羅元澤, 戴夢男, 李 蒙, 俞楊銷, 王建南,2

(1. 蘇州大學 紡織與服裝工程學院, 江蘇 蘇州 215123;2. 蘇州大學 紡織行業(yè)醫(yī)療健康用蠶絲制品重點實驗室, 江蘇 蘇州 215123)

家蠶絲(以下簡稱蠶絲)是天然的蛋白質纖維,作為紡織原料具有其它纖維無可比擬的優(yōu)越性。蠶絲是一種高純度蛋白質,是具有良好生物相容性和生物可降解性的生物聚合物,其中占比約75%的絲素蛋白可被制備成微球、水凝膠、管狀支架及多孔海綿等[1-3],已廣泛用于細胞外基質、組織工程支架及藥物載體的研究。絲素蛋白藥物載體在生物醫(yī)藥領域的應用開發(fā)已成為國內外研究者們極為關注的熱點。

隨著慢性非傳染性疾病,如癌癥、炎癥和糖尿病等發(fā)病率的不斷增加,利用可控釋放的載體進行藥物遞送,可提高治療效果,也是最常用的治療手段?；诮z素蛋白大分子獨特的化學結構及聚集態(tài)結構特征,其在生物醫(yī)藥領域尤其作為藥物控釋載體的應用,也是其它高分子無可比擬的。已有研究顯示,以絲素蛋白為載體的藥物釋放系統(tǒng)不僅可穩(wěn)定包裹各種小分子化合物[4],還可運輸?shù)鞍踪|[5]和核酸[6]等生物大分子,不僅能降低機體對藥物的降解作用,還能通過修飾進行靶向給藥,從而提高生物利用度,因此,以絲素蛋白為代表的藥物遞送系統(tǒng)日益受到關注。本文綜述了以絲素蛋白為基材制備的藥物遞送載體的種類和制備方法,重點闡述了負載藥物的主要類型以及在生物醫(yī)藥領域應用的最新研究進展。

1 藥物遞送系統(tǒng)

藥物遞送系統(tǒng)通常是指在空間、時間和劑量等方面調控的基礎上,將藥物有效輸送至目的器官,從而增加藥物的利用效率,提高療效,降低成本,減少毒副作用,主要用于治療癌癥、炎癥等疾病[7-8]。關于藥物遞送技術最早的研究可追溯到19世紀50年代,醫(yī)生首次嘗試將藥物負載在膠囊中用于遞送。現(xiàn)代科學研究中,研究人員通過改變聚合物的物理化學性質來響應外界刺激,如pH值、活性氧、谷胱甘肽、酶、溫度和光等[9-11],達到藥物負載穩(wěn)定、延長作用時間和向病變組織或器官靶向釋放的作用。

隨著醫(yī)學和材料科學技術的不斷發(fā)展,藥物遞送材料開始從合成材料向天然材料轉變,而其都應具備可降解性。合成材料如聚乳酸[12]、聚乳酸-乙醇酸[13]等材料的藥物載體在病變部位降解后會釋放藥物,但負載親水性藥物時難以控制釋放速率,且降解后易殘留有機溶劑而危害人體健康。天然材料來源廣、毒性低且性能穩(wěn)定,具有良好的生物相容性和可降解性,降解后的產(chǎn)物對細胞無毒害作用,還能作為細胞生長、增殖及組織再生的營養(yǎng)成分,如明膠[14]、殼聚糖[9]等,但這些材料存在提純工藝復雜、分子排列松散或制備不穩(wěn)定,以及體內降解過快的缺陷。以上可降解性聚合物藥物載體也均不具備靶向性和特異性。另外,金屬材料也被廣泛用于藥物載體研究,其團聚率小、清除率高、毒性較低,但生物降解性差仍是臨床試驗中需要解決的主要難題[15]。目前,用于藥物遞送載體研究的材料主要有3類,其中天然材料主要有殼聚糖[9]、明膠[14]、多肽[16]、透明質酸[17]、纖維素[18]、脂質體[19]、淀粉[20]、膠原[21]、海藻酸鈉[22]和絲素蛋白[23]等;合成材料有聚乳酸[12]、聚乳酸-乙醇酸[13]、聚乙二醇[24]和聚己內酯[25]等;金屬材料包括氧化鈰[15]、氧化鋅[26]等。

絲素蛋白大分子具有獨特而規(guī)整的化學結構,將其在合適的溶劑中自組裝可獲得降解可控、形態(tài)結構和聚集態(tài)結構可控的各種材料,因此是制備藥物控釋系統(tǒng)的理想原料,在生物醫(yī)藥領域受到了越來越多的關注,本文重點闡述絲素蛋白用于藥物遞送系統(tǒng)的最新研究進展。

2 絲素蛋白

2.1 絲素蛋白的結構

絲素蛋白來源于蠶絲的絲芯,包含重鏈(H鏈,約350 ku)、輕鏈(L鏈,約25 ku)和P25糖蛋白(約30 ku)3個亞單位,占蠶絲質量的70%～80%。絲素蛋白由20種氨基酸組成,其中主要組成部分包括:親水性的絲氨酸和酪氨酸分別占12%和5%,疏水的甘氨酸和丙氨酸分別占46%和29%。重鏈和輕鏈由各自C末端的二硫鍵相互連接形成復合體,P25糖蛋白主要通過疏水相互作用與復合體相結合起穩(wěn)定作用。重鏈約占絲素蛋白分子質量的92%[27],包含11個疏水結構域,通過酰胺鍵的氫鍵作用形成穩(wěn)定的反平行β折疊結構,因此,絲素蛋白材料的性狀和性質相對比較穩(wěn)定,其疏水氨基酸殘基可通過疏水相互作用和π-π堆積增強疏水性藥物的包封[28]。另外,絲素蛋白肽鏈上豐富的氨基和羧基經(jīng)過修飾后可賦予其靶向性[29],完成遞送后絲素蛋白在體內降解為可溶性的氨基酸和肽段,在保留藥效的同時具備優(yōu)良的生物安全性,不會導致給藥部位引起炎癥反應。再生絲素蛋白可自組裝為結晶高聚物,結晶形態(tài)主要包括Silk I和Silk II 2種,晶格中整齊緊密的鏈段排列可防止所包載藥物的突釋,延緩藥物釋放,降低突釋藥物對機體的毒性,延長藥物功效,且可通過物理或者化學的方法對絲素蛋白的結晶形態(tài)和結晶程度加以調控,從而對其進行精細的釋藥機制調控及靶向功能基修飾,尤其對于負載蛋白和基因這類易失活的藥物有著極其重要的研究意義。

2.2 絲素蛋白藥物遞送系統(tǒng)的制備方法

以絲素蛋白為原料開發(fā)的多種形式的藥物遞送系統(tǒng)中,研究較為深入的主要有納微球[30]、水凝膠[2]和微針[31]。另外,絲素蛋白常用于合成高分子材料表面的涂層載藥修飾[32],或者制備成絲素蛋白膜[33]和多孔材料[34],通過負載藥物以提高其治療效果。圖1示出絲素蛋白用于藥物遞送的主要類型[31-32]。表1列舉了絲素蛋白用于藥物遞送載體的主要制備方法。

表1 絲素蛋白藥物載體的制備方法Tab. 1 Preparation methods of silk fibroin drug carriers

2.2.1 絲素蛋白納微球藥物載體

使用絲素蛋白納微球可繞過首過效應,減少藥物在胃腸壁和肝臟中的代謝,提高進入體循環(huán)的藥量。將藥物包裹在納微球中還能有效避免體內酶的降解,即使采用靜脈注射也不會造成血藥濃度的波動,從而提高藥物療效,主要用來治療癌癥。目前已報道的絲素蛋白納微球制備方法,包括自組裝法[30]、噴霧干燥法[35]和溶劑蒸發(fā)法[36]等,通過不同的制備方法可獲得粒徑不同的納微球,從而負載不同的藥物以及采用適合的臨床注射方式輸送藥物至病變部位。如采用噴霧干燥法制備的負載順鉑的絲素蛋白納微球,其粒徑大小可根據(jù)噴霧干燥器的參數(shù),如入口溫度、霧化流量和溶液進料速率而調控,低進料速率和高霧化流量可制備小于5 μm的納微球用于肺部給藥[35]。

2.2.2 絲素蛋白水凝膠藥物載體

絲素蛋白含有大量親水性基團,在氫鍵、靜電相互作用或誘導劑、剪切力作用下,形成具有穩(wěn)定三維空間網(wǎng)絡結構的水凝膠,因其類似細胞外基質的結構和良好的生物相容性,可用來負載藥物、接種細胞進行體外培養(yǎng)以及修復缺損組織。常用的制備方法有超聲波法[37]、化學交聯(lián)法[2]和凍融法[38]等。另外,通過改變絲素蛋白溶液的濃度、交聯(lián)劑濃度、溫度和pH值等因素,可調控絲素蛋白結構中無規(guī)卷曲和α-螺旋轉變成β-折疊的過程,從而調控凝膠轉變時間。高溫和高交聯(lián)劑濃度可有效縮短凝膠時間,有研究指出,當絲素蛋白含量為70%、pH值為7.4時,制備的水凝膠具有良好的力學強度和溶脹行為,牛血清白蛋白在該水凝膠中可穩(wěn)定釋放48 h且釋放量達(75.1±3.1)%[2]。

2.2.3 絲素蛋白微針藥物載體

微針由于其便捷的使用方式和穩(wěn)定的藥效,常被用于治療糖尿病。微針可減輕皮下注射引起的疼痛,將親脂量低的藥物從角質層輸送到皮膚層,從而保護藥物不受胃腸道惡劣環(huán)境的影響。絲素蛋白用于開發(fā)微針載藥也受到國內外研究者們的極大關注。大多數(shù)釋藥微針存在易斷裂、載藥量低和藥物釋放速率不可控等缺點,而絲素蛋白微針可通過改變后處理條件(如溫度、濕度和水蒸氣退火)來調控微針的力學強度和藥物釋放速率,如用水蒸氣退火處理8 h的微針與未處理的微針相比,藥物釋放速率降低了5.6倍,這種微針在有效保留藥物活性的同時還延長了藥物在體內的作用時間[39]。

2.2.4 絲素蛋白載藥膜及表面涂層和多孔材料

絲素蛋白膜、多孔材料和對其它材料的涂層改性在生物醫(yī)療領域有著廣泛的應用研究。其中絲素蛋白膜主要用于傷口敷料和藥物控釋。絲素蛋白膜作為藥物載體可提供良好的吸附和緩釋功能,如用溶液澆鑄法制備的絲素蛋白/羊毛角蛋白復合膜負載的雙氯芬酸鈉呈梯度釋放,隨著絲素蛋白含量的降低,藥物的釋放呈梯度增加,不同比例的絲素蛋白/羊毛角蛋白復合膜在釋放8 h后藥物釋放率最高可相差30%,這證明絲素蛋白具有優(yōu)異的緩釋性能[33]。絲素蛋白因其良好的生物相容性和可生物降解性,可對合成材料或不穩(wěn)定的藥物進行涂層改性,主要用于酶和藥物的包封。通過改變絲素蛋白涂層的厚度和結晶度可實現(xiàn)對藥物釋放的精準控制[23],有學者使用不同濃度的絲素蛋白涂層于負載鹽酸萬古霉素的聚乳酸-乙醇酸微球上,0.1%絲素蛋白涂層的載藥微球有效緩解了突釋現(xiàn)象[32]。絲素蛋白多孔材料的三維多孔結構可為藥物或生物因子的吸附和釋放提供充足空間,以利于促進缺損組織再生與修復。如通過冷凍干燥法制備負載雷奈酸鍶的絲素蛋白/明膠復合氣凝膠多孔材料,該多孔材料在有效吸附和釋放藥物的同時有利于細胞黏附和增殖,刺激成骨細胞的成骨分化[34]。

3 絲素蛋白遞送系統(tǒng)的研究進展

慢性疾病的有效治療不僅要持續(xù)釋放藥物,還要延長血液中藥物的循環(huán)時間,減少給藥頻率,減弱藥物不良反應,提高患者的依從性。絲素蛋白藥物載體裝載技術可通過化學交聯(lián)[29]或表面包覆[47]等多種方式實施,其中有效載荷的原理主要是通過藥物與絲素蛋白大分子間的疏水相互作用或氫鍵作用,將藥物穩(wěn)定在絲素蛋白載體中。以絲素蛋白為載體的藥物遞送研究中,裝載的藥物主要是抗腫瘤藥物、抗菌消炎藥物以及蛋白類生物因子和基因(見圖2)。

3.1 絲素蛋白用于抗腫瘤藥物載體

常見的抗腫瘤藥物分為疏水性和親水性藥物,疏水性藥物包括姜黃素、喜樹堿和紫杉醇等,而親水性藥物包括阿霉素、吉西他濱和長春新堿等[48-50]。

疏水性藥物姜黃素是一種來源于姜黃的天然多酚,具有良好的抗癌和抗炎特性,在體液中不穩(wěn)定且代謝較快。有研究指出絲素蛋白對疏水性藥物具有更優(yōu)的負載能力,如對絲素蛋白和絲素蛋白/殼聚糖2種納米顆粒負載姜黃素用于對抗乳腺癌細胞的研究中發(fā)現(xiàn),絲素蛋白/殼聚糖納米顆粒的包封率小于純絲素蛋白納米顆粒的包覆率,這是因為殼聚糖的親水性影響了對疏水性姜黃素的負載[7]。通過超臨界CO2工藝制備的絲素蛋白納米顆?？商岣呓S素的溶解度,該納米顆粒的最高載藥率和包封率可達(12±0.62)%和(36±1.9)%[51]。改變絲素蛋白載體的pH值也是調節(jié)其載藥能力的一種手段。有研究認為在低pH值下制備的絲素蛋白微球具有更好的化學和蛋白水解穩(wěn)定性,以及更持久的藥物釋放性能,當pH值為3.6時可獲得約為60%的包封率(姜黃素),這歸因于姜黃素可通過疏水相互作用和絲素蛋白在等電點附近形成更多的β折疊結構[28]。另外,研究人員將納米二氧化硅與絲素蛋白復合制備的微膠囊對姜黃素的包封率高達95%,復合微膠囊的體外藥物釋放持續(xù)時間比純絲素蛋白微膠囊長,且可通過調整絲素蛋白的含量來調節(jié)藥物釋放速率,這是由于納米二氧化硅和絲素蛋白之間的強靜電相互作用,使得復合微膠囊的外殼孔隙更少且更加致密,從而延緩了姜黃素通過殼基質的擴散(見圖3)[4]。最近有研究報道了在絲素蛋白裝載姜黃素的納米顆粒表面進行環(huán)五肽(cRGD)修飾來實現(xiàn)靶向給藥,結果顯示人膀胱腫瘤細胞對cRGD功能化的絲素蛋白/姜黃素納米顆粒的攝取能力比未功能化的絲素蛋白載藥納米顆粒有顯著提高,這是因為 cRGD對整合素αvβ3和αvβ5具有高親和力,而這2種整合素在腫瘤細胞上被過度表達,腫瘤細胞表面過表達的整合素αvβ3和αvβ5會主動識別cRGD功能化后的絲素蛋白載藥納米顆粒。這種靶向藥物載體可有效提高癌癥類重大疾病的治療效率并保護正常細胞[29]。

圖3 二氧化硅納米粒子穩(wěn)定的乳狀液和絲素蛋白微膠囊的形成過程及其在輸送系統(tǒng)中的應用示意圖Fig. 3 Schematic of process for formation of pickering emulsions and silk microcapsules and their applications in delivery systems

親水性藥物代表阿霉素是一種周期非特異性藥物,對各種生長周期的腫瘤細胞都有殺滅作用。有學者嘗試制備負載阿霉素的絲素蛋白納米顆粒,當阿霉素與絲素蛋白的質量比為1∶24時,納米顆粒對阿霉素的包封率高達95%[48],該納米顆?？捎行ё饔糜谌苊阁w營養(yǎng)型抗癌納米藥物并克服多藥耐藥性,但缺乏腫瘤靶向能力且藥物療效較低。研究發(fā)現(xiàn)將葉酸偶聯(lián)于絲素蛋白制備的絲素蛋白/葉酸納米載體提高了被乳腺癌細胞攝取的能力,從而實現(xiàn)腫瘤靶向性[52]。葉酸是細胞合成核苷酸的必要營養(yǎng)物,葉酸受體可在正常細胞上低表達而在腫瘤細胞上過表達,因此可利用這個生物學原理制備納米載體用來靶向給藥、提高治療效率[53]。使用化學交聯(lián)法制備的藥物載體容易殘留少許有機溶劑,對人體健康存在影響,而使用磁性靶向法可不對載體進行化學修飾,不涉及有機溶劑,是一種具有生物安全性的藥物載體靶向性改性手段。如采用鹽析法制備的氧化鐵/絲素蛋白微球負載阿霉素,其載藥量為3.3%,藥物包封率為76%,氧化鐵/絲素蛋白微球被人宮頸腫瘤細胞顯著內吞,并會選擇性地積聚在人宮頸腫瘤細胞的細胞質中,起到靶向治療的作用[42]。在最近的一項研究中,學者結合光療和化療制備了一種負載光敏劑和阿霉素的透明質酸/絲素蛋白納米粒子,由于透明質酸可被癌細胞高表達的糖蛋白CD44所結合,因此該載藥粒子可被腫瘤細胞特異性內化,促進藥物在靶細胞中的積累。研究指出該載藥粒子的藥物釋放機制動力來自多個路徑:絲素蛋白載藥納米顆粒的透明質酸層在透明質酸酶的作用下降解,從而暴露內部結構釋放藥物;光敏劑吸收近紅外光后會引起高熱或產(chǎn)生細胞毒性單線態(tài)氧或其它活性氧,高熱使得分子間運動加劇從而讓藥物從內部擴散;而藥物還有依賴活性氧濃度釋放的特性等,因此該納米顆粒在腫瘤微環(huán)境中可通過多個途徑響應性釋放抗腫瘤藥物,以提高治療效果[11]。

3.2 絲素蛋白用于抗菌消炎藥物載體

阿司匹林是一種常見的抗菌消炎藥物,被廣泛應用于疾病的治療中。通過微球包裹阿司匹林可有效提高藥物利用率,從而減小對患者的胃部刺激,有學者制備了包裹阿司匹林的絲素蛋白微球,微球的載藥率為6.15%,包封率為67.66%,實驗結果表明負載藥物的絲素蛋白微球可在腸道中緩慢釋放[8]。通過靜電紡絲也可加載藥物,如靜電紡絲法制備的負載阿司匹林的聚乳酸/絲素蛋白復合納米纖維膜,隨著負載阿司匹林含量的增加,納米纖維的直徑減小,比表面積增大,藥物釋放速率增加。這種復合納米纖維中當聚乳酸與絲素蛋白的質量比為8∶3時,藥物釋放速率達到最大[47],而且阿司匹林在發(fā)揮抗菌消炎作用的同時賦予了復合纖維抗凝血效果,也成為用于研發(fā)藥物洗脫支架的潛在候選物。另外,一項研究指出,生物活性玻璃的摻入有助于提高藥物的加載率和釋放率,采用溶膠-凝膠法制備的生物活性玻璃/絲素蛋白復合支架進行載藥實驗,復合支架中阿司匹林的加載率顯著高于純絲素蛋白支架;在體外釋放實驗中,3 d后復合支架釋放的阿司匹林也顯示出比純絲素蛋白支架更好的釋放率[54]。

3.3 絲素蛋白用于蛋白類藥物的載體

大量研究表明,絲素蛋白載體對負載的蛋白質如生長因子和生物酶有穩(wěn)定作用,加上絲素蛋白與這類生物因子同屬蛋白質,彼此相容,使其即使在高溫和高濕等極端條件下也能保持生物活性和結構完整性?，F(xiàn)有這類載體研究中涉及的生長因子如轉化生長因子、類胰島素生長因子[36]和血管內皮細胞生長因子[55],主要功能是刺激相應細胞的生長和分化。關于生物酶如過氧化物酶[56]和L-天冬酰胺酶[57]能起到催化、合成抗生素以及抗腫瘤作用,使用絲素蛋白作為載體可克服它們半衰期短、穩(wěn)定性差和組織滲透有限的缺點。

3.3.1 絲素蛋白用于生長因子載體

骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(rhBMP-2)可誘導人骨髓間充質干細胞成骨和軟骨分化,胰島素樣生長因子1(rhIGF-1)具有促進骨骼生長的作用,有學者分別使用溶劑蒸發(fā)法和冷凍干燥法制備了聚乳酸-乙醇酸微球和絲素蛋白微球,2種微球單一負載或同時負載rhBMP-2和rhIGF-1這2種生長因子,然后加入藻酸鹽和絲素蛋白溶液制備藻酸鹽支架和絲素蛋白支架。在藻酸鹽支架中,人骨髓間充質干細胞的成骨分化能力,主要發(fā)生在負載rhBMP-2和同時負載rhBMP-2和rhIGF-1的絲素蛋白微球的支架中,而裝有相同載藥的聚乳酸-乙醇酸微球的藻酸鹽支架沒有明顯的成骨分化效果,這是由于rhBMP-2會在聚乳酸-乙醇酸微球降解后產(chǎn)生的酸性微環(huán)境中失活。另一組研究中,絲素蛋白支架裝有含2種生長因子rhBMP-2和rhIGF-1的絲素蛋白微球時,誘導人骨髓間充質干細胞軟骨分化的效果優(yōu)于裝載單一生長因子rhBMP-2的絲素蛋白微球,這是因為rhIGF-1增強了rhBMP-2誘導軟骨分化的效果,而在藻酸鹽支架中沒有發(fā)現(xiàn)這種增強效果,是因為rhIGF-1在絲素蛋白支架中的有效作用量多于藻酸鹽支架。這種將絲素蛋白微球和支架相結合的方法為遞送生長因子提供了新的思路[36]。

血管內皮細胞生長因子具有促進新血管生成、骨更新、成骨細胞遷移和礦化等功能,有研究結合冷凍干燥法和靜電紡絲法,制備用于遞送血管內皮細胞生長因子的絲素蛋白/磷酸鈣/PLGA復合支架,這種生長因子可在28 d內持續(xù)釋放且生物活性保持在83%左右[55]。堿性成纖維細胞生長因子在刺激細胞增殖方面起關鍵作用,將此生長因子負載于絲素蛋白微球中,研究發(fā)現(xiàn)在微球表面培養(yǎng)的L929細胞可充分鋪展,并產(chǎn)生膠原樣纖維基質,與純絲素蛋白微球相比,負載堿性成纖維細胞生長因子的絲素蛋白微球可顯著促進細胞增殖[40]。

3.3.2 絲素蛋白用于酶載體

使用絲素蛋白作為酶的載體,是延長酶發(fā)揮功能、保持活性并提高其環(huán)境穩(wěn)定性的一種重要手段。葡萄糖氧化酶最早是固定在絲素蛋白膜中開展研究的,將3.71×10-3U的葡萄糖氧化酶固定在1.1 mg(干態(tài)質量)的絲素蛋白膜中,60 ℃下加熱20 min后其活性產(chǎn)率仍高達98.7%[10]。之后有學者以脂質體為模板制備負載過氧化物酶的絲素蛋白微球,再分別使用甲醇和氯化鈉處理除去脂質,獲得具有多層結構的微球,這種微球顯著提高了過氧化物酶的負載能力[56]。然而該方法制備的微球形態(tài)不均且尺寸較大,為克服該缺點,有學者采用丙酮沉淀法制備載有L-天冬酰胺酶的具有良好球形形態(tài)的絲素蛋白納米顆粒,該納米顆粒直徑最小可達50 nm,且酶活性回收率高達90%,對胰蛋白酶降解的抵抗也極大增加,在血清中穩(wěn)定性良好[57]。還有研究者在制備的絲素蛋白/四氧化三鐵微球表面通過光化學交聯(lián)法共價結合酵母溶壁酶,結果顯示,加載量為100 mg/g時,酵母溶壁酶在微球表面的固定化效率幾乎為100%,與游離酶相比,固定化酶在最適pH值為7.5時可保持游離酶84%的活性;當pH值為4時游離酶喪失活性,而固定化酶仍可保持游離酶初始活性的81%。固定化酶可在較寬泛的pH值范圍內保持良好的活性,因此,這種微球在固定酶方面具有良好的應用前景[58]。

另外,絲素蛋白海綿和水凝膠也被研究用于裝載生物酶,有研究采用絲素蛋白海綿遞送凝血因子纖維蛋白原和凝血酶來控制出血,體外實驗顯示,在凝血酶的誘導作用下,凝血因子纖維蛋白原填充了絲素蛋白海綿的孔隙,形成致密的纖維狀蛋白質網(wǎng)絡,預示這種材料具備優(yōu)異的止血能力[59]。最近有研究以絲素蛋白為原料,通過酶促交聯(lián)法制備同時負載血紅蛋白和葡萄糖氧化酶的水凝膠。通過調節(jié)絲素蛋白和葡萄糖氧化酶的濃度可控制水凝膠的力學強度和凝膠時間。與游離酶相比,絲素蛋白上的酪氨酸單元在氧化過程中穩(wěn)定了血紅蛋白的結構,因此,固定化酶顯示出更高的生物催化效率。該研究團隊進一步建立全層皮膚缺損的大鼠模型,評估了載酶水凝膠的傷口愈合能力,14 d后純絲素蛋白水凝膠的傷口愈合率為75.6%,而載酶水凝膠達92.3%,可見此載酶水凝膠在止血和促進傷口愈合方面極具潛力[5]。

3.4 絲素蛋白用于基因藥物的載體

基因輸送是將遺傳物質如質粒DNA[60]、siRNA[6]等輸送到細胞,以取代、調節(jié)或表達細胞功能所需的基因或生物因子。絲素蛋白因其對細胞有良好的親和性、組織相容性和抗DNA酶作用等優(yōu)點,被認為是一種有潛力的基因遞送載體。目前已有較多研究顯示,應用絲素蛋白納米顆粒來遞送基因效果顯著。有學者應用基因工程技術合成了含聚賴氨酸和RGD序列的重組絲素蛋白,將其制備成負載編碼熒光素酶的質粒DNA的納米顆粒。當重組絲素蛋白與DNA的氮磷比超過1∶2時,顆?？捎行Оb、壓縮DNA,當?shù)妆葹?∶1時,制備的納米顆粒轉染人宮頸腫瘤細胞的效率最佳,這種載體的轉染效率依賴于RGD基序的數(shù)量[60]。

聚乙烯亞胺是一種陽離子聚合物,通常用作非病毒基因載體,被認為是基因轉染的黃金標準,但其高密度的陽離子基團對細胞有一定毒性。為解決其細胞毒性問題,有研究將絲素蛋白和聚乙烯亞胺通過靜電相互作用結合,制備負載編碼內皮細胞生長因子和血管生成素-1質粒DNA的納米顆粒。結合絲素蛋白后其屏蔽了聚乙烯亞胺過多的正電荷,該納米顆粒與聚乙烯亞胺/DNA納米顆粒相比,明顯降低了對小鼠成纖維細胞的毒性作用[61]。同樣的研究將聚乙烯亞胺/編碼綠色熒光蛋白的質粒DNA用絲素蛋白納米顆粒包被,與聚乙烯亞胺/DNA納米顆粒相比,加入絲素蛋白后有效降低了人胚胎腎細胞和人結腸腫瘤細胞的細胞毒性,提高了轉染效率,并使目的基因有效獲得表達[62]。還有研究利用磁性靶向載體來遞送DNA,如使用鹽析法制備磁性和非磁性絲素蛋白/聚乙烯亞胺核殼納米顆粒,用于遞送c-myc反義寡脫氧核苷酸,轉染MDA-MB-231乳腺腫瘤細胞后,與非磁性納米顆粒相比,磁性納米顆粒在20 min內通過磁感應攝取的c-myc反義寡脫氧核苷酸要高出70%,更顯著抑制了腫瘤細胞增長[63]。

絲素蛋白微球也可用于疫苗的加載研究,如使用乳化交聯(lián)法制備的負載傳染性法氏囊病病毒DNA疫苗的絲素蛋白/殼聚糖復合微球,其疫苗加載率為89.14%,將疫苗注入感染傳染性法氏囊病病毒的雞體內,2周后對雞血清的病毒抗體檢測結果顯示,相比于殼聚糖載藥微球,絲素蛋白/殼聚糖復合載藥微球注入后的體內抗體水平更高,這是由于絲素蛋白具有非特異性免疫促進作用[64]。

除使用顆粒狀載體外,還有學者將攜帶內皮細胞生長因子和血管生成素-1雙基因共表達的腺病毒載體裝載于絲素蛋白多孔支架,用于Sprague Dawley(SD)大鼠全層皮膚缺損修復,該支架能促進皮膚缺損創(chuàng)面血管網(wǎng)絡的快速形成和細胞外基質的重建[65]。經(jīng)皮免疫是將負載疫苗的貼劑貼于皮膚誘導產(chǎn)生全身免疫反應的方法。有研究將含有mRNA或siRNA的醇質體微球通過噴霧干燥法結合到再生絲素蛋白纖維的表面,制備載有mRNA疫苗(TCIP)和抗PDL1的siRNA(TDSP)的透皮貼劑,以小鼠黑色素瘤為模型進行動物實驗,即在小鼠皮膚上貼TCIP(進行預防)后注射腫瘤細胞,然后定期貼TDSP進行治療,這種聯(lián)合療法顯著抑制了腫瘤細胞生長,說明該貼劑可將核酸有效遞送到皮膚深層,且比單一使用TCIP或TDSP貼劑的治療效果更好[6]。新冠病毒已肆虐全球,使用逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)技術可及時識別和診斷患者是否感染病毒,并從滅活的全病毒中開發(fā)的RNA可作為陽性對照來驗證RT-PCR的結果,但由于RNA不穩(wěn)定,需進行冷鏈儲存和運輸以維持其完整性和活性,如能將其穩(wěn)定包埋并常溫運輸則意義重大。有研究報道了新型冠狀病毒RNA在絲素蛋白膜中的穩(wěn)定性,與保存在無核酸酶的水中相比,絲素蛋白膜在室溫下可將新型冠狀病毒RNA穩(wěn)定保存超過21周,并驗證了RT-PCR檢測結果的準確性,這對替代冷鏈運輸RNA的方法更加簡單方便是有研究價值的[66]。

4 結束語

隨著對絲素蛋白生物學功能的不斷發(fā)掘,在載藥形式、靶向治療以及提高藥物利用率方面已經(jīng)取得了一定的應用研究成果。絲素蛋白除以單一材料制備成納微球、水凝膠和微針等藥物控釋載體外,還可與其它功能材料或生物因子,如納米二氧化硅、生物玻璃等復合,實現(xiàn)靶向和特異性釋藥等功能。絲素蛋白良好的生物相容性可克服許多藥物穩(wěn)定性差、半衰期短的缺點,起到延長藥效、提高藥物利用率的作用,這在生物醫(yī)藥領域意義重大。

雖然絲素蛋白擁有其它材料難以企及的優(yōu)異性能,但仍有不少缺點值得注意,例如絲素蛋白的來源和質量不同,需要標準化提取與限定。雖然通過物理或化學修飾可賦予絲素蛋白靶向遞送藥物或功能因子的能力,但在進入體內后可能會受到免疫系統(tǒng)的攻擊(尤其在初期),以及藥物在循環(huán)系統(tǒng)運行中可能提前釋放或載體瓦解,從而導致靶向釋藥失敗。目前關于絲素蛋白藥物遞送系統(tǒng)在臨床上的應用還未實施,其精確性和有效性還需要長期探索和臨床試驗。隨著材料、化學科學和藥學的發(fā)展,生物相容性優(yōu)異的絲素蛋白作為藥物遞送系統(tǒng)的研發(fā)必會進一步走向成熟和應用。