許嘉隆，應曉明，趙鈺琦，郭少卿

1. 浙江中醫(yī)藥大學，浙江 杭州 310053；2. 浙江中醫(yī)藥大學附屬第三醫(yī)院，浙江 杭州 310005

缺血性腦卒中是最常見的一種腦血管疾病，臨床表現(xiàn)為運動功能受損、感覺異常、認知能力下降、構音困難等癥狀[1]。該病每年新發(fā)人數(shù)在1 300 萬以上，我國每年新發(fā)人數(shù)為200 萬左右，增速超過8%[2]。腦卒中的發(fā)病機制涉及缺血再灌注引起的炎癥反應，及中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)免疫功能紊亂[3]。西醫(yī)治療包括抗凝、溶栓、營養(yǎng)神經(jīng)等，急性期療效明顯，但對于恢復期的功能改善效果有限[4]。中醫(yī)針刺療法治療腦卒中后運動功能障礙方面應用廣泛[5]。龍虎交戰(zhàn)針法是一種特殊針刺手法，治療偏頭痛等神經(jīng)血管性疾病效果顯著[6]。但目前尚無治療缺血性腦卒中的報道。研究表明，miR-431 和miR-1247 與多種炎癥性及免疫功能障礙性疾病有關[7-8]，但對缺血性腦卒中的作用未見報道。本研究擬探索龍虎交戰(zhàn)針法治療缺血性腦卒中的療效，通過多因素Logistic 回歸和ROC 曲線分析miR-431 和miR-1247 對卒中發(fā)病及預后的影響，結果報道如下。

1 臨床資料

1.1 診斷標準參考《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》[9]制定?；颊呒毙园l(fā)病；伴局部神經(jīng)功能障礙，如單側(cè)面部或肢體麻木、感覺異?；蚍α?，也可出現(xiàn)全面的神經(jīng)功能受損；CT 或磁共振檢查發(fā)現(xiàn)病灶，或患者癥狀、體征持續(xù)24 h 以上；CT 或磁共振排除腦出血；排除非血管性病因。

1.2 辨證標準符合《中醫(yī)病證診斷療效標準》[10]中風病氣虛血瘀證的診斷。偏身不遂，肢體萎軟，半側(cè)肢體麻木，舌體強硬，發(fā)音困難，四肢腫脹，面色?白，呼吸氣短，肢體無力，心慌自汗，舌質(zhì)淡紅、舌苔白，脈細。

1.3 納入標準符合診斷標準及氣虛血瘀證辨證標準；年齡≥18 歲；患者生命體征平穩(wěn)，能配合治療；精神及智力正常，可以與人交流。

1.4 排除標準嚴重的心、肝、腎等臟器功能障礙；嚴重的免疫系統(tǒng)疾病；惡性腫瘤；有針刺禁忌證；嚴重的凝血功能障礙；先天性關節(jié)畸形或肢體殘疾。

1.5 一般資料選取2020 年5 月—2022 年1 月就診于浙江中醫(yī)藥大學附屬第三醫(yī)院的缺血性腦卒中氣虛血瘀證患者98 例為研究對象，按照隨機數(shù)字表法分為對照組和觀察組，每組49 例。2 組一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性，見表1。所有患者入組前均簽署知情同意書。本研究已通過醫(yī)院倫理委員會批準（SY2021105）。

表1 2 組一般資料比較

2 治療方法

2 組患者均予以西醫(yī)常規(guī)治療，包括抗凝、抗血小板聚集、降脂、營養(yǎng)神經(jīng)等藥物。

2.1 對照組給予腦心通膠囊（陜西步長制藥有限公司，國藥準字Z20025001，規(guī)格：0.4 g/粒），每次3 粒，每天3 次，口服，連續(xù)4 周。

2.2 觀察組在對照組治療方案的基礎上，采用龍虎交戰(zhàn)針刺法進行治療。取穴：以百會、神庭、列缺、曲池、內(nèi)關、合谷為主穴，配穴包括風池、風府、大椎、氣海、關元、委中、三陰交、豐隆。針具：采用華佗牌一次性無菌針灸針，規(guī)格：0.25 mm×40 mm。龍虎交戰(zhàn)針法：進針至皮下一定深度，用基本手法得氣，先捻針左轉(zhuǎn)，即拇指向前加力捻轉(zhuǎn)9 次，再捻針右轉(zhuǎn)，即拇指向后加力捻轉(zhuǎn)6 次。上述操作反復做6～9 次，以患者能忍受為限。捻針的角度在180 °～360 °之間，頻率為90～120 次/min 之間，施針后留針30 min。留針時間內(nèi)再行“龍虎交戰(zhàn)”手法2 次。每天治療1 次，連續(xù)4 周。

3 觀察指標與統(tǒng)計學方法

3.1 觀察指標①美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表（NIHSS）評分[11]。采用NIHSS 評價患者治療前后的神經(jīng)功能恢復情況。NIHSS 包含精神狀態(tài)、肢體協(xié)調(diào)運動、語言交流能力、發(fā)音障礙、四肢遠心端生理功能、視力、視野、皮膚感覺功能、忽視等11 個類別，滿分為42 分，得分越高表示神經(jīng)系統(tǒng)癥狀越嚴重。②Fugal-Meyer 運動功能評估量表（FMA）評分[12]。采用FMA 評價患者治療前后的運動功能恢復情況。FMA 包含雙上肢及雙下肢運動功能共2 個類別，滿分為100 分，得分越高表示運動功能恢復得越好。③Barthel 指數(shù)（BI）評分[13]。采用BI 評價患者治療前后的日常生活能力恢復情況。BI 包含穿脫衣物、飲食、上廁所、梳妝打扮、控制小便、沐浴、平地走動、移動床椅、控制大便、爬樓梯等10 個類別，滿分為100 分，得分越高表示日常生活能力恢復得越好。④血清白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平。所有患者治療前后均抽取空腹靜脈血5 mL，3 000 ×g離心10 min，取上層血清。采用酶聯(lián)免疫試劑盒進行檢測IL-1β、IL-6、TNF-α 水平（北京普利萊基因技術有限公司，貨號：AZ0367、AZ0389、AZ0451），采用450 nm 波長檢測溶液吸光度，計算IL-1β、IL-6、TNF-α 水平。⑤外周血CD3+、CD4+、CD8+T 細胞水平。所有患者治療前后均抽取空腹靜脈血5 mL 于EDTA 抗凝管中，搖勻，加入流式試管中，采用BD公司FACB CantoII 流式細胞儀檢測CD3+、CD4+、CD8+T 細胞，并使用FACS DIVA 軟件分析結果。⑥血清miR-431 和miR-1247 表達水平。所有患者治療前后均抽取空腹靜脈血3 mL，3000×g離心10 min，提取上層血清。采用miRNA 提取分離試劑盒［凱杰生物工程（深圳）有限公司，貨號：217004］提取血清中miRNA，采用miRNA 的cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司，貨號：MT0006）將miRNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物由上海生物工程公司合成，序列如下：miR-431 正向5'-ATGTCCGAC TAAAGTCGTCAAC-3'，反向5'-GCTGCCTACAGCG TGCTTC-3'；miR-1247 正向5'-GCAGCCTCTAGAA GTCGTCAGG-3'，反向5'-CTGGGCTACTGAAGGCT AG-3'；內(nèi)參采用U6 基因，正向5'-GACTGATGCT CTGGCCGA-3'，反向5'-GTCGGGTCGAAGCATGG-3'。采用2-△△Ct法計算miR-431 和miR-1247 的表達量。⑦隨訪策略。所有患者治療結束后均隨訪1 年，采用門診、電話、微信等隨訪形式，每3 個月隨訪1 次，記錄每位患者腦卒中復發(fā)情況。

3.2 統(tǒng)計學方法采用SPSS26.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料若符合正態(tài)分布，用均數(shù)±標準差（）表示。組間比較，采用t檢驗。若不符合正態(tài)分布，用中位數(shù)（四分位數(shù)）[M（P25，P75）]表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。計數(shù)資料用百分比（%）表示，采用χ2檢驗。采用Pearson 方法分析相關性，并計算相關系數(shù)r。采用多因素Logistic 回歸分析，應用逐步回歸法篩選獨立危險因素，并計算比值比及95%置信區(qū)間。采用ROC 曲線計算曲線下面積（AUC），根據(jù)約登指數(shù)找出最佳臨界值。檢驗水準取雙側(cè)α=0.05，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

4 療效標準與治療結果

4.1 療效標準參考《中藥新藥臨床研究指導原則（試行）》[14]制定。痊愈：NIHSS 評分下降≥90%；顯效：46%≤NIHSS 評分下降≤89%；有效：18%≤NIHSS 評分下降≤45%；無效：NIHSS 評分降低＜18%?？傆行?（痊愈例數(shù)+顯效例數(shù)+有效例數(shù)）/總例數(shù)×100%。

4.2 2 組臨床療效比較見表2?？傆行视^察組95.92%，對照組75.51%，2 組臨床療效比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=8.257，P=0.041）。

表2 2 組臨床療效比較例（%）

4.3 2 組治療前后NIHSS、FMA、BI 評分比較見表3。治療前，2 組NIHSS、FMA、BI 評分比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。治療后，2 組NIHSS 評分均低于治療前，F(xiàn)MA 評分、BI評分均高于治療前，且觀察組NIHSS 評分低于對照組，F(xiàn)MA、BI 評分高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表3 2 組治療前后NIHSS、FMA、BI 評分比較（）分

表3 2 組治療前后NIHSS、FMA、BI 評分比較（）分

注：①與治療前比較，P＜0.05

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4.4 2 組治療前后IL-1β、IL-6、TNF-α 水平比較見表4。治療前，2 組IL-1β、IL-6、TNF-α 水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。治療后，觀察組IL-1β、IL-6、TNF-α 水平均低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。2 組治療后IL-1β、IL-6、TNF-α 水平均低于治療前，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表4 2 組治療前后IL-1β、IL-6、TNF-α 水平比較（）ng/L

表4 2 組治療前后IL-1β、IL-6、TNF-α 水平比較（）ng/L

注：①與治療前比較，P＜0.05

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4.5 2 組治療前后CD3+、CD4+、CD8+T 細胞水平比較見表5。治療前，2 組CD3+、CD4+、CD8+T 細胞水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。治療后，觀察組CD3+、CD4+、CD8+T 細胞水平均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。2 組治療后CD3+、CD4+、CD8+T 細胞水平均高于治療前，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表5 2 組治療前后CD3+、CD4+、CD8+T 細胞水平比較（）%

表5 2 組治療前后CD3+、CD4+、CD8+T 細胞水平比較（）%

注：①與治療前比較，P＜0.05

組 別觀察組對照組t 值P例數(shù)49 49 CD3+CD4+CD8+治療后28.71±2.42①27.09±2.26①3.425＜0.001治療前58.04±3.34 57.36±3.18 1.032＞0.05治療后63.58±3.63①60.31±3.56①4.502＜0.001治療前30.72±3.35 30.10±2.88 0.982＞0.05治療后34.67±3.52①31.26±3.19①5.025＜0.001治療前26.17±2.14 26.63±2.37 1.008＞0.05

4.6 2 組治療前后miR-431、miR-1247 水平比較見表6。治療前，2 組miR-431、miR-1247 水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。治療后，觀察組miR-431、miR-1247 水平均低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。2 組治療后miR-431、miR-1247 水平均低于治療前，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表6 2 組治療前后miR-431、miR-1247 水平比較（）

表6 2 組治療前后miR-431、miR-1247 水平比較（）

注：①與治療前比較，P＜0.05

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4.7 血清miR-431、miR-1247 與炎癥及免疫指標的相關性見表7。血清miR-431 水平與CD3+、CD4+、CD8+T 細胞水平呈負相關（P＜0.05），與IL-1β、IL-6、TNF-α 水平呈正相關（P＜0.05）。血清miR-1247 水平與CD3+、CD4+、CD8+T 細胞水平呈負相關（P＜0.05），與IL-1β、IL-6、TNF-α 呈正相關（P＜0.05）。

表7 血清miR-431、miR-1247 與炎癥及免疫指標的相關性

4.8 腦卒中復發(fā)的多因素Logistic 回歸分析見表8。單因素Logistic 回歸分析表明，miR-431、miR-1247、IL-1β、IL-6、TNF-α 可能與腦卒中復發(fā)有關（P＜0.05）；將上述因素納入多因素Logistic 回歸，發(fā)現(xiàn)miR-431、miR-1247、IL-1β、TNF-α 是腦卒中復發(fā)的獨立危險因素（P＜0.05）。

表8 腦卒中復發(fā)的單因素及多因素Logistic 回歸分析

4.9 血清miR-431 和miR-1247 預測腦卒中復發(fā)的ROC 曲線血清miR-431 預測腦卒中復發(fā)的AUC 為0.851，miR-1247 的AUC 為0.854。二者聯(lián)合預測的AUC 為0.942，高于單獨預測的AUC（P＜0.05）。各指標的預測效能見表9，ROC 曲線見圖1。

圖1 血清miR-431 和miR-1247 預測腦卒中復發(fā)的ROC 曲線

表9 血清miR-431 和miR-1247 對腦卒中復發(fā)的預測效能

5 討論

缺血性腦卒中是最常見的腦血管疾病，發(fā)病過程包括動脈粥樣硬化，血管內(nèi)皮功能受損，凝血機制障礙，導致腦細胞缺血壞死，引起運動障礙、失語等臨床癥狀[15]。其發(fā)生機制與腦血管缺血再灌注后的炎癥反應有關，炎癥因子會引起血腦屏障損傷，產(chǎn)生氧化應激反應，激活補體系統(tǒng)，從而加重腦卒中的病情[16]。卒中發(fā)生時，免疫系統(tǒng)的小膠質(zhì)細胞、巨噬細胞可以識別壞死神經(jīng)細胞膜上的特定分子，改變血腦屏障通透性趨化T 細胞、NK 細胞浸潤，引起卒中后腦水腫，產(chǎn)生適應性免疫反應，加劇卒中進展[17]。

缺血性腦卒中屬中醫(yī)中風、撲擊、風痱等疾病范疇，病因主要包括外感風邪、內(nèi)生血瘀、痰濕阻滯、內(nèi)生火邪等[18]。其中氣虛血瘀證是該病的主要證型之一，病機為素體虛損、先天稟賦不足導致氣虛，使得氣血周流不暢，甚至血脈瘀阻，引起經(jīng)絡不通、腦絡失養(yǎng)，產(chǎn)生氣虛血瘀之證候，故而采用益氣活血化瘀之法治療卒中[19]。

龍虎交戰(zhàn)針法，《金針賦》載：“龍虎交戰(zhàn)、左捻九而右捻六，是亦住痛之針?！饼埵侵笘|方青龍，圣人向南而立，故東方在左，指施針者向左捻轉(zhuǎn)針柄，為補法；虎是指西方白虎，向南而立時，西方在右位，指施針者向右捻轉(zhuǎn)針柄，為瀉法[20]。龍虎交戰(zhàn)是指通過針刺，操作上采用交替手法，產(chǎn)生補虛瀉實的作用，刺激體內(nèi)正氣與致病邪氣進行龍爭虎斗，最終祛除病邪[21]。現(xiàn)代研究表明，龍虎交戰(zhàn)針法不僅有很好的止痛作用，也能顯著降低血清IL-1β、TNF-α 等炎癥因子水平，有效抑制炎癥反應[22]。

本研究表明，觀察組總有效率比對照組高20.41%，這提示針刺能顯著提高缺血性腦卒中的臨床療效，改善運動功能和生活質(zhì)量。卒中發(fā)生時，腦血管出現(xiàn)阻塞，血流量減少，尤其是一側(cè)腦部缺血缺氧時，使得患側(cè)腦的喚醒活動下降，而對側(cè)腦的興奮性上升，從而形成健側(cè)對患側(cè)腦的抑制性增強，肢體運動功能恢復受損，而針刺通過促進神經(jīng)元修復，抑制細胞凋亡，增加腦血流量等機制，從而恢復肢體運動功能[5]。本研究表明，治療后觀察組的IL-1β、IL-6、TNF-α 水平均低于對照組，提示針刺能顯著抑制缺血性腦卒中的炎癥反應。腦卒中后機體會激活Toll 樣受體4 通路，刺激周細胞釋放氧自由基、IL-6、TNF-α 等細胞因子及基質(zhì)金屬蛋白酶等炎性介質(zhì)，介導炎癥反應[3]。本研究發(fā)現(xiàn)，治療后觀察組的CD3+、CD4+、CD8+T 細胞水平均高于對照組，提示針刺能顯著改善缺血性腦卒中的免疫功能。卒中后機體通過炎癥小體中的模式識別受體及NOD 樣蛋白，增強血管通透性，引起免疫細胞對組織的浸潤，從而使得外周血中的T 淋巴細胞數(shù)量減少[23]。

miR-431 是一種具有調(diào)控功能的microRNA，能參與骨骼肌和肺泡等多種細胞的炎癥反應[24]。其水平升高能激活鈣調(diào)蛋白激酶Ⅳ信號通路，從而引起壞死性小腸結腸炎[8]。miR-1247 是另一種炎癥相關microRNA，可以通過靶向CCL16 調(diào)控肺炎巨噬細胞極化和炎癥反應[25]。多因素回歸和ROC 曲線表明，miR-431、miR-1247 是腦卒中復發(fā)的獨立危險因素，miR-431、miR-1247 二者聯(lián)合具有很好的預后價值。

本研究的優(yōu)點在于，采用多因素Logistic 回歸和ROC 曲線得出miR-431、miR-1247 對卒中復發(fā)的預測價值。本研究不足之處在于，僅納入了卒中恢復期患者，研究結果不能直接應用于急性期患者；另外本研究僅探討了氣虛血瘀證，結果用于其他證型需謹慎。今后將進一步研究miR-431、miR-1247 對急性期患者的作用，并納入風痰阻絡證等其他證型。

綜上所述，龍虎交戰(zhàn)針法能改善缺血性腦卒中氣虛血瘀證患者運動功能和生活質(zhì)量，減輕炎癥反應，提高免疫功能，降低血清miR-431、miR-1247水平，上述miRNA 是卒中復發(fā)的獨立危險因素，具有很好的預測價值。