甲狀腺癌是常見(jiàn)的內(nèi)分泌腫瘤,其中甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid cancer,PTC)是最常見(jiàn)的甲狀腺癌類(lèi)型[1]。隨著甲狀腺健康體檢的普及和檢查技術(shù)的提高,PTC的檢出率越來(lái)越高,多數(shù)患者預(yù)后良好,但仍有10%患者會(huì)發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[2],亟需尋找與甲狀腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的生物標(biāo)志物以改善此部分患者的生存和預(yù)后。

肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白(transgelin2,TAGLN2)與人腦膠質(zhì)瘤、乳腺癌及結(jié)直腸癌的侵襲與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3],但在甲狀腺癌中的作用及其調(diào)控機(jī)制尚不清楚。微小RNA(microRNA,miRNA)在基因的轉(zhuǎn)錄后微調(diào)控中起著關(guān)鍵作用。miR-206通過(guò)靶向下游分子,抑制結(jié)肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌[4]和非小細(xì)胞肺癌[5]的增殖、遷移和侵襲,其在PTC中侵襲轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制研究尚未見(jiàn)報(bào)道。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)HOTAIR通過(guò)miR-206調(diào)節(jié)斯鈣素(stanniocalcin,STC)進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞生物學(xué)功能[6],有學(xué)者報(bào)道HOTAIR在PTC中高表達(dá),對(duì)PTC的發(fā)展有重要的調(diào)節(jié)作用[7]。本研究旨在探討HOTAIR、miRNA-206和TAGLN2是否通過(guò)相互作用參與調(diào)節(jié)PTC的侵襲轉(zhuǎn)移,為PTC侵襲、轉(zhuǎn)移和治療提供新的研究依據(jù)和靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要細(xì)胞和組織樣本:人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞系TPC-1(北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院);10例甲狀腺乳頭狀癌和對(duì)應(yīng)癌旁組織取自就診于蘭州大學(xué)第一醫(yī)院的甲狀腺癌患者,所取標(biāo)本均由病理確診為甲狀腺癌。項(xiàng)目通過(guò)蘭州大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(LDYYLL2021-20),并取得所有參與者的知情同意。

1.1.2 試劑及試劑盒:DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶和血清(Gibco公司);Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑(Sigma-Aldrich公司);GAPDH、HOTAIR、miR-206、TAGLN2引物、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa公司);miR-206 Mimic和silncRNAHOTAIR(廣州銳博生物技術(shù)有限公司);抗GAPDH和TAGLN2抗體(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng):用含10% FBS+1%雙抗的 DMEM 培養(yǎng)基在5% CO2,37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞系TPC-1,達(dá)到 90% 左右匯合時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)及后續(xù)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染:按照陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine3000、miRNA-206 mimic和silncRNA HOTAIR的說(shuō)明書(shū),將轉(zhuǎn)染試劑和目標(biāo)RNA制劑加入增值狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)增值期的TPC-1細(xì)胞中,加入無(wú)抗生素和無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h后,換用含15%FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 熒光實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)mRNA:Trizol試劑盒抽提總RNA,檢測(cè)RNA濃度,按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA的合成。取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng),每個(gè)樣本重復(fù)3次。用SYBR Green染料法,以GAPDH為內(nèi)參照,設(shè)計(jì)目標(biāo)基因引物(表1)。PCR反應(yīng)條件為:95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s,95 ℃ 15 s,共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完成后,分析相應(yīng)Ct值,得出各組之間基因的mRNA表達(dá)水平的差異。

表1 RT-qPCR引物序列

1.2.4 Western blot檢測(cè)目標(biāo)蛋白質(zhì):用蛋白質(zhì)提取試劑盒提取細(xì)胞和組織蛋白質(zhì),BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。每孔上樣量為50 μg,內(nèi)參為GAPDH,后分別以80 V和120 V恒壓電泳,PVDF膜轉(zhuǎn)模,脫脂奶粉封閉1 h,4 ℃一抗孵育過(guò)夜,TBST清洗3次,室溫孵育二抗1 h,TBST清洗后,加入ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑,暗室X線(xiàn)曝光,用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析蛋白質(zhì)表達(dá)量。

1.2.5 Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞侵襲:胰蛋白酶消化TPC-1細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度至5×104/mL,取200 μL無(wú)FBS細(xì)胞懸液加入Transwell上室中,取600 μL含30% FBS培養(yǎng)基加入下室。共培養(yǎng)體系培養(yǎng)48 h后,4%多聚甲醛固定后結(jié)晶紫染色液避光染色30 min,顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)并拍照保存。

1.2.6 生存期分析:用GEPIA2(http://gepia2.cancer-pku.cn/)和UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/)在線(xiàn)搜索分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中甲狀腺癌組織及正常組織中的TAGLN2的表達(dá)情況;同時(shí)繪制TAGLN2的表達(dá)與甲狀腺癌患者無(wú)瘤生存期之間的關(guān)系。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中TAGLN2在甲狀腺癌中的表達(dá)

TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)資料分析得到甲狀腺組織的TAGLN2的表達(dá)如箱線(xiàn)圖顯示,TAGLN2在腫瘤組織中的表達(dá)量高于癌旁組織對(duì)照(圖1A)。TAGLN2相關(guān)的無(wú)瘤生存曲線(xiàn)顯示,TAGLN2高表達(dá)組的無(wú)瘤生存期可能更短(圖1B)。

A.expression profile of TAGLN2 in tumor tissue and adjacent tissue; B.TAGLN2-related tumor-free survival curve in patients with thyroid cancer; *P<0.05 compared with adjacent tissue.

2.2 HOTAIR、miRNA-206和TAGLN2在PTC組織中的表達(dá)

與癌旁組織(adjacent tissue,AT)相比PTC組織(PTC)中HOTAIR表達(dá)量增加2.48倍,miR-206-5p降低至為原來(lái)的3/5水平,TAGLN2的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)量均增加(P<0.05)(圖2)。

AT.adjacent tissue; PTC.papillary thyroid cancer; A.HOTAIR and TAGLN2 gene expression; B.miR-206 gene expression; C.TAGLN2 protein expression; *P<0.05 compared with AT.

2.3 miR-206的增加抑制了TPC-1細(xì)胞中TAGLN2的表達(dá)

與對(duì)照組(normal control group,NC)相比,上調(diào)TPC-1細(xì)胞中miR-206的表達(dá)后,TAGLN2的表達(dá)受到抑制,轉(zhuǎn)染miR-206 mimic組中TAGLN2的蛋白表達(dá)顯著減少(圖3)。

NC.normal control group;*P<0.05 compared with NC.

2.4 miRNA-206抑制了TPC-1細(xì)胞的侵襲能力

與對(duì)照組相比miR-206 mimic組TPC-1細(xì)胞的侵襲能力下降(73±11vs.152±20)(P<0.05)(圖4)。

2.5 HOTAIR對(duì)TPC-1細(xì)胞中miR-206和TAGLN2表達(dá)的影響

干擾lncRNAHOTAIR后,TPC-1細(xì)胞中miR-206表達(dá)量增加了2.13倍,TAGLN2基因表達(dá)量降低至原來(lái)的1/2(圖5A)。與對(duì)照組相比,干擾組中TAGLN2蛋白表達(dá)減少(圖5B)。

a.si-HOTAIR on miR-206-5p and TAGLN2 expression; B.si-HOTAIR on TAGLN2 protein expression;*P<0.05 compared with si-NC.

2.6 LncRNA HOTAIR對(duì)TPC-1細(xì)胞侵襲能力的影響

干擾HOTAIR的表達(dá)后,TPC-1細(xì)胞的侵襲能力明顯下降(圖6),干擾組和對(duì)照組相比穿透小室的細(xì)胞數(shù)量明顯減少(64±12vs161±15)(P<0.05)。

A,B.Transwell assay in the si-NC and si-HOTAIR group (magnification×400); C.histogram of the Transwell assay; *P<0.05 compared with si-NC group(n=6)

3 討論

PTC的5年生存率較高,但仍有約5%～10%的腫瘤生長(zhǎng)迅速、侵襲性高,出現(xiàn)復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,因此,需要進(jìn)一步了解PTC發(fā)病及侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制TAGLN2作為肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白Calponin家族的一員,是一種致癌基因。研究發(fā)現(xiàn),TAGLN2可以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、遷移和凋亡[8]。通過(guò)對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中現(xiàn)有甲狀腺癌組織數(shù)據(jù)分析顯示,TAGLN2在癌組織中的表達(dá)量顯著高于正常組織,本研究中組織樣品的表達(dá)也得到了相同的結(jié)果。同時(shí),分析表明,TAGLN2高表達(dá)可能預(yù)示患者的無(wú)瘤生存期更短。此外,研究證明,下調(diào)TAGLN2可以抑制甲狀腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲活性[9],與本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

miRNA在各種腫瘤中通過(guò)調(diào)控相關(guān)靶基因發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用,本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn),miRNA在甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展中扮演重要作用[10]。miR-206在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮抑制作用,許多研究報(bào)道,miR-206參與腫瘤的發(fā)病機(jī)制,但其對(duì)PTC-1細(xì)胞增殖和遷移的調(diào)控機(jī)制仍不明確。通過(guò)生物信息學(xué)分析,得出miR-206可能靶向調(diào)控TAGLN2進(jìn)而在PTC中發(fā)揮重要作用。本研究證實(shí),miR-206對(duì)TAGLN2調(diào)控作用,miR-206過(guò)表達(dá)導(dǎo)致TPC-1中TAGLN2的下調(diào)。同時(shí),Transwell小室法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示,miR-206過(guò)表達(dá)后,PTC-1細(xì)胞的侵襲能力受到抑制。

越來(lái)越多的證據(jù)表明,lncRNA在多種生物過(guò)程的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。作為研究最廣泛的lncRNA之一,HOTAIR已被報(bào)道在許多腫瘤中高表達(dá),其表達(dá)水平與某些腫瘤的病理分級(jí)、臨床分期和預(yù)后密切相關(guān)[11],HOTAIR在PTC組織中的高表達(dá)通常導(dǎo)致較差的預(yù)后[12]。而HOTAIR在PTC調(diào)控中的詳細(xì)作用及其潛在機(jī)制迄今尚未完全闡明。miR-206與HOTAIR在PTC中的表達(dá)是否存在相關(guān)性尚不清楚。本研究評(píng)估HOTAIR對(duì)PTC中miR-206水平的調(diào)控作用。在PTC-1細(xì)胞或甲狀腺乳頭狀癌組織中,高水平HOTAIR抑制miR-206的表達(dá),下調(diào)HOTAIR表達(dá)可導(dǎo)致miR-206水平明顯升高,同時(shí)TAGLN2表達(dá)水平隨之下降,PTC-1細(xì)胞的侵襲能力下降。

綜上所述,在PTC的腫瘤組織或細(xì)胞中可檢測(cè)到HOTAIR高表達(dá),miR-206低表達(dá),TAGLN2高表達(dá),其具有成為PTC有價(jià)值的生物標(biāo)志物的潛力。此外,在甲狀腺乳頭狀癌中,可以通過(guò)降低HOTAIR的表達(dá)水平,促成miR-206的過(guò)表達(dá),進(jìn)一步抑制TAGLN2的表達(dá),最終達(dá)到降低甲狀腺癌的侵襲能力的目的。因此,HOTAIR和TAGLN2水平的降低,miR-206水平的升高,可能有助于抑制PTC的惡性生物學(xué)行為。