糖、葡萄糖;氧化酶陽性;覃糖、1% NaCl甘露醇、1%NaCl甘露糖、1%NaCl肌醇反應結果呈陽性等生理生化特性(表1)與《伯杰氏細菌鑒定手冊》中關于維氏氣單胞菌的鑒定結果相同[10]。將測序序列在NCBI進行同源比對顯示與維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)同源性達99%(圖4)。綜上結果,菌株GZW01可鑒定為維氏氣單胞菌。

表1 分離菌株GZW01的生理生化特征

圖4 基于16S rDNA序列的維氏氣單胞菌GZW01的系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.4 Phylogenetic evolution tree of Aeromonas vibrio GZW01 based on 16S rDNA sequences

2.3 病原菌藥敏試驗GZW01分離菌株對抗生素(35種)敏感性結果(表2)顯示,菌株對慶大霉素、紅霉素、氧氟沙星、氨曲南等藥物高度敏感,數(shù)量為28種;對克拉霉素藥物中度敏感;對青霉素G、苯唑西林、氨芐西林、四環(huán)素、萬古霉素、克林霉素耐受。

表2 GZW01藥敏試驗

2.4 病原菌感染試驗腹腔注射菌株GZW01,攻毒7 d后各組黃喉擬水龜死亡情況如表3所示。根據(jù)蘭云等[10]的方法計算出7 d半致死濃度(LD50)為3×107CFU/mL。

表3 菌株GZW01對健康黃喉擬水龜感染試驗結果

3 結論與討論

該研究從患病龜?shù)母?、脾等組織分離出優(yōu)勢菌株后,經(jīng)16S rDNA序列比對和生理生化鑒定相互佐證,并構建系統(tǒng)發(fā)育樹,鑒定結果表示GZW01為維氏氣單胞菌的一株;在回歸感染試驗中,菌株感染黃喉擬水龜后的發(fā)病癥狀與養(yǎng)殖場原始患病龜癥狀相同,因此可判斷該菌(GZW01)是引起黃喉擬水龜突發(fā)死亡的主要致病菌。該研究回歸感染維氏氣單胞菌,其LD50為3×107CFU/mL,說明該菌對黃喉擬水龜具有較強致病力。

該研究分離的維氏氣單胞菌(A.veronii)對青霉素G、苯唑西林、氨芐西林、四環(huán)素、萬古霉素、克林霉素6種藥物耐受,可能與水體污染有關。此外,高度敏感的抗生素有紅霉素、復方新諾明、氧氟沙星、氨曲南、慶大霉素、麥迪霉素等28種,因此,抗生素用藥有了更多選擇。不同地區(qū)來源的細菌對抗生素耐藥性有所不同,這有可能與菌株來源有關[11]。維氏氣單胞菌是近年來新發(fā)現(xiàn)的人畜魚共患病原菌之一,廣泛分布于淡水、咸水、淤泥等各個水域。當A.veronii感染水生動物可引發(fā)潰瘍、內(nèi)臟充血腫大和腹水等,會對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。人接觸或食用了未消毒或加熱不夠徹底的水產(chǎn)品時,極易感染,其癥狀多表現(xiàn)為腹瀉、發(fā)熱,嚴重可導致人腦膜炎和敗血癥等。有研究表明維氏氣單胞菌會感染養(yǎng)殖經(jīng)濟魚類[7];有研究者從患病草魚肝臟中分離到的一株維氏氣單胞菌具有很強的溶血毒性,高致死率[12];另外,也有報道貴州曾發(fā)現(xiàn)一起草龜突發(fā)性死亡,通過細菌分離和鑒定發(fā)現(xiàn)為致病性維氏氣單胞菌[4]。以上報道暴發(fā)時間在9月,該研究發(fā)現(xiàn)此次暴發(fā)與之前報道時間相近,夏季水溫、天氣和水質(zhì)等因素[13]突變影響,增加了細菌感染[14]及疾病暴發(fā)概率。在此次研究試驗中發(fā)現(xiàn),維氏氣單胞菌對營養(yǎng)生存環(huán)境需求極低,在27～28 ℃生長較為活躍,且在低溫下也能保持緩慢增長。因此,該菌對水體以及水生動物的感染并不完全受控于氣候和天氣。

目前水產(chǎn)養(yǎng)殖中,細菌感染常呈現(xiàn)集中高暴發(fā)性,原則上抗生素是應對細菌性疾病的極有效方法,然而與人體一樣,濫用抗生素會導致水產(chǎn)動物耐藥性增強,水環(huán)境不均衡,細菌也會出現(xiàn)高耐藥性的變異,因此在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中,原則上應結合不同來源菌株的藥敏試驗結果,合理選取抗生素,盡量減少多重耐藥性菌株的產(chǎn)生?？股貢谒鷦游矬w內(nèi)殘留,并對養(yǎng)殖水體和環(huán)境具有一定的破壞[15-16]。國內(nèi)外學者為了預防和控制A.veronii,開發(fā)了口服疫苗、滅活疫苗和DNA疫苗等[17]。雖然,多種疫苗有一定的免疫效果,但仍處于實驗室研發(fā)階段,針對不同宿主來源的病原缺乏充分的預防和控制能力。因此不同地區(qū)的病例要結合藥敏特性試驗結果對癥下藥,也應加強無殘留、無耐藥性的替代品的研發(fā)以取代抗生素,為全國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的科學健康發(fā)展提供依據(jù)。該試驗中的患病黃喉擬水龜并非有年齡限制,成年龜與幼龜均存在,由于物種的特殊性,黃喉擬水龜一旦暴發(fā)嚴重的細菌性疾病,將對養(yǎng)殖戶造成金錢與時間上的巨大損失,因此對維氏氣單胞菌的有效防治藥品的研發(fā)刻不容緩。