王 政，周海娟，旦增卓瑪

（1.西藏自治區(qū)獸醫(yī)生物藥品制造廠，拉薩 850004；2.西藏蓮莖生物科技有限公司，拉薩 8501414）

口蹄疫（Foot and Mouth Disease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒（Foot and Mouth Disease Virus，F(xiàn)MDV）引起牛羊等偶蹄動物的一種烈性急性接觸性傳染病，臨床特征以口腔黏膜、四肢下端及乳房等處皮膚形成水皰和爛斑為主［1，2］。FMDV 有7 個血清型，其中A 型和O 型病毒株流行范圍最廣［3］。FMD 主要流行于非洲、亞洲、中東及南美洲等地區(qū)，其中泰國、馬來西亞、緬甸、越南和柬埔寨等東南亞國家疫情形勢嚴(yán)峻［4］。該病傳染性強且傳播迅速，廣泛流行于世界各地，已嚴(yán)重阻礙了畜牧業(yè)的發(fā)展［5，6］。世界動物衛(wèi)生組織（WOAH）將FMD 列為A 類動物疫病名單之首，中國也將其列為一類動物疫?。?，8］。接種疫苗是預(yù)防和控制FMD 疫病有效的手段［9-12］，疫苗免疫效果是決定FMD 防控成敗的關(guān)鍵因素。因此，研究疫苗安全性和抗體消長規(guī)律有助于提高疫苗免疫水平，對FMD疫病預(yù)防控制具有重要的意義。

本試驗選用口蹄疫O 型、A 型二價滅活疫苗對西藏本地山羊及牦牛進(jìn)行免疫，初步確定了疫苗免疫安全性和抗體消長規(guī)律，為FMD 疫苗免疫程序及疫病防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗動物為西藏本地山羊和牦牛，經(jīng)臨床檢查健康、無臨床疾病癥狀。試驗動物按規(guī)范飼養(yǎng)，以配合飼料和青干草為主進(jìn)行飼喂。

1.2 儀器與試劑

酶標(biāo)分析儀購于北京普朗新技術(shù)有限公司，型號DNM-9602；恒溫培養(yǎng)箱購于上海鴻都科技有限公司，型號SHP-300；高速冷凍離心機(jī)購于湖南星科科學(xué)儀器有限公司，型號TGL16，其他耗材均為國產(chǎn)。

口蹄疫競爭ELISA 抗體檢測試劑盒購于蘭州獸研生物科技有限公司，批號2021121705。

1.3 方法

1.3.1 免疫前抗體檢測 對145 只山羊、60 頭牦牛進(jìn)行頸部靜脈采血，注入采血管。2 h 內(nèi)帶回實驗室，4 ℃10 000 r∕min 離心3 min，分離血清至新EP管中，4 ℃保存，用于口蹄疫抗體檢測。

1.3.2 疫苗安全性試驗 將20 只山羊、10 頭牦牛等同量分為2 組，試驗組和對照組，采用耳標(biāo)法和涂不同染料法對試驗動物進(jìn)行雙重標(biāo)記。試驗組每頭牦牛肌肉注射口蹄疫O 型、A 型二價滅活疫苗1 mL，每只山羊肌肉注射口蹄疫O 型、A 型二價滅活疫苗0.5 mL；對照組試驗動物不注射口蹄疫O 型、A 型二價滅活疫苗。免疫接種后連續(xù)觀察14 d 并記錄試驗動物的免疫反應(yīng)。

1.3.3 免疫試驗 按照口蹄疫O 型、A 型二價滅活疫苗說明書，對125 只山羊、50 頭牦牛肌肉注射疫苗。免疫后連續(xù)21 d 對試驗動物進(jìn)行臨床觀察記錄。在免疫21、60、90、120、150、180 d 分別對試驗動物進(jìn)行頸部靜脈采血，分離血清，4 ℃保存用于口蹄疫抗體檢測。

1.3.4 抗體檢測方法 用樣品稀釋液將待檢血清按1∶2（體積比）稀釋，加入25 μL 血清樣品于包被板樣品孔，再加入25 μL 樣品稀釋液；陰性、陽性標(biāo)準(zhǔn)血清不需要稀釋，在陰性、陽性對照孔內(nèi)各加入50 μL 陰性、陽性標(biāo)準(zhǔn)血清；酶標(biāo)對照孔設(shè)立2 孔，各加入50 μL 樣品稀釋液。封膜，振蕩混勻，37 ℃孵育60 min。用蒸餾水按1∶20（體積比）稀釋洗滌液。孵育結(jié)束，棄掉孔內(nèi)液體。每孔加入300 μL 洗滌液，洗滌4 次，棄液，在吸水紙上拍干。每孔加入50 μL酶標(biāo)抗體，封板，37 ℃孵育30 min。包被板洗滌4次，在吸水紙上拍干。每孔加入50 μL 底物溶液，封板，室溫避光孵育15 min。每孔加50 μL 終止液，于450 nm 波長處測定各孔吸光度。

標(biāo)準(zhǔn)樣品判定，陽性對照樣品抑制率（PI）=（1-陽性對照孔吸光度∕酶標(biāo)對照孔吸光度）×100%，大于60%；陰性對照樣品抑制率（PI）=（1-陰性對照孔吸光度∕酶標(biāo)對照孔吸光度）×100%，小于40%。

結(jié)果判定，樣品抑制率（PI）=（1-待檢樣品吸光度∕酶標(biāo)對照孔吸光度）×100%，PI＞50%為陽性，PI≤50%為陰性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010 軟件中的數(shù)據(jù)分析功能對試驗動物的血清樣品抗體水平進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 疫苗安全試驗結(jié)果

接種口蹄疫O 型、A 型二價滅活疫苗的試驗組動物均未出現(xiàn)過敏反應(yīng)、局部不適等免疫副作用。連續(xù)觀察14 d，試驗動物精神狀態(tài)良好，食欲及生長發(fā)育正常。

2.2 山羊免疫抗體檢測結(jié)果

對125 只山羊進(jìn)行免疫前和免疫后口蹄疫抗體檢測，結(jié)果表明，在免疫前125 只山羊均未檢測到口蹄疫O 型、A 型抗體；免疫后山羊檢測到口蹄疫抗體，但隨時間推移，口蹄疫O 型、A 型抗體合格率逐漸下降。在同一時間段內(nèi)，口蹄疫O 型抗體合格率明顯高于口蹄疫A 型抗體合格率（表1）。

2.3 牦牛免疫抗體檢測結(jié)果

對50 頭牦牛進(jìn)行免疫前和免疫后口蹄疫抗體檢測，結(jié)果表明，在免疫前50 頭牦牛均未檢測到口蹄疫O 型、A 型抗體；免疫后試驗牦?？谔阋逴 型、A型抗體合格率呈下降趨勢，其中免疫21 d 時口蹄疫O 型、A 型抗體合格率最高；免疫60～120 d 抗體合格率呈現(xiàn)平臺期；免疫150 d 口蹄疫A 型抗體合格率快速下降（表2）。

表2 牦牛的FMD 抗體水平檢測結(jié)果

3 討論

FMD 是以口腔黏膜、四肢下端及乳房等處皮膚水皰和爛斑為臨床特征的急性接觸性傳染?。?，2］。該病傳染性強且傳播迅速，廣泛流行于世界各地，中國已將該病列為一類動物疫病［3-5］。中國FMD 疫病防控主要策略是免疫控制，疫苗免疫是有效防控FMD 的綜合措施之一［6，7］，因此疫苗免疫效果直接影響著FMD 防控的成敗。《2022 年國家動物疫病免疫技術(shù)指南》指出，F(xiàn)MD 免疫效果評估主要以群體免疫抗體合格率為標(biāo)準(zhǔn)，抗體合格率不低于70%，判定為群體免疫合格，故研究疫苗免疫安全性和抗體消長規(guī)律對提高群體合格率及FMD 疫病防控尤為重要。

本試驗對145 只山羊、60 頭牦牛進(jìn)行FMD 抗體檢測。結(jié)果表明，試驗動物的FMD 抗體均為陰性，可以用于后續(xù)研究。對口蹄疫O 型、A 型二價滅活疫苗的安全性進(jìn)行研究，結(jié)果表明，免疫疫苗的試驗動物無免疫副作用，免疫14 d 內(nèi)均未出現(xiàn)臨床癥狀，表明該疫苗的免疫安全性良好。采用口蹄疫O型、A 型二價滅活疫苗對125 只山羊、50 頭牦牛進(jìn)行免疫并檢測FMD 抗體，結(jié)果顯示，隨著時間推移，試驗動物口蹄疫O 型、A 型抗體合格率呈逐漸下降趨勢，尤其是免疫150 d 后抗體合格率下降較快。這一現(xiàn)象在牦牛的檢測數(shù)據(jù)上更加明顯，表明FMD 疫苗具有良好的免疫安全性，在動物體內(nèi)可產(chǎn)生高水平O 型、A 型抗體且維持較長時間。但值得注意的是疫苗免疫150 d 后口蹄疫O 型、A 型抗體水平下降較快，建議此時間段進(jìn)行第二次疫苗免疫有助于提高群體抗體合格率。