蘇 艷,楊寶明,楊超振,李永平,李迅東,尹可鎖

1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部花卉產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(昆明)/國(guó)家觀賞園藝工程技術(shù)研究中心/云南云科花卉有限公司,云南昆明 650100;2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所/云南省農(nóng)業(yè)跨境有害生物綠色防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南昆明 650205;3.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱區(qū)生態(tài)農(nóng)業(yè)研究所,云南元謀 651300)

仙茅(CurculigoorchioidesGaertn.)為石蒜科(Amaryllidacean)仙茅屬(CurculigoGaertn.)多年生草本植物,野生資源主要分布于四川、貴州、云南、廣西、廣東等省區(qū)[1-2]。仙茅以根莖入藥,藥用歷史悠久,為我國(guó)傳統(tǒng)中藥材,具有藥用和開發(fā)利用價(jià)值[3-5]。近年來,隨著對(duì)仙茅藥用價(jià)值的深入了解及開發(fā)利用的增加,市場(chǎng)需求量逐漸加大。然而,仙茅尚未形成規(guī)?；斯しN植,主要依賴挖掘野生資源,導(dǎo)致野生資源遭到嚴(yán)重破壞,瀕臨枯竭。開展仙茅組織培養(yǎng)技術(shù)研究,既可保護(hù)野生自然資源,又可為大規(guī)模人工種植提供優(yōu)良種苗,實(shí)現(xiàn)野生資源的合理開發(fā)利用。

關(guān)于仙茅的組織培養(yǎng)研究較少,張萍等[5-6]用莖段,張虹等[7-9]、羅春梅等[10-11]、鄒璐等[12-13]、王任翔等[14]、彭海峰等[15]和吳果團(tuán)[16]都是用幼葉,在外植體的選擇上主要集中在葉片和莖方面。利用細(xì)胞全能性在控制嚴(yán)格的條件下培育出來的新個(gè)體,對(duì)技術(shù)和環(huán)境設(shè)備要求較高,而種子作為外植體具有易獲得數(shù)量較多的外植體、耐消毒、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì),但有關(guān)種子作為外植體方面的組織培養(yǎng)研究尚未見報(bào)道。筆者以仙茅未成熟種子為外植體,通過愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽分化實(shí)現(xiàn)植株再生,以期為仙茅組培快繁技術(shù)提供了一種新方法。

1 材料與方法

1.1 材料仙茅采自云南玉溪市易門縣浦貝彝族鄉(xiāng)草箐村。

1.2 方法

1.2.1外植體選擇。晴天,選擇生長(zhǎng)健壯、長(zhǎng)勢(shì)良好無病蟲害植株未成熟種子。

1.2.2外植體滅菌。自來水下將種子表面沖洗干凈,然后在無菌工作臺(tái)內(nèi),先用75%乙醇溶液浸種子30 s,再用0.1%的氯化汞溶液滅菌6～8 min,用無菌水沖洗3～4次,無菌濾紙吸干表面水分備用。然后用手術(shù)刀去除種皮。

1.2.3培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件。分為A組(愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基)和B組(不定芽分化培養(yǎng)基)(表1)。A1,MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L;A2,MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L;A3,MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L;A4,MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L;A5,MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L;A6,MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L;A7,MS+6-BA 3.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L;B1,MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L;B2,MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L;B3,MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L;B4,MS+6-BA 2.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L;B5,MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L;B6,MS+KT 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L;B7,MS+KT 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L;B8,MS+KT 3.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L。

表1 不同處理對(duì)愈傷組織的影響

以上培養(yǎng)基均為MS+蔗糖30 g/L+瓊脂5 g/L;培養(yǎng)基pH 5.8～6.0;培養(yǎng)室溫度(25±2)℃;光照時(shí)間12 h/d;光照強(qiáng)度1 600～2 000 lx。

1.2.4愈傷組織誘導(dǎo)。用手術(shù)刀去除種皮,接種到A組培養(yǎng)表面,每處理接種3瓶,每瓶接種3粒種子,3次重復(fù)。接種10 d后,每隔10 d觀察一次生長(zhǎng)情況,40 d后統(tǒng)計(jì)出愈率。

1.2.5不定芽分化。將培養(yǎng)得到的愈傷組織切割成0.5 cm2左右的小塊,接種到B組培養(yǎng)基中,每處理接種3瓶,每瓶接種1塊,3次重復(fù)。每隔10 d觀察一次生長(zhǎng)情況,30 d后統(tǒng)計(jì)不定芽分化率。

1.3 數(shù)據(jù)分析利用Excel對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。出愈率=分化成愈傷組織的外植體數(shù)/外植體接種數(shù)×100%;增殖系數(shù)=愈傷組織產(chǎn)生的不定芽數(shù)/接種愈傷組織數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織的誘導(dǎo)及生長(zhǎng)情況從表1可以看出,A組7種不同濃度的6-BA和NAA愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基,經(jīng)差異性分析P=1.976 95E-06<0.05,達(dá)顯著水平,說明A組7種誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)及生長(zhǎng)情況存在顯著差異。7種不同濃度的6-BA和NAA配合使用,可以影響愈傷組織的誘導(dǎo)及愈傷組織的質(zhì)量。6-BA和NAA 7個(gè)濃度誘導(dǎo)培養(yǎng)基與出愈率之間的相關(guān)系數(shù)達(dá)0.953 432 844,說明6-BA和NAA濃度與出愈率之間呈良好的正相關(guān),由此可知,6-BA和NAA濃度的增加,愈傷組織誘導(dǎo)率也隨之提高,出愈時(shí)間縮短,出愈量加大。高濃度的6-BA和NAA配合施用,更有利于愈傷組織的誘導(dǎo)。在相同6-BA濃度下,NAA 0.5 mg/L(平均出愈率62%)的誘導(dǎo)效果明顯優(yōu)于NAA 0.2 mg/L(平均出愈率48%)。當(dāng)6-BA濃度為3.5 mg/L、NAA濃度為0.5 mg/L時(shí),出愈量最大,出愈率最高,達(dá)81%,但存在愈傷組織水漬狀、質(zhì)地松散等問題,不利于不定芽的分化。因此,愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基以A6(MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L)較好。

2.2 6-BA和KT對(duì)不定芽分化及增殖的影響對(duì)B組8種不同濃度的6-BA、KT和0.2 mg/L NAA不定芽分化培養(yǎng)基進(jìn)行處理,經(jīng)差異性分析P= 0.001 308 535(<0.05),達(dá)顯著水平,說明B組8種培養(yǎng)基對(duì)不定芽分化及增殖的影響存在顯著差異。表明不同濃度6-BA、KT與0.2 mg/L NAA配合施用,均能使愈傷組織分化出不定芽。不定芽分化數(shù)量和時(shí)間,隨著6-BA和KT濃度的增加而提高。當(dāng)6-BA濃度達(dá)2.5 mg/L時(shí),不定芽的分化數(shù)量降低,說明高濃度的6-BA對(duì)不定芽的分化和形成有抑制作用。另外,6-BA對(duì)不定芽的分化和形成的促進(jìn)作用優(yōu)于KT,不定芽分化早,生長(zhǎng)快,增殖系數(shù)高,提早3～5 d分化出苗,其中以MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L的培養(yǎng)基,不定芽分化最早,增殖系數(shù)達(dá)11.7%(表2)。其增殖培養(yǎng)效果見圖1。

圖1 仙茅增殖培養(yǎng)效果Fig.1 Proliferation culture effect of Curculigo orchioides Gaertn.

表2 不同處理對(duì)不定芽分化及增殖的影響

3 討論

誘導(dǎo)愈傷組織成敗的關(guān)鍵是所使用激素成分和濃度。生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素對(duì)誘導(dǎo)愈傷組織的產(chǎn)生及促進(jìn)迅速生長(zhǎng)是必需的[17]。在愈傷組織誘導(dǎo)中,當(dāng)6-BA和NAA濃度配比發(fā)生變化時(shí),誘導(dǎo)出的愈傷組織數(shù)量和質(zhì)量也隨之改變。愈傷組織的數(shù)量和質(zhì)量,隨著6-BA和NAA濃度的增加而提高。當(dāng)6-BA濃度為3.5 mg/L、NAA濃度為0.5 mg/L時(shí),出愈率最高,達(dá)81%,但愈傷組織呈水漬狀,質(zhì)地松散,說明激素濃度偏高;在不定芽的分化培養(yǎng)中,在相同濃度情況下,添加6-BA的處理較KT的處理,平均提早3～5 d分化出不定芽,增殖系數(shù)高,最高增殖系數(shù)達(dá)11.7,說明6-BA的促進(jìn)作用大于KT。當(dāng)6-BA濃度達(dá)2.5 mg/L時(shí),不定芽的分化數(shù)量降低,說明6-BA濃度偏高,抑制了不定芽的分化和形成,導(dǎo)致高頻率的變異[18-21]。

外源激素的種類和濃度對(duì)植物器官的脫分化和再分化起決定性的作用。激素的種類、濃度和組合配比,是直接影響愈傷組織誘導(dǎo)、愈傷組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)以及不定芽分化的關(guān)鍵因素。不同的愈傷組織類型,其分化能力均不相同,只有質(zhì)地致密的愈傷組織才具有較強(qiáng)的分化能力[22]。

在仙茅的組織培養(yǎng)及快繁體系構(gòu)建中,褐變現(xiàn)象是一個(gè)主要問題,影響褐變現(xiàn)象的因素很多,但酚污染是主要原因之一,在組織培養(yǎng)過程中,損傷細(xì)胞中酚類物質(zhì)被氧化成醌,變成棕褐色或暗褐色而發(fā)生褐變[23]。此外,黑暗培養(yǎng)有利于減輕仙茅外植體的酚污程度[24-25]。下一步將進(jìn)一步研究不同方法對(duì)仙茅未成熟種子愈傷組織誘導(dǎo)組培褐變的影響,更有效地減輕外植體的褐變現(xiàn)象。

4 結(jié)論

該試驗(yàn)結(jié)果表明,仙茅未成熟種子的最佳愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L,出愈率為74%;最佳不定芽分化培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L,平均增殖系數(shù)達(dá)11.7。