王國平，齊胤堯，徐國云，李元君，牛永志，李曉旭，喬雨，鄭昀曄*

生物技術(shù)

王國平1，齊胤堯2，徐國云3，李元君1，牛永志1，李曉旭4，喬雨1，鄭昀曄1*

1 玉溪中煙種子有限責(zé)任公司，云南玉溪 653100；2 湖南大學(xué)生物學(xué)院，湖南長沙 410082；3 中國煙草總公司鄭州煙草研究院，河南鄭州 450001；4 湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，湖南長沙 410001

【背景和目的】種子的萌發(fā)是幼苗建成并正常生長的基礎(chǔ)，研究種子萌發(fā)機制并鑒定相關(guān)功能物質(zhì)，對于促進萌發(fā)、提高種子活力具有重要意義。【方法】本研究基于液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS/MS）方法，對吸水萌動前后的煙草種子的蛋白和多肽進行了分析。【結(jié)果】在干種子（萌動前種子）中鑒定到蛋白72個，在吸水萌動種子中鑒定到蛋白192個。富集分析發(fā)現(xiàn)，干種子中的蛋白主要富集在應(yīng)對種子的氧化或逆境脅迫，吸水萌動種子中的蛋白主要富集在蛋白合成以及溫度響應(yīng)相關(guān)過程。在干種子中進一步篩選到7個多肽分子，在吸水萌動的種子中進一步篩選到13個多肽分子，其中有5個為共有多肽。通過外源多肽處理種子，發(fā)現(xiàn)適宜濃度的半胱氨酸蛋白酶抑制劑（Cysteine proteinase inhibitor，）能夠促進未成熟（授粉后20 d采收）煙草種子的萌發(fā)?！窘Y(jié)論】本研究從蛋白和多肽層面為解析種子吸水萌發(fā)的機制提供了理論依據(jù)，也為多肽在種子萌發(fā)過程的功能研究提供了新的認識。

煙草；種子；多肽；蛋白；萌發(fā)

種子萌發(fā)是指種子從吸脹到胚根突出種皮，種子內(nèi)部發(fā)生一系列生理生化變化的過程[1]。種子萌發(fā)的速度、萌發(fā)的比例（發(fā)芽率）體現(xiàn)了種子的活力，是幼苗正常形成并茁壯生長的基礎(chǔ)。研究種子萌發(fā)機制并鑒定關(guān)鍵功能物質(zhì)對于促進萌發(fā)、提高種子活力具有重要意義。雖然煙草成熟種子的發(fā)芽率均可達90%以上[2]，但進一步提高其發(fā)芽率或者發(fā)芽勢、整齊度等指標仍具有一定現(xiàn)實意義。

種子萌發(fā)通常可以分為3個階段[3]，第一階段為吸脹階段，煙草種子吸水3～5 h左右完成。在擴散作用和毛細管作用下，水從種子外部高水勢區(qū)域移動到種子內(nèi)部低水勢區(qū)域，種子含水量快速增加，主要涉及細胞壁及原生質(zhì)體中的大分子（主要指蛋白質(zhì)與多糖）對水的吸收[4]。第2階段為萌動階段，也是最關(guān)鍵的一個階段，煙草種子吸水35～46 h左右完成。此過程種子含水量基本保持穩(wěn)定，各種代謝開始活躍，涉及氨基酸代謝、脂類代謝、糖代謝、能量代謝以及細胞生長與結(jié)構(gòu)、細胞防御與救援等相關(guān)蛋白質(zhì)的大量合成[5-8]。其中很關(guān)鍵的一類long-lived mRNA對種子萌發(fā)也起到重要作用，其會直接翻譯成蛋白質(zhì)，當翻譯受到抑制時，棉花、擬南芥以及水稻的種子均不能正常完成萌發(fā)[9-12]。第3階段為胚根突出階段，此階段伴隨著種子形態(tài)發(fā)生變化，種子含水量開始重新上升，胚根突破種皮并開始伸長。種子完成萌發(fā)后子葉展開，逐步形成幼苗并開始正常生長。

已有研究發(fā)現(xiàn)多肽分子廣泛參與植物的生長發(fā)育[13-14]，例如根系發(fā)育[15]、植物受精[16]、逆境脅迫[17]等。在擬南芥中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量的多肽分子，但絕大多數(shù)功能依然未知，對于種子萌發(fā)過程中起到關(guān)鍵作用的多肽分子更未見報道。本研究利用基于質(zhì)譜的多肽組學(xué)方法分析煙草種子萌動前后的蛋白質(zhì)表達差異[18-21]，篩選出可能起到重要功能的多肽分子，并進一步通過外源處理，以明確多肽分子在種子萌發(fā)過程中的潛在功能，為促進種子萌發(fā)、提高種子活力提供理論和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品前處理

供試材料為煙草品種K326的種子，由玉溪中煙種子有限責(zé)任公司提供。稱取兩份干燥的種子，其中一份種子不進行處理（CK），另一份種子用水浸種48 h，在室溫下回干（WS）。

向樣品中加入裂解液[1% SDS，8 mmol/L urea，1×蛋白酶抑制劑（羅氏）]，研磨3次，每次400 s。將研磨液放在冰上裂解30 min，在15000 rpm、4℃下離心15 min，取上清液。使用10 kDa超濾管（Millipore，Billerica）在8000 g、4℃下離心30 min，收集流穿液，以去除高分子量的蛋白質(zhì)。流穿液用離心濃縮器進行濃縮，并用100 mmol/L TEAB重新溶解。之后用C18除鹽柱除鹽后真空抽干，最終樣品保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 質(zhì)譜儀參數(shù)設(shè)置

將前處理后的樣品重新溶于0.1%甲酸水溶液，并使用配備在線納噴離子源的LC-MS/MS進行分析。整套系統(tǒng)為串聯(lián)EASY-nanoLC 1000的Orbitrap Fusion Lumos質(zhì)譜儀（Thermo Fisher Scientific, MA, USA）。樣品體積為5 μL（分析柱：acclaim pepmap C18，75 μmol/L x 25 cm），柱流量控制在400 nL/min，柱溫55℃，電噴霧電壓為2 kV，色譜梯度為：流動相A：0.1%甲酸水溶液；流動相B：含0.1%甲酸的ACN溶液。

質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置如下：（1）MS：掃描范圍(m/z)= 200～1500，分辨率=120,000，AGC target=4e5，最大注入時間=50 ms，掃描電荷=1～7。（2）HCD-MS/MS (top 10)：分辨率=15,000，隔離窗口=3 m/z，AGC target=5e4，最大注入時間=35 ms，碰撞能量=35，動態(tài)排除時間=30 s。

1.3 搜庫參數(shù)設(shè)置

完成質(zhì)譜分析后，利用PEAKS Studio version X + (Bioinformatics Solutions Inc., Waterloo, Canada)對串聯(lián)質(zhì)譜的原始數(shù)據(jù)進行分析。使用PEAKS DB對Nicotiana tabacum數(shù)據(jù)庫（https://solgenomics.net/ organism/Nicotiana_tabacum/genome）和Uniprot數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）進行搜庫。設(shè)置None enzyme即非酶切，搜庫參數(shù)碎片離子質(zhì)量容許誤差：0.02 Da，母離子質(zhì)量容許誤差：7 ppm，可變修飾：Oxidation(M)15.99，Acetylation(Protein N-term)42.01。肽段經(jīng)過1% FDR質(zhì)控過濾。

同樣使用PEAKS Studio version X+對過濾后的肽段進行非標記定量。首先，軟件分別識別各樣本中肽段母離子的峰面積即肽段的相對豐度，然后采用高性能的保留時間對來源于不同樣本的相同肽段進行對齊。采用樣本的總離子流（TIC）進一步對數(shù)據(jù)進行歸一化處理，樣本中各肽段的豐度由原始豐度除以歸一化系數(shù)獲得。

1.4 數(shù)據(jù)初步分析

原始數(shù)據(jù)使用PEAKS鑒定，最小肽段長度為7個氨基酸，當譜圖水平接近1% FDR時曲線平滑上升，identified peptides-spectrum matches數(shù)值合理，證明鑒定結(jié)果可信且數(shù)量理想。

使用PEAKS提取肽段峰強度、峰面積、液相色譜保留時間等信息，多肽定量使用PEAKS默認參數(shù)。使用總和歸一化方法對不同重復(fù)間蛋白的定量值進行歸一化處理。根據(jù)鑒定結(jié)果對多肽及前體蛋白進行GO和KEGG功能注釋。

1.5 生物信息學(xué)方法

在本研究中，以下R包用于GO富集分析和KEGG注釋：clusterProfiler（用于富集分析），topGO（用于繪制GO富集圖片），AnnotationHub（用于下載數(shù)據(jù)庫），BioFileCache（依賴包），dbplyr（依賴包），pathview（用于查看KEGG路徑）。分析過程中使用的數(shù)據(jù)庫編號為AH93857。

1.6 原核表達載體構(gòu)建

采用Infusion連接法設(shè)計引物，以K326樣品的cDNA為模板，PCR擴增目的片段。使用H I和R I切割pET32a空載體，將PCR產(chǎn)物用Infusion法連接到pET32a質(zhì)粒載體上。熱激轉(zhuǎn)入宿主菌大腸桿菌DH5α，挑取單個菌落培養(yǎng)后，用東盛質(zhì)粒小量提取試劑盒（N1011）提取質(zhì)粒DNA，并進行PCR檢測及雙酶切檢測，將檢測為陽性的重組質(zhì)粒送擎科生物技術(shù)有限公司進行桑格測序并比對序列。本研究選取的3個小肽的參考序列RefSeq登錄號以及UniPort登錄號分別為：XM_016605163（A0A1S3Z8G7）、XM_016624929（A0A1S4AV16）和NM_001325761（A0A075F933），載體構(gòu)建相關(guān)引物序列見表1。

表1 原核表達載體構(gòu)建引物

1.7 重組蛋白的原核表達

將測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌株BL21（DE3），挑取單菌落接種到5 mL LB/AMP液體培養(yǎng)基，37℃、220 r/min培養(yǎng)12 h。取1 mL菌液接種于100 mL LB/AMP液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600≈ 0.6～0.8，取誘導(dǎo)前菌液1 mL用于后續(xù)檢測。加入IPTG至終濃度0.5 mmol/L，然后16℃、110 rpm振蕩培養(yǎng)12～16 h，再取誘導(dǎo)后菌液1 mL用于SDS-PAGE檢測蛋白表達情況。

確認表達成功后，每100 mL菌液菌體沉淀使用10 mL Lysis Buffer重懸，加入PMSF至1 mmol/L，使用超聲法破碎細胞，菌液上清與鎳柱共孵育4～8 h（可隔夜掛柱）。將鎳柱裝載入蛋白純化柱，靜置沉淀，待上清流出。使用10 mL Lysis Buffer洗兩次，10 mL Wash Buffer洗兩次，收集穿透液。使用2.5 mL Elution Buffer 洗脫，每收集500 μL停止收集，孵育10 min。使用SDS-PAGE檢測蛋白純化情況。純化蛋白后，稀釋至15 mL，使用Amicon-Ultra-15超濾管（MWCO10kD，UFC901096）濃縮至500 μL。再次稀釋，濃縮，重復(fù)5次。

1.8 煙草種子處理

處理的種子為品種K326種子，包括授粉后20 d提前采收的種子（不成熟的種子）；經(jīng)過密度分選，篩選出的密度小于0.95的種子（不飽滿的種子）；經(jīng)45℃ 100%濕度老化處理5 d的種子（人工老化的種子）。

將目標多肽稀釋至目標濃度10、7.5、5、2.5、1、0 μmol/L（第一次篩選使用濃度）以及5、2、1、0.75、0.5、0.25、0 μmol/L（第二次篩選使用濃度）。使用多肽溶液浸泡煙草種子24 h，回干，將種子播到濕潤的濾紙上，每天統(tǒng)計萌發(fā)數(shù)量，并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 肽段特征分析

本研究首先以吸水萌動種子的質(zhì)譜數(shù)據(jù)為例，對數(shù)據(jù)庫進行了篩選。分別將質(zhì)譜數(shù)據(jù)搜索Nicotiana tabacum Genome Data數(shù)據(jù)庫和Uniprot數(shù)據(jù)庫。結(jié)果顯示，吸水萌動種子分別匹配到763個肽段（Nicotiana tabacum Genome Data數(shù)據(jù)庫）和1549個肽段（Uniprot數(shù)據(jù)庫）。由于搜索Uniprot數(shù)據(jù)庫獲得的肽段數(shù)量較多，后續(xù)均采用Uniprot數(shù)據(jù)庫進行分析。最終的結(jié)果顯示：干種子（CK）共計鑒定到肽段311條，匹配到蛋白114個，吸水萌動種子（WS）共計鑒定到肽段1549條，匹配到蛋白268個。而鑒定獲得的肽段的長度主要集中在6～35個氨基酸范圍內(nèi)，占全部鑒定肽段的98%以上（圖1）。

圖1 肽段長度分布

2.2 蛋白鑒定與富集分析

本研究主要關(guān)注多肽對種子萌發(fā)的影響。早期認為多肽的大小為小于100個氨基酸的蛋白分子[22]。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)很多有功能的多肽大小并不限定在100個氨基酸，并且基因組越復(fù)雜的物種，多肽的大小越大。例如快速堿化因子RALF多肽，擬南芥中最大的RALF23多肽大小為138個氨基酸，水稻中OsRALF5多肽大小為170個氨基酸，煙草中NtRALF12多肽大小為212個氨基酸。本研究為了鑒定到更多的有潛在功能的多肽分子，將整體大小定義在小于402個氨基酸的蛋白為多肽分子。因此本研究將肽段匹配到的蛋白中去除超過402個氨基酸的較大蛋白，最終得到干種子（CK）中的蛋白數(shù)量為72個，吸水萌動種子（WS）中的蛋白數(shù)量為192個。分別對得到的蛋白進行GO和KEGG注釋分析（圖2A～D）。GO富集結(jié)果顯示：干種子中（CK）的蛋白主要富集在脫落酸響應(yīng)、脂質(zhì)響應(yīng)、RNA代謝等過程（圖2A）。吸水萌動種子中（WS）的蛋白主要富集在轉(zhuǎn)錄、翻譯相關(guān)事件，同時與種子萌發(fā)相關(guān)的蛋白質(zhì)也得到富集（圖2B）。說明干種子中所富集到的蛋白質(zhì)可能更多應(yīng)對種子的氧化或者逆境脅迫。而在吸水萌動的種子中，轉(zhuǎn)錄與翻譯迅速增強，一些蛋白質(zhì)分子快速合成用于促進種子萌發(fā)、溫度響應(yīng)等過程。KEGG富集結(jié)果顯示：干種子中富集到嘧啶和嘌呤代謝，這與GO富集中UTP、GTP、CTP等合成相對應(yīng)（圖2C）。此外，吸水萌動的種子中有一類應(yīng)答低溫的蛋白質(zhì)被顯著富集（圖2D）。說明在種子萌發(fā)早期，蛋白質(zhì)除了用于形成核糖體外，也參與了溫度的響應(yīng)，這也為后續(xù)研究種子萌發(fā)過程中低溫應(yīng)答蛋白提供了參考。

注：（A）GO富集分析干種子（CK）得到的生物過程（Biological Process, BP）氣泡圖。（B）GO富集分析吸水萌動種子（WS）得到的生物過程（Biological Process, BP）氣泡圖。（C）KEGG富集分析干種子（CK）的柱狀圖。（D）KEGG富集分析吸水萌動種子（WS）的柱狀圖。

2.3 多肽的篩選與差異分析

對所匹配的蛋白質(zhì)進行篩選，將目標進一步縮小到分泌型多肽。在篩選到的小于402個氨基酸的多肽中，進一步篩選具有信號肽，能夠分泌到胞外；具有多個半胱氨酸結(jié)構(gòu)的多肽。經(jīng)過篩選后，干種子中（CK）符合條件的多肽有7個，吸水萌動的種子（WS）中符合條件的多肽有13個（表2，圖3）。吸水萌動的種子中新增多肽8個，減少多肽2個，5個多肽同時被檢測到（圖4）。

表2 多肽的質(zhì)譜結(jié)果

圖3 候選多肽A0A1S3Z8G7（A）、A0A1S4AV16（B）及A0A075F933（C、D、E、F）肽段的二級質(zhì)譜圖

圖4 煙草種子吸水萌動前后檢測多肽的韋恩圖

2.4 多肽功能探究

本研究選擇半胱氨酸含量較高的3個多肽進行原核表達，分別為：（2S sulfur-rich seed storage protein 2-like）、（Translocon- associated protein subunit beta）和（Cysteine proteinase inhibitor，）。其中，能夠順利有效表達純化（圖5A），利用處理煙草不成熟的種子、不飽滿的種子以及老化的種子。在初篩實驗中，發(fā)現(xiàn)在低濃度（0～1 μmol/L）時可以促進不成熟種子的萌發(fā)，而在高濃度（1～10 μmol/L）則會抑制不成熟種子的萌發(fā)（圖5B～C），對其他兩種種子的處理效果不明顯。進一步將0～1 μmol/L的多肽濃度進行細致劃分，發(fā)現(xiàn)隨著多肽濃度的增加，種子的萌發(fā)速率顯著地提升（圖5B～C）。因此，本研究發(fā)現(xiàn)了一種新型的多肽分子能夠促進不成熟煙草種子的發(fā)芽率和發(fā)芽速度。

注：(A)CYS3蛋白的誘導(dǎo)。(B)CYS3多肽處理不成熟煙草種子的發(fā)芽率統(tǒng)計。(C)CYS3多肽處理不成熟煙草種子的萌發(fā)狀態(tài)。

3 討論

本研究通過對煙草K326吸水萌動前后的種子進行多肽組分析，鑒定到萌動前種子肽段311條，吸水萌動后種子肽段1549條，萌動后的蛋白數(shù)量明顯多于萌動前，說明種子吸水萌動過程中大量蛋白質(zhì)的表達被激活。在去除大于402個氨基酸的蛋白后，干種子匹配到蛋白72個，吸水萌動種子匹配到蛋白192個。其中眾多蛋白沒有功能注釋信息，這些蛋白為新多肽的鑒定和功能研究提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。在篩選出的多肽中，吸水萌動的種子中檢測到了多肽：（GDSL esterase，脂肪酶）、（vignain-like，半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性）、（Protein disulfide-isomerase，催化蛋白質(zhì)中-S-S-鍵的重排）、（Cysteine protease CP8，半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性）、（2S sulfur-rich seed storage protein 2-like，營養(yǎng)儲存相關(guān)蛋白）、（Translocon- associated protein subunit beta，調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留蛋白的保留）、（late embryogenesis abundant protein D-29-like，胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白）、（uncharacterized protein LOC107769471，無功能注釋）。這些多肽的功能主要集中在對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的切割、重排和定位，進一步印證了眾多蛋白質(zhì)參與到種子的吸水萌發(fā)過程。

在生物信息學(xué)篩選的基礎(chǔ)上，本研究選取3個多肽進行表達分析，發(fā)現(xiàn)（）多肽能夠促進不成熟煙草種子的萌發(fā)，提示該多肽在種子吸水與萌發(fā)的過程中起重要功能。在鑒定到的包括在內(nèi)的多肽分子中，絕大多數(shù)都未被研究報道，這為后續(xù)研究相關(guān)多肽在低溫應(yīng)答或者其他的生物學(xué)功能方面奠定了基礎(chǔ)。本研究鑒定到的多肽中，占比最大的是富含半胱氨酸的多肽，它是一類多功能性糖蛋白，在哺乳動物中參與了生殖相關(guān)生物學(xué)過程，比如與精子成熟、精卵融合[23]。在腫瘤中，這類蛋白則參與腫瘤細胞增殖、分化、轉(zhuǎn)移和侵襲等各個生物學(xué)過程[24]。然而，在植物中這類蛋白的功能很少見到報道，本研究揭示這類蛋白可能參與了種子的萌發(fā)。

4 結(jié)論

本研究通過對煙草種子吸水萌動前后的多肽組進行分析，在干種子中鑒定到蛋白72個，主要富集在應(yīng)對種子的氧化或逆境應(yīng)答過程；在吸水萌動種子中鑒定到蛋白192個，主要富集在蛋白合成以及溫度響應(yīng)過程。進一步在干種子中篩選到7個多肽分子，在吸水萌動的種子中篩選到13個多肽分子，其中適宜濃度的多肽能夠促進不成熟煙草種子的萌發(fā)。

[1] Bewley J D. Seed germination and dormancy[J]. The Plant Cell, 1997, 9(7): 1055-1066.

[2] 李勇，逄濤，鄭昀曄，等. 煙草種子成熟過程的蛋白組學(xué)研究[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2020, 33(6): 1121-1125.

LI Yong, PANG Tao, ZHENG Yunye, et al. Proteomics research of maturing tobacco seeds[J]. Southwest China Journal of Agricuhural Sciences, 2020, 33(6): 1121-1125.

[3] Bewley J D, Bradford K J, Hilhorst H W M, et al. Seeds:Physiology of development, germination and dormancy (3rd edition)[M]. New York: Springer, 2013.

[4] 徐恒恒，黎妮，劉樹君，等. 種子萌發(fā)及其調(diào)控的研究進展[J]. 作物學(xué)報，2014, 40(7): 1141-1156.

XU Hengheng, LI Ni, LIU Shujun, et al. Research progress in seed germination and its control[J]. Acta Agronomica Sinica, 2014, 40(7): 1141-1156.

[5] Job C, Rajjou L, Lovigny Y, et al. Patterns of protein oxidation inseeds and during germination[J]. Plant Physiol, 2005, 138(2): 790-802.

[6] HE Dongli, HAN Chao, YAO Jialing, et al. Constructing the metabolic and regulatory pathways in germinating rice seeds through proteomic approach[J]. Proteomics, 2011, 11: 2693-2713.

[7] HUANG Hui, M?ller Ian Max, SONG Songquan. Proteomics of desiccation tolerance during development and germination of maize embryos[J]. J Proteomics, 2011, 75(4): 1247-1262.

[8] Sheoran I S, Olson D J H, Ross A R S, et al. Proteome analysis of embryo and endosperm from germinating tomato seeds[J]. Proteomics, 2005, 5(14): 3752-3764.

[9] Dure L, Waters L. Long-lived messenger RNA: evidence from cotton seed germination[J]. Science, 1965, 147(3656): 410-412.

[10] Nakabayashi K, Okamoto M, Koshiba T, et al. Genome-wide profiling of stored mRNA inseed germination: epigenetic and genetic regulation of transcription in seed[J]. The Plant Journal, 2005, 41(5): 697-709.

[11] Sano N, Ono H, Murata K, et al. Accumulation of long-lived mRNAs associated with germination in embryos during seed development of rice[J]. Journal of Experimental Botany, 2015, 66(13): 4035-4046.

[12] Sano N, Permana H, Kumada R, et al. Proteomic analysis of embryonic proteins synthesized from long-lived mRNAs during germination of rice seeds[J]. Plant and Cell Physiology, 2012, 53(4): 687-698.

[13] Czyzewicz N, Yue K, Beeckman T, et al. Message in a bottle: small signalling peptide outputs during growth and development[J]. Journal of Experimental Botany, 2013, 64(17): 5281-5296.

[14] Murphy E, Smith S, De Smet I. Small signaling peptides indevelopment: how cells communicate over a short distance[J]. The Plant Cell, 2012, 24(8): 3198-3217.

[15] Murphy E, De Smet I. Understanding the RALF family: a tale of many species[J]. Trends in Plant Science, 2014, 19(10): 664-671.

[16] Shiba H, Takayama S, Iwano M, et al. A pollen coat protein, SP11/SCR, determines the pollen S-specificity in the self-incompatibility ofspecies[J]. Plant Physiology, 2001, 125(4): 2095-2103.

[17] Ryan C A, Pearce G. Systemin: a polypeptide signal for plant defensive genes[J]. Annual Review of Cell and Developmental Biology, 1998, 14(1): 1-17.

[18] Sano N, Takebayashi Y, To A, et al. Shotgun proteomic analysis highlights the roles of long-lived mRNAs and de novo transcribed mRNAs in rice seeds upon imbibition[J]. Plant and Cell Physiology, 2019, 60(11): 2584-2596.

[19] WANG Xiaoyu, LI Min, LIU Xuming, et al. Quantitative proteomic analysis of castor (L.) seeds during early imbibition provided novel insights into cold stress response[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2019, 20(2): 355.

[20] Schrader M. Origins, technological development, and applications of peptidomics[J]. Methods Mol Biol , 2018,1719: 3-39.

[21] Farrokhi N, Whitelegge J P, Brusslan J A. Plant peptides and peptidomics[J]. Plant Biotechnology Journal, 2008, 6(2): 105-134.

[22] Hsu P Y, Benfey P N. Small but Mighty: Functional Peptides Encoded by Small ORFs in Plants[J]. Proteomics, 2017, 18(10): e1700038.

[23] 劉宇，肖蓉，楊東輝，等. 富含半胱氨酸分泌蛋白生物學(xué)功能的研究進展[J]. 中國細胞生物學(xué)學(xué)報，2013, 35(3): 367-373.

LIU Yu, XIAO Rong, YANG Donghui, et al. The Progress of the biological functions of cysteine-rich secretory proteins[J]. Chinese Journal of Cell Biology, 2013, 35(3): 367-373.

[24] 高萌，呼群，李超. 過表達富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白對非小細胞肺癌細胞白蛋白結(jié)合型紫杉醇敏感性的影響[J]. 中國醫(yī)藥，2020, 15(2): 221-225.

GAO Meng，HU Qun，LI Chao. Effect of up-regulating secreted protein acidic and rich in cysteine on sensitivity to nanoparticle albumin-bound paclitaxel in human non-small cell lung carcinoma[J].China Medicine, 2020, 15(2): 221-225.

Analysis of protein and peptide in tobacco seeds before and after germination

WANG Guoping1, QI Yinyao2, XU Guoyun3, LI Yuanjun1, NIU Yongzhi1, LI Xiaoxu4, QIAO Yu1, ZHENG Yunye1*

1 Yuxi Zhongyan Tobacco Seed CO., Ltd, Yuxi 653100, Yunnan, China;2 College of Biology, Hunan University, Changsha 410082, Hunan, China;3 Zhengzhou Tobacco Research Institute of China National Tobacco Corporation, Zhengzhou 450001, Henan, China;4 China Tobacco Hunan Industrial CO., Ltd, Changsha, 410001, Hunan, China

Seed germination is the basis for the establishment and normal growth of seedlings. Studying the mechanism of seed germination and identifying the functional substances are of great significance for promoting germination and improving seed vigor. In this study, we used liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS/MS) to identify the protein and peptide in tobacco seeds before and after germination. A total of 72 proteins were identified in dry seeds and 192 proteins were identified in germinating seeds. Enrichment analysis showed that the proteins in dry seeds were mainly enriched in response to oxidation or stress and the proteins in germinating seeds were mainly concentrated in the process of protein synthesis and temperature response. Seven peptides were further screened in dry seeds, and thirteen peptides were further screened in germinating seeds, among which five were common peptides. Suitable concentration of Cysteine proteinase inhibitor () can promote germination of immature tobacco seeds (harvest on the 20th day after pollination) by treating seeds with exogenous peptides. This study provides a theoretical basis for the analysis of the mechanism of seed germination at the protein level, and also offers a new understanding of the function of peptides in seed germination.

tobacco; seeds; peptides; protein; germination

Corresponding author. Email：zhengyunye2000@163.com

中國煙草總公司云南省公司科技計劃一般項目“多肽激素調(diào)控?zé)煵莘N子活力研究與應(yīng)用探索”（2021530000242033）

王國平（1989—），碩士，主要研究方向為煙草育種與種子科技，Tel：13511083113，Email：738969794@qq.com

鄭昀曄（1978—），Tel：0877-2661278，Email：zhengyunye2000@163.com

2021-07-25；

2023-01-19

王國平，齊胤堯，徐國云，等. 煙草種子萌動前后的蛋白與多肽分析[J].中國煙草學(xué)報，2023，29（5）. WANG Guoping, QI Yinyao, XU Guoyun, et al. Analysis of protein and peptide in tobacco seeds before and after germination[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2023,29(5). doi:10.16472/j.chinatobacco.2022.150