唐光甫,滿海喬,趙杰宏,韓 潔

(貴州中醫(yī)藥大學/貴州省中藥生藥學重點實驗室,貴州貴陽 550025)

紅曲霉的生產和應用在我國及許多亞洲國家有著悠久的歷史,被廣泛用于食品添加劑、葡萄酒工業(yè)和醫(yī)療保健等方面[1]。紅曲霉在生長過程中能夠產生多種具有生物活性的次級代謝產物,主要有紅曲色素、洛伐他汀和γ-氨基丁酸[2-6]。紅曲色素具有抗菌、抗腫瘤和抗氧化功能等生物活性[7-9],可以取代部分亞硝酸鹽被用于肉制品中抑制細菌生長[10]。洛伐他汀是HMG-CoA還原酶抑制劑,已被FDA批準用于高脂血癥的治療,還作為紫杉醇治療前列腺癌細胞的化學增敏劑[11]。但是,紅曲霉在發(fā)酵過程中也會生產一種真菌毒素-桔霉素,其具有肝毒性、腎毒性、致癌和致畸作用[12-14],嚴重制約了紅曲產業(yè)的發(fā)展。

目前,為了有效抑制紅曲霉在發(fā)酵過程中桔霉素的積累,增加有益次級代謝產物的產生,國內外學者分別從菌種選育、發(fā)酵條件優(yōu)化、分子調控等方面進行研究,并取得了重要進展。Zhen等[15]在發(fā)酵液中添加0.2 mol/L的NaCl能顯著降低桔霉素的含量,并增加色素和洛伐他汀(Monacolin K)的產量。Hajjaj 等[16]利用同位素標記法深入探討了13C在桔霉素中的部分生物合成途徑,結果表明桔霉素和紅曲色素均由聚酮類生物合成途徑產生,前期均由1分子乙酰CoA 和3分子丙二酰CoA在 PKS酶的催化作用下形成四酮體,隨后分開,一條途徑與乙酰CoA縮合,通過甲基化、縮合、還原、甲氧基化、還原、氧化和脫水等步驟最終形成桔霉素;另一條路徑是4個酮基的聚酮鏈與丙二酰輔酶A 縮合,形成紅曲色素中間產物,然后經過一系列步驟最終形成紅曲色素。目前桔霉素的合成調控網絡還有很多步驟不清楚。

基因Mrr2是紅曲霉中一個功能未經試驗證實的基因,編碼一種變位酶,推測在紅曲霉代謝調控中有重要作用。該研究采用農桿菌介導遺傳轉化獲得Mrr2過表達菌株,分析Mrr2基因對紅曲霉中桔霉素合成的影響,初步證實Mrr2是紅曲霉中桔霉素合成的重要調控基因。

1 材料與方法

1.1 菌株和試劑紫色紅曲霉(Monascuspurpureus)菌株由貴州中醫(yī)藥大學生藥學實驗室提供。桔霉素標準品購自北京TM standard公司;Genegreen核酸染料、FastKing一步法除基因組cDNA 第一鏈合成預混試劑和Talent熒光定量檢測試劑盒購自北京天根生化科技有限公司;柱式真菌總RNA抽提純化試劑盒購自上海生工生物工程有限公司。Taq酶購自北京索萊寶科技有限公司;Mrr2 (GenBank: KT781075)過表達載體pGUS-Mrr2(含PgpdA-GUS-Mrr2-Tnos表達框)由武漢淼靈生物構建。

1.2Mrr2基因序列分析利用Primer 5 plus設計Mrr2引物序列(表1),PCR擴增產物送北京六合華大基因公司測序驗證。使用在線工具(http://linux1.softberry.com/berry.phtmL)預測Mrr2編碼的氨基酸序列。用BLAST程序中的CD-search (http:// https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)預測Mrr2的功能。用MEGA 11進行同源性分析。

表1 PCR及RT-qPCR檢測引物

1.3 農桿菌介導遺傳轉化將pGUS-Mrr2經凍融法轉化農桿菌AGL1感受態(tài),涂布在含50 mg/L 卡那霉素抗生素的固體LB培養(yǎng)基上篩選,對抗性單菌落進行PCR檢測。將獲得的陽性菌株在含50 mg/L 卡那霉素抗生素的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng),取菌液離心去除上清,用IM培養(yǎng)基稀釋至OD600值為0.15～0.20,再在相同條件下培養(yǎng)4～6 h,至其OD600值為0.6～0.8。用農桿菌菌液稀釋紅曲霉孢子至10個/mL,取200 μL涂布于鋪有0.45 μm硝酸纖維素膜的Co-IM平板上。25 ℃暗培養(yǎng)3 d,將長出的紅曲霉菌落和硝酸纖維素膜一起揭下,倒置在含20 mg/L潮霉素和300 mg/L頭孢霉素的培養(yǎng)基上篩選。待農桿菌無生長后揭下硝酸纖維素膜,挑取抗性紅曲霉單菌落,利用Hyg和GUS引物(表1)進行PCR檢測,對菌絲體進行GUS染色驗證。

1.4 色素和洛伐他汀的檢測將野生菌株(WT)和過表達菌株(Mrr2-1、Mrr2-2)的孢子懸液接種在沙氏液體培養(yǎng)基中,于28 ℃、140 r/min振蕩培養(yǎng)14 d。過濾收集菌絲體,45 ℃干燥后粉碎。測定紅曲色素時精密稱取0.100 g菌絲體粉末于10 mL具塞試管中,加入10 mL 70%乙醇搖勻,60 ℃水浴1 h,取出冷卻后補足至10 mL,過濾,將續(xù)濾液倒入25 mL容量瓶中定容,在410、465和 505 nm處分別測定黃、橙、紅色素,并計算色價:色價(U/g)=吸光度×稀釋倍數(shù)×浸提溶劑體積/樣品質量。測定洛伐他汀時取1 mL發(fā)酵液于50 mL三角瓶中,加入9 mL 70%乙醇混勻。放入28 ℃恒溫振蕩器140 r/min振蕩1 h后取出,加入2 mL離心管中,以4 200 r/min 離心5 min,取上清液,測定237 nm處吸光度來判斷洛伐他汀含量。

1.5 桔霉素測定精密稱取0.15 g干燥菌絲體加入10 mL甲醇,超聲處理30 min后,70 ℃水浴1 h,用0.45 μm 濾膜過濾。色譜條件:C18柱 (4.6 mm×150 mm,5 μm),流動相為2% 醋酸水(磷酸溶液調節(jié) pH至 2.5)∶乙腈=46∶54,流速1.0 mL/min;柱溫28 ℃;檢測器為PDA二極管陣列檢測器。檢測波長330 nm,進樣量20 μL。

1.6 熒光定量檢測按照試劑盒說明書提取液態(tài)培養(yǎng)14 d的紅曲霉菌株的RNA,參照SYBR Green試劑盒進行RT-qPCR分析。用于基因表達分析的特異性基因CtnA(GenBank:AB243687)、CtnC(GenBank:AB243687)、CtnD(GenBank:EU309474)、CtnE(GenBank:EU309474)、Mrr2、pksPT(GenBank: JF832916)、MpigE(GenBank: KF285431)、Actin(AJ417880)如表1所示。qPCR 反應體系包括2 μL cDNA模板、10 μL 2×Talent qPCR PreMix、0.6 μL 10 μmol/L的正反向引物,ddH2O補足至20 μL。使用StepOne軟件(ABI Applied Biosystems,USA)分析表達數(shù)據,采用 2-ΔΔCt法計算相對于內參基因Actin的轉錄水平。

1.7 數(shù)據統(tǒng)計及顯著性分析試驗數(shù)據以Graghpad prism軟件分析,以“平均值±標準偏差”(Mean±SD)表示。分析方法為單因素方差分析、多重比較、Turkey檢驗。

2 結果與分析

2.1Mrr2基因克隆和序列分析從紫色紅曲霉基因組中擴增了一個1 428 bp的DNA片段。Softberry在線工具分析Mrr2序列由5個開放閱讀框(ORF)和4個內含子組成(圖1 A)。CD-search預測Mrr2結構域發(fā)現(xiàn),Mrr2屬于(HP) super-family (HP_PGM_like),HP超家族結構域的保守催化核心是His殘基,在反應過程中被磷酸化。主要包括輔助因子依賴和輔助因子獨立的磷酸甘油酸變位酶(分別為dPGM和BPGM)、果糖-2,6-二磷酸酶(F26BP)、Sts-1、SixA和相關蛋白。利用MEGA 11軟件進行同源性分析(圖1 B)發(fā)現(xiàn),Mrr2與M.ruber預測序列mrr2的同源性達100%,與Aspergillusclavatus的未知序列相似性達83.23%。

圖1 Mrr2基因的序列結構(A)和同源性(B)分析Fig.1 Sequence structure (A) and homology (B) analysis of the Mrr2 gene

2.2Mrr2過表達菌株的獲得過表達載體pGUS-Mrr2包含Mrr2與GUS形成的融合基因,經凍融法轉化農桿菌AGL1感受態(tài),對抗性平板上的農桿菌菌落進行PCR檢測,得到抗性菌落,再與紫色紅曲霉孢子懸液共培養(yǎng),獲得的抗性紅曲霉菌株轉接到含有潮霉素和頭孢霉素的平板上進行篩選,對陽性紅曲霉菌株及野生型的菌絲體進行GUS染色分析,可以清晰看到菌絲細胞內容物呈藍色,而野生型細胞為透明無色或淡黃色(圖2),表明轉基因菌株能夠正常表達GUS基因。利用Hyg和GUS引物進行PCR驗證,均能擴增出正確的目的片段(圖3),表明獲得了轉化成功的紅曲霉菌株。對過表達菌株連續(xù)傳代5次,能夠穩(wěn)定遺傳,表明抗性菌株具有良好的穩(wěn)定性。與野生菌株相比,過表達Mrr2的紅曲霉菌株菌落直徑較大,色素分泌偏多,氣生菌絲蓬松、濃密且長(圖4)。但后期區(qū)分不明顯,可能是隨著時間的延長,營養(yǎng)物質被消耗。推測Mrr2過表達以后能夠促進紅曲霉的生長。

圖2 野生型菌株(A)和過表達菌株(B)的GUS染色Fig.2 GUS staining of wild-type strain (A) and overexpressed strain (B)

注:M為DL1000 DNA Marker;1～8為過表達菌株。Note:M represents DL1000 DNA Marker; 1-8 are overexpressed strains.圖3 Hyg(A)和GUS(B)引物PCR檢測Fig.3 Hyg (A) and GUS (B) primer PCR detection

注:WT為野生菌株;Mrr2-1、Mrr2-2為過表達菌株。Note: WT is a wild strain; Mrr2-1 and Mrr2-2 are overexpressed strains.圖4 Mrr2過表達紅曲霉菌株的菌落特征Fig.4 Colony characteristics of Monascus strain overexpressed with Mrr2

2.3 色素和桔霉素分析采用HPLC檢測桔霉素含量,與野生型菌株相比,胞內桔霉素產量增加了65%～151%,Mrr2過表達的菌株內紅、黃、橙3種色素分別增加了20%～25%、14%～15%和12%～42%,胞外洛伐他汀含量有顯著增加(圖5～6)。胞外桔霉素略有增加,可能是發(fā)酵時間延長,部分菌體自溶,導致胞內桔霉素釋放到發(fā)酵液中的原因。

圖6 過表達菌株胞內外化學成分的檢測Fig.6 Detection of intracellular and extracellular chemical components of overexpressed strains

2.4 RT-qPCR分析為了檢測Mrr2及其他桔霉素代謝相關基因的轉錄水平變化,經RT-qPCR分析結果顯示,過表達菌株中Mrr2的轉錄表達量明顯成倍增加,與桔霉素合成相關的CtnA、CtnD、CtnE、pksPT以及色素相關基因MpigE的轉錄有明顯增加(圖7),表明Mrr2的高表達引起其他桔霉素和色素合成相關基因的表達變化。

圖7 Mrr2過表達菌株的RT-qPCR檢測Fig.7 RT-qPCR detection of Mrr2 overexpressed strains

3 討論與結論

桔霉素是一種由不同種類的曲霉、青霉和紅曲霉菌等產生的真菌毒素[17],對人和動物都有肝腎毒性和基因毒性作用,對人類和動物健康構成了嚴重的風險,引起了人們對食用污染食物和飼料的擔憂。因此研究桔霉素的合成調節(jié)機制對于消減和防控桔霉素污染有重要意義。

2010年,Jia等[18]通過農桿菌介導的轉化成功破壞了紫色紅曲霉SM001中的pksCT基因,導致該菌株基本喪失了產生桔霉素的能力。同樣CtnB突變體也幾乎不產生桔霉素[19],但是CtnG基因的破壞在降低了桔霉素的同時也降低了色素的產生[20]。用去除內含子的mpl6和mpl7共轉化攜帶pksCT、npgA、mpl1、mpl2和mpl4的畢赤酵母菌株,在甲醇誘導下成功生產出桔霉素[21]。此外,G蛋白Gα亞基基因(Mga1)、Gβ亞基基因(Mgb1)或Gγ亞基基因(Mgg1)的破壞增強了M.ruber中桔霉素和色素的生成[22-23]。然而,mrskn7基因突變株在M.ruber中或Ash2基因突變株在M.purpu-reus中產生的真菌毒素較少[24-25]。以上研究為后續(xù)篩選高產莫納可林K、低產桔霉素的紅曲霉菌株提供理論依據[26]。而至今對桔霉素的合成調控網絡依然沒有研究清楚。

紅曲霉Mrr2基因是一個功能未知的變位酶基因,推測在紅曲霉代謝調控中有重要作用,為研究紅曲霉Mrr2基因對桔霉素合成的影響,該研究通過農桿菌轉化獲得了Mrr2過表達的紅曲霉菌株。與野生型的次級代謝產物和菌落形態(tài)相比較,發(fā)現(xiàn)過表達Mrr2基因對桔霉素的合成有促進作用,增加了桔霉素和色素的胞內積累,胞外洛伐他汀含量也明顯增加。過表達菌株的菌落顏色較野生型轉色快,菌絲蓬松且致密。RT-qPCR結果顯示,過表達Mrr2對CtnA、CtnD、CtnE、pksPT、MpigE的轉錄有一定的促進作用,初步證明了過表達Mrr2對桔霉素的合成有正向調控作用,為豐富和完善桔霉素的合成調控途徑提供理論依據,對紅曲產品的安全生產具有一定的指導意義。