■ 劉莉莉 陳 敏

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040）

哺乳動物乳汁是最適合新生動物健康生長發(fā)育的天然營養(yǎng)物，乳汁含有豐富的蛋白質(zhì)和脂肪，這些乳營養(yǎng)成分的合成與乳腺上皮細(xì)胞一些重要功能基因及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控密切相關(guān)。乳蛋白主要由酪蛋白和乳清蛋白組成，其中酪蛋白約占乳蛋白的80%，故其含量的高低常作為評價乳汁營養(yǎng)價值的重要指標(biāo)。雷帕霉素靶點(diǎn)（mTOR）信號途徑以及酪氨酸激酶2/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子5（JAK2/STAT5）信號途徑主要調(diào)控乳蛋白的合成，而且mTOR 信號通路與JAK2/STAT5信號通路可相互影響協(xié)同調(diào)控乳蛋白的合成[1]。乳脂的主要成分是三酰甘油，主要由脂肪酸和磷酸甘油在乳腺上皮細(xì)胞中合成。過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARG）和固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子1（SREBF1）是乳脂肪合成與分泌過程中最重要的兩個調(diào)控因子，在乳脂肪合成基因網(wǎng)絡(luò)中處于樞紐位置，二者可通過結(jié)合靶基因，影響乳腺對脂肪酸的攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)、從頭合成和酯化過程[2]。

提高乳質(zhì)量及泌乳量是目前哺乳動物亟待解決的重要問題，天然藥用植物及其提取物具有低毒、無殘留、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，用于增乳有其獨(dú)特優(yōu)勢。研究發(fā)現(xiàn)低劑量葛根素能增強(qiáng)小鼠乳腺乳蛋白和乳脂肪合成相關(guān)蛋白表達(dá)，提升乳品質(zhì)[3]。槲皮素可以改善乳質(zhì)量，提高小鼠乳蛋白、乳糖和乳脂肪合成相關(guān)基因的表達(dá)[4]。β-谷甾醇作為一種植物甾醇，是很多藥用植物的重要組成成分。臨床試驗(yàn)研究證實(shí)β-谷甾醇具有降膽固醇、降血糖、抗氧化、抗炎、抑菌和抗癌等多種生物活性。此外，研究發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇還可通過雌激素受體途徑調(diào)節(jié)下游靶基因的表達(dá)而發(fā)揮植物雌激素樣活性的作用[5-6]。植物雌激素是許多植物中的天然化學(xué)成分，結(jié)構(gòu)類似于雌激素17-β-雌二醇，可以與動物雌激素受體結(jié)合，發(fā)揮雌激素樣活性[7]。許多增乳藥用植物的活性成分中含有植物雌激素，其可通過調(diào)節(jié)泌乳相關(guān)激素的活性，促進(jìn)乳腺發(fā)育，進(jìn)而影響動物泌乳性能。然而關(guān)于β-谷甾醇對小鼠乳腺上皮細(xì)胞（HC11）乳蛋白、乳脂肪的合成是否有影響尚未見報(bào)道。

本研究以HC11 細(xì)胞為模型，采用MTT 法檢測不同濃度β-谷甾醇對HC11細(xì)胞增殖能力的影響，qRTPCR 技術(shù)檢測β-谷甾醇作用的HC11 細(xì)胞中乳蛋白和乳脂肪合成相關(guān)基因的表達(dá)情況，為探討β-谷甾醇對HC11細(xì)胞乳蛋白和乳脂肪合成的調(diào)節(jié)機(jī)理提供理論基礎(chǔ)，為利用天然植物活性成分提高哺乳動物乳品質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠乳腺上皮細(xì)胞（HC11）購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

β-谷甾醇購自成都瑞芬思生物科技有限公司；MTT 法細(xì)胞活力檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；RPMI-1640 干粉、胎牛血清（FBS）購自Gibco 公司；Trizol 購自Invitrogen 公司；Prime ScriptTMRT reagent Kit 試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒購自TaKaRa公司。

1.2 HC11細(xì)胞的培養(yǎng)

37 ℃、5% CO2培養(yǎng)條件下，利用生長培養(yǎng)基（RPMI-1640+10% FBS）培養(yǎng)HC11 細(xì)胞，每隔24 h 更換新鮮培養(yǎng)基。

1.3 β-谷甾醇對HC11細(xì)胞活力影響的檢測

試驗(yàn)分為對照組（接種HC11細(xì)胞但不加藥處理）和不同濃度（5、10、20、40、80、100、120 μmol/L）β-谷甾醇組。每組5 個重復(fù)孔。于96 孔板中接種對數(shù)生長期的HC11 細(xì)胞（1×104個/孔），培養(yǎng)過夜，更換新鮮培養(yǎng)基并添加β-谷甾醇，作用24 h 后，各孔加入10 μL MTT（5 mg/mL）繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸出培養(yǎng)液，各孔分別加入100 μL DMSO，振蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測490 nm 的各孔吸光度（OD）值并進(jìn)行計(jì)算，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 β-谷甾醇對HC11 細(xì)胞乳蛋白和乳脂肪合成相關(guān)基因表達(dá)影響的檢測

取對數(shù)生長期的HC11 細(xì)胞接種于6 孔板中，待培養(yǎng)板中細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%時，更換新鮮培養(yǎng)基，對照組HC11細(xì)胞添加正常細(xì)胞培養(yǎng)基，各試驗(yàn)組HC11 細(xì)胞在添加正常細(xì)胞培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，同時分別添加不同濃度的β-谷甾醇（5、10、20 μmol/L），每組設(shè)置5 個重復(fù)孔。β-谷甾醇作用細(xì)胞48 h，收集細(xì)胞，Trizol 法提取RNA，根據(jù)Prime ScriptTMRT reagent Kit 試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，利用qRT-PCR 試劑盒（SYBR Premix Ex TaqTM）檢測HC11 細(xì)胞CSN1S1、CSN2、CSN3、mTOR、STAT5、JAK2、S6K1、4EBP1、SREBF1、PPARG、PPARGC1A、ACC、FAS、SCD基因的mRNA 表達(dá)水平。各基因的引物序列見表1，β-actin為內(nèi)參基因。采用2-ΔΔCt相對定量的方法計(jì)算各基因的mRNA表達(dá)豐度。

表1 實(shí)時熒光定量 PCR引物序列

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示；采用SPSS 22.0 軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05 表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-谷甾醇對HC11細(xì)胞活力的影響

不同濃度β-谷甾醇對HC11 細(xì)胞活力的影響如圖1 所示。與對照組相比，20 μmol/L 以內(nèi)的β-谷甾醇對HC11 細(xì)胞活力均無顯著影響（P>0.05），而β-谷甾醇添加量達(dá)到40 μmol/L 后，細(xì)胞活力隨β-谷甾醇添加濃度的升高而顯著下降（P<0.05）。后續(xù)試驗(yàn)采用對HC11 細(xì)胞活力無抑制效果的5、10、20 μmol/Lβ-谷甾醇處理細(xì)胞，以探究其對HC11 細(xì)胞乳蛋白和乳脂肪合成相關(guān)基因表達(dá)的影響。

圖1 β-谷甾醇對HC11細(xì)胞活力的影響

2.2 β-谷甾醇對HC11 細(xì)胞酪蛋白及乳蛋白合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

不同濃度β-谷甾醇對HC11 細(xì)胞酪蛋白基因mRNA 表達(dá)的影響如圖2 所示，與對照組相比，5、10、20 μmol/L 的β-谷甾醇均能顯著提高HC11 細(xì)胞CSN1S1、CSN2、CSN3基因mRNA 表達(dá)水平（P<0.05），其中5 μmol/Lβ-谷甾醇組細(xì)胞CSN1S1、CSN2、CSN3基因mRNA表達(dá)水平相對更高。

圖2 β-谷甾醇對HC11細(xì)胞酪蛋白基因mRNA表達(dá)的影響

不同濃度β-谷甾醇作用下HC11 細(xì)胞中乳蛋白合成信號通路（JAK2/STAT5 和mTOR）相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的變化如圖3所示，與對照組相比，5、10、20 μmol/L 的β-谷甾醇組HC11細(xì)胞STAT5、JAK2、mTOR和S6K1基因mRNA 表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05）。其中5 μmol/Lβ-谷甾醇組細(xì)胞STAT5和JAK2基因mRNA 表達(dá)水平相對最高，10 μmol/Lβ-谷甾醇組細(xì)胞mTOR基因和S6K1基因mRNA 表達(dá)水平更高。與對照組相比，5 μmol/L 和10 μmol/L 的β-谷甾醇組HC11細(xì)胞4EBP1基因mRNA表達(dá)水平無顯著變化（P>0.05），而20 μmol/L 的β-谷甾醇能顯著提高HC11細(xì)胞4EBP1基因的mRNA表達(dá)（P<0.05）。

圖3 β-谷甾醇對HC11細(xì)胞乳蛋白合成信號通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

2.3 β-谷甾醇對HC11 細(xì)胞乳脂肪合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

不同濃度β-谷甾醇對HC11 細(xì)胞脂肪酸合成相關(guān)基因mRNA水平影響的檢測結(jié)果如圖4所示，與對照組相比，5、10、20 μmol/L 的β-谷甾醇均能明顯上調(diào)HC11細(xì)胞ACC基因和SCD基因的mRNA表達(dá)水平（P<0.05），其中5 μmol/Lβ-谷甾醇組細(xì)胞ACC和SCD基因mRNA表達(dá)水平相對更高。但與對照組相比，5 μmol/L和10 μmol/L 的β-谷甾醇對HC11 細(xì)胞FAS基因表達(dá)無顯著影響（P>0.05）；而20 μmol/L 的β-谷甾醇能顯著提高FAS基因mRNA的表達(dá)（P<0.05）。

圖4 β-谷甾醇對HC11細(xì)胞脂肪酸合成相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

不同濃度β-谷甾醇作用下HC11 細(xì)胞中乳脂肪合成關(guān)鍵調(diào)控因子基因（SREBF1和PPARG）及其輔助因子PPARGC1A基因mRNA 表達(dá)水平的變化如圖5所示，與對照組HC11 細(xì)胞相比，5、10、20 μmol/L 的β-谷甾醇均能顯著提高HC11 細(xì)胞SREBF1、PPARG和PPARGC1A基因mRNA 表達(dá)水平（P<0.05）。其中5 μmol/Lβ-谷甾醇組細(xì)胞PPARG基因和PPARGC1A基因mRNA 表達(dá)水平相對最高，10 μmol/Lβ-谷甾醇組細(xì)胞SREBF1基因mRNA表達(dá)水平相對最高。

圖5 β-谷甾醇對HC11細(xì)胞乳脂肪合成信號通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

3 討論

乳腺上皮細(xì)胞是乳蛋白、乳脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)合成的主要場所。哺乳動物的泌乳功能與乳腺上皮細(xì)胞的數(shù)目以及其分泌與合成乳成分的能力密切相關(guān)。郭惠中[8]研究表明低劑量β-谷甾醇對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞活性無顯著影響，而高劑量β-谷甾醇表現(xiàn)出明顯抑制作用。王凱等[9]研究發(fā)現(xiàn)隨著β-谷甾醇添加劑量的升高，肝癌細(xì)胞Hep3B和HepG2的細(xì)胞活力逐漸降低。與前人的研究結(jié)果一致，本研究發(fā)現(xiàn)低濃度的β-谷甾醇對HC11 細(xì)胞活力無明顯影響，而高濃度β-谷甾醇對HC11 細(xì)胞活力具有顯著抑制作用，因此后續(xù)試驗(yàn)選擇對HC11 細(xì)胞活力無抑制作用的β-谷甾醇劑量來研究其對HC11細(xì)胞泌乳功能的影響。

乳蛋白主要由酪蛋白和乳清蛋白組成[10]。乳中含量最高的蛋白質(zhì)是酪蛋白，約占總?cè)榈鞍椎?0%，主要分為4種：αs1-酪蛋白（CSN1S1）、αs2-酪蛋白（CSN1S2）、β-酪蛋白（CSN2）以及κ-酪蛋白（CSN1S3）[11]。乳蛋白合成主要由2 條信號通路調(diào)控，分別是在催乳素或其他泌乳相關(guān)細(xì)胞因子作用下從基因轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)乳蛋白合成的JAK2/STAT5信號通路和從蛋白質(zhì)翻譯水平調(diào)節(jié)乳蛋白合成的mTOR 信號通路。當(dāng)催乳素等配體與乳腺細(xì)胞表面的受體結(jié)合后激活JAK2，活化的JAK2 磷酸化轉(zhuǎn)錄因子STAT5，激活的STAT5 蛋白形成二聚體，進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控下游乳蛋白相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)泌乳以及乳蛋白的合成[12]。激活的mTOR磷酸化其下游效應(yīng)因子真核細(xì)胞翻譯啟動因子4E 結(jié)合蛋白1（4EBP1）和核糖體蛋白S6 激酶1（S6K1），被激活的S6K1 能增強(qiáng)含嘧啶基因mRNA 的翻譯效率，調(diào)節(jié)乳蛋白的合成[13]。而真核細(xì)胞翻譯起始因子4E（eIF4E）與未磷酸化的4EBP1 結(jié)合，對蛋白質(zhì)的翻譯產(chǎn)生抑制作用，4EBP1 經(jīng)mTOR 磷酸化后會與eIF4E脫離，減弱4EBP1 和eIF4E 結(jié)合對蛋白質(zhì)翻譯的抑制作用，促進(jìn)乳蛋白的合成[14]。研究發(fā)現(xiàn)具有植物雌激素作用的蘆丁能顯著提高奶牛乳腺上皮細(xì)胞CSN1S1基因和CSN2基因的mRNA 表達(dá)，對乳蛋白合成具有促進(jìn)作用[15]。作為黃酮類植物激素的槲皮素能顯著上調(diào)產(chǎn)后缺乳小鼠CSN2基因的表達(dá)量[4]。植物雌激素葛根素可能通過催乳素受體激活JAK2/STAT5a 信號通路提高β-酪蛋白的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)對小鼠乳腺泌乳過程的調(diào)控[3]。和雌激素、催乳素作用相似的王不留行能提高磷酸化STAT5、mTOR及S6K1的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳蛋白的合成[16]。與以往的研究結(jié)果類似，本試驗(yàn)結(jié)果表明，添加低劑量β-谷甾醇能顯著提高CSN1S1、CSN2和CSN3的mRNA 水平，同時顯著上調(diào)JAK2、STAT5、mTOR和S6K1的mRNA 表達(dá)，但低劑量β-谷甾醇對4EBP1的mRNA 表達(dá)無顯著影響。這些結(jié)果提示低劑量的β-谷甾醇可能發(fā)揮植物雌激素的作用，激活HC11細(xì)胞JAK2/STAT5通路和mTOR 通路，進(jìn)而促進(jìn)乳蛋白的合成。但相比較而言，高劑量的β-谷甾醇可能會減弱乳腺上皮細(xì)胞合成分泌乳蛋白。

SREBF1 是調(diào)節(jié)乳脂肪合成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控乳脂肪合成過程中多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和關(guān)鍵酶的表達(dá)，影響乳腺三酰甘油的合成和分泌[17]。Ma等[18]研究發(fā)現(xiàn)SREBF1基因的低表達(dá)會抑制脂肪酸從頭合成相關(guān)基因ACC、FAS、SCD和脂肪酸結(jié)合蛋白FABP3的表達(dá) 。PPARG屬于核激素受體家族中的配體激活受體，可通過調(diào)節(jié)乳腺中與脂肪酸攝取、活化、運(yùn)輸、從頭合成、去飽和、三酰甘油合成相關(guān)的生脂基因表達(dá)及SREBP1的表達(dá)而在乳脂肪合成中發(fā)揮關(guān)鍵作用[19]。PPARGC1A是PPARG基因的共激活因子，它通過與轉(zhuǎn)錄因子PPARG 的互作而結(jié)合在靶基因的啟動子區(qū)，協(xié)助調(diào)節(jié)基因表達(dá)[20]。Kadegowda 等[21]使用PPARG 激動劑羅格列酮處理奶牛乳腺上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)脂肪酸從頭合成基因（ACC、FAS、SCD）及轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因（SREBF1）的表達(dá)量均上調(diào)。乳脂肪合成的過程也受到mTOR信號通路的調(diào)節(jié)，激活的mTOR 信號通路可以通過eIF4E、4EBP1 和S6K 等下游信號分子，上調(diào)SREBF1 和PPARG 等轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的表達(dá)以促進(jìn)乳脂肪合成[22-23]。研究發(fā)現(xiàn)類激素物質(zhì)大豆異黃酮能明顯促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞β-酪蛋白和三酰甘油的合成和分泌[24]。槲皮素可以提高產(chǎn)后缺乳小鼠乳腺脂肪酸合成相關(guān)基因FAS和SCD的表達(dá)[4]。王不留行黃酮苷能上調(diào)mTOR和SREBF1c 的表達(dá)，促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞β-酪蛋白和三酰甘油合成[25]。與以前的研究結(jié)果相似，本研究發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇上調(diào)乳脂肪合成轉(zhuǎn)錄因子SREBF1、PPARG及輔助因子PPARGC1A基因表達(dá)的同時，也促進(jìn)了ACC、FAS、SCD基因的表達(dá)，提示β-谷甾醇可能通過激活mTOR 信號通路調(diào)控以SREBF1與PPARG 為核心的乳脂肪合成基因網(wǎng)絡(luò)，上調(diào)脂肪酸合成關(guān)鍵酶相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)乳腺三酰甘油的合成與分泌。

4 結(jié)論

β-谷甾醇可通過JAK2/STAT5 和mTOR 信號通路調(diào)節(jié)酪蛋白基因CSN1S1、CSN2和CSN3的表達(dá)；也可上調(diào)PPARG 與SREBF1 乳脂肪合成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控脂肪酸合成相關(guān)基因ACC、FAS和SCD的表達(dá)。當(dāng)β-谷甾醇添加濃度為5～10 μmol/L 時，對小鼠乳腺上皮細(xì)胞乳蛋白和乳脂肪合成相關(guān)基因表達(dá)的促進(jìn)效果較好。