呂艷麗，劉 剛，蔣桂榮，楊 蓉，王 燕，周 迪

（貴州省種畜禽種質(zhì)測(cè)定中心，貴陽(yáng) 550000）

中國(guó)畜禽遺傳資源豐富，地方優(yōu)良畜禽品種繁多，如北京番鴨、中山麻鴨、上海水牛、小尾寒羊、赤水竹鄉(xiāng)雞等。這些優(yōu)良的地方畜禽品種資源對(duì)中國(guó)畜牧業(yè)發(fā)展有重要作用。隨著生態(tài)環(huán)境的改變、新品種的大量引入、雜交技術(shù)的廣泛應(yīng)用、經(jīng)濟(jì)效應(yīng)的影響等因素，導(dǎo)致部分地方優(yōu)良品種逐漸雜化、群體數(shù)量急劇減少，甚至處于滅絕或?yàn)l臨滅絕的狀態(tài)，因此，畜禽遺傳資源的保護(hù)迫在眉睫。畜禽遺傳資源保護(hù)的方法主要有活體保護(hù)（即保種場(chǎng)、保護(hù)區(qū)）、生物冷凍保存技術(shù)（即冷凍配子、細(xì)胞、胚胎等）、基因文庫(kù)技術(shù)、體細(xì)胞克隆技術(shù)及分子遺傳標(biāo)記等［1］。精液冷凍保存技術(shù)（Semen freezing）是利用液氮（-196 ℃）或干冰（-79 ℃）等作為冷源，將動(dòng)物的精液通過(guò)特殊處理后，在超低溫環(huán)境中進(jìn)行長(zhǎng)期保存的一種方法。該技術(shù)以其優(yōu)勢(shì)在瀕危物種的資源保護(hù)工作中備受青睞，解決了人工授精受時(shí)間和空間限制的問(wèn)題，為畜禽遺傳資源保護(hù)提供了有利條件。精液冷凍保存技術(shù)在奶牛、豬、羊、馬等家畜遺傳資源保存中取得了進(jìn)展，并逐漸應(yīng)用到生產(chǎn)實(shí)踐中，是家畜遺傳資源長(zhǎng)期保存的有效方法。本研究從精液冷凍技術(shù)的發(fā)展歷程、細(xì)胞冷凍損傷機(jī)制、家畜精液的采集、精液品質(zhì)檢測(cè)、稀釋液成分、精液稀釋方法、冷凍及解凍方法等關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)，對(duì)精液冷凍技術(shù)在家畜中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為精液冷凍技術(shù)的應(yīng)用發(fā)展提供參考。

1 精液冷凍技術(shù)的發(fā)展歷程

精液冷凍技術(shù)研究已經(jīng)受到國(guó)內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注。1776 年，Lazaro Spallanzani 發(fā)現(xiàn)，將人的精液埋藏在雪中一段時(shí)間，恢復(fù)溫度后仍有少數(shù)精子可以存活［2］，這一發(fā)現(xiàn)為后來(lái)的精液冷凍技術(shù)打下了基礎(chǔ)。1949 年，Polge 等［3］發(fā)現(xiàn)在牛精液冷凍保存時(shí)加入甘油對(duì)精子具有保護(hù)作用并且通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在家禽精液稀釋液中加入20%的甘油后放置在-80 ℃短暫冷凍保存，解凍后精液能夠恢復(fù)活力。這一發(fā)現(xiàn)標(biāo)志著精液冷凍技術(shù)的誕生。此后，許多研究者相繼在牛、馬、豬、羊等多種家畜中進(jìn)行精液冷凍技術(shù)的研究，并取得了相應(yīng)成果。這些研究包括冷凍稀釋液的成分、冷凍保護(hù)劑種類及濃度、稀釋方法、冷凍方法、降溫速率及解凍方式等。隨著該技術(shù)的發(fā)展，其在畜禽種質(zhì)資源保護(hù)中發(fā)揮著越來(lái)越大的作用。

2 精液冷凍保存機(jī)理及損傷機(jī)制

精液冷凍技術(shù)是利用低溫條件下，精子的新陳代謝減弱，一切生命活動(dòng)緩慢到幾乎完全停止的狀態(tài)，從而達(dá)到長(zhǎng)期保存精液的目的。同時(shí)，冷凍保存的精子，在合適條件下（溫度、時(shí)間等）解凍復(fù)蘇后，生命活動(dòng)完全或部分恢復(fù)，其質(zhì)量足以完成正常的人工授精過(guò)程，從而解決了人工受精過(guò)程中精液受時(shí)間、空間等限制的問(wèn)題。在精液的冷凍過(guò)程中，精子會(huì)受到不同程度的化學(xué)損傷和物理?yè)p傷，從冷凍技術(shù)發(fā)展以來(lái)，對(duì)細(xì)胞冷凍損傷機(jī)制的探索沒(méi)有停止。很多學(xué)者對(duì)細(xì)胞冷凍機(jī)制做了大量研究，并提出了多種假說(shuō)。20 世紀(jì)50 年代科學(xué)家Lovelock 等提出電解質(zhì)失衡假說(shuō)，1951 年Kreyberg 提出血液循環(huán)障礙假說(shuō)，1965 年Karrow 提出結(jié)構(gòu)水假說(shuō)，1970年Meryman 提出最小臨界細(xì)胞容積假說(shuō)，1972 年Mazur提出細(xì)胞冷凍損傷的兩因素假說(shuō)等［4］。其中，細(xì)胞冷凍損傷的兩因素假說(shuō)提出以后，得到大多數(shù)學(xué)者的認(rèn)同。該假說(shuō)認(rèn)為，低溫冷凍過(guò)程中造成細(xì)胞冷凍損傷，主要是由2 個(gè)獨(dú)立因素引起的，即溶液濃度的改變和胞內(nèi)冰晶的形成，從而使得精子受到不同程度的溶液損傷（化學(xué)損傷）和胞內(nèi)冰損傷（物理機(jī)械損傷）［5］。

如圖1 所示，在精液冷凍過(guò)程中，降溫的速率對(duì)細(xì)胞損傷程度起決定性作用。當(dāng)溫度逐漸降低到溶液冰點(diǎn)時(shí)，精子外的溶液會(huì)形成冰晶（圖1B），此時(shí)若降溫速率過(guò)慢，胞外水分不斷形成冰晶，導(dǎo)致細(xì)胞外液電解質(zhì)濃度過(guò)高，胞外溶液滲透壓增大，胞內(nèi)水分不斷通過(guò)細(xì)胞膜流向細(xì)胞外，使得精子因嚴(yán)重失水發(fā)生收縮；隨著胞外冰晶持續(xù)不斷形成，細(xì)胞外液長(zhǎng)期處于高滲狀態(tài)引起細(xì)胞持續(xù)收縮，造成精子蛋白質(zhì)損傷及細(xì)胞膜的不穩(wěn)定，從而產(chǎn)生“溶液損傷”，即化學(xué)損傷（圖1C）。若此時(shí)降溫速度過(guò)快，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的水分來(lái)不及滲出就直接形成冰晶，胞內(nèi)冰晶會(huì)破壞精子的超微結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生“胞內(nèi)冰損傷”，即物理機(jī)械損傷（圖1D）。無(wú)論是快速降溫引起的胞內(nèi)冰晶損傷，還是慢速降溫引起的溶液損傷，都能導(dǎo)致精子死亡。因此，為了減少低溫冷凍過(guò)程對(duì)精子的損傷，保證精子的存活率，需要在溶液損傷和胞內(nèi)冰損傷之間找到平衡點(diǎn)，使得降溫速率低至能夠防止精子形成胞內(nèi)冰晶損傷，高到可以將溶液損傷降到最低，即最佳冷凍降溫速率。當(dāng)降溫速率低于最佳降溫速率時(shí)會(huì)導(dǎo)致精子遭受溶液損傷，而降溫速率高于最佳降溫速率時(shí)細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)冰晶，導(dǎo)致精子遭受物理機(jī)械損傷［6］。

圖1 精子冷凍過(guò)程中溶液損傷和胞內(nèi)冰晶損傷形成過(guò)程

3 家畜精液冷凍的關(guān)鍵技術(shù)

3.1 家畜精液的采集

精液的采集是制作家畜冷凍精液的重要步驟，采集精液的質(zhì)量對(duì)制作冷凍精液成功與否具有決定性作用。常用的采精方法主要有手握法、按摩法、假陰道法、電刺激法。不同家畜適宜的精液采集方式也不同。如豬精液的采集，手握法較為常見(jiàn)。此外，采集精液時(shí)需嚴(yán)格按照技術(shù)流程進(jìn)行規(guī)范操作；采集精液前需要做好衛(wèi)生清潔工作；采精時(shí)一般僅保留中段精液，以確保所采集的精液能滿足冷凍保存和受精的質(zhì)量要求。

精液冷凍前需要進(jìn)行精液質(zhì)量鑒定，主要從精液的外觀（一般包括精液顏色、氣味、采精量、質(zhì)地等）、顯微鏡觀察（精子的活率、密度和形態(tài)）等方面進(jìn)行檢查。對(duì)于家畜來(lái)說(shuō)，合格的精液一般為乳白色或淺灰色，略帶腥味，質(zhì)地均勻無(wú)水乳分離現(xiàn)象。不同物種射精量也不相同，一般情況公豬的一次射精量為200～400 mL，奶牛為5～10 mL，水牛為3～6 mL，綿羊?yàn)?.8～1.2 mL。合格的豬原精液外觀色澤正常，為乳白色，有一點(diǎn)腥味但無(wú)臭味，精液中沒(méi)有膿性分泌物及其他臟污，檢測(cè)精子密度≥2 億∕mL，活率≥90%，活力≥80%，畸形率≤10%［7］。

3.2 精液冷凍技術(shù)

3.2.1 精液稀釋液的成分 精液冷凍稀釋液主要包括冷凍保護(hù)劑、緩沖液、添加劑、抗氧化劑及抗生素等［8-10］，如表1 所示。在精液冷凍過(guò)程中，由于溫度降低，精子內(nèi)外會(huì)形成不同程度的冰晶并且導(dǎo)致細(xì)胞滲透壓改變，從而造成精子產(chǎn)生不同程度的損傷［11］，為了減輕細(xì)胞的損傷程度，需要在精液稀釋液里加入冷凍保護(hù)劑。冷凍保護(hù)劑可以改變細(xì)胞的滲透壓，防止細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間的持續(xù)嚴(yán)重脫水，減輕細(xì)胞收縮程度。此外，冷凍保存液可以有效緩解胞內(nèi)冰晶的形成，從而降低精子在冷凍過(guò)程中受到損傷的程度［12］。冷凍保護(hù)劑根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為醇類、酰胺類、糖類、蛋白質(zhì)、無(wú)機(jī)鹽等，根據(jù)作用機(jī)制可分為滲透性冷凍保護(hù)劑（丙三醇、乙二醇、丙二醇、甲醇等）和非滲透性冷凍保護(hù)劑（糖類、卵黃等）。

表1 畜禽冷凍精液稀釋液種類、作用和常用物質(zhì)

甘油是應(yīng)用較廣泛的滲透性冷凍保護(hù)劑，其可以從細(xì)胞外滲透到細(xì)胞內(nèi)，并且與膜脂的極性頭基團(tuán)形成氫鍵，阻斷水分子自由滲透，降低細(xì)胞膜內(nèi)外溶液濃度差，減少滲透性損傷。此外，甘油黏度增加可以防止溶質(zhì)共生結(jié)晶，從而改變保護(hù)劑的機(jī)械性能，減少機(jī)械損害［13-15］。研究表明，高濃度的甘油會(huì)對(duì)精子產(chǎn)生毒害作用，從而影響冷凍精子的受胎率［16］。為了減少甘油對(duì)精子的毒害作用，尋找最佳的使用濃度，許多學(xué)者對(duì)不同物種精子稀釋液中甘油適宜濃度進(jìn)行了研究。劉晉津等［17］研究表明，在豬精液抗凍保護(hù)劑中加入4%的甘油，冷凍-解凍后精子活力最佳。宋國(guó)欣等［18］的研究表明，在絨山羊精液抗凍保護(hù)劑中聯(lián)合使用海藻糖和甘油具有較好的冷凍保存效果，當(dāng)甘油濃度為1%時(shí)，精子冷凍保存效果最佳。張鵬等［19］研究發(fā)現(xiàn)，在牛冷凍精液稀釋液中添加4%的甘油，精子冷凍效果最好。郝冠英等［20］研究表明，在綿羊精液冷凍稀釋液中使用甘油與二甲基乙酰胺（DMA）協(xié)同作用可以提高精子冷凍保存的效果，并且甘油濃度為3%時(shí)效果最佳。

糖類是一種很好的非滲透性冷凍保護(hù)劑，在稀釋液中同時(shí)加入糖類和甘油，可以很好地降低精子受損傷程度，從而達(dá)到更好的冷凍保護(hù)效果。在實(shí)際研究及應(yīng)用中，通常使用葡萄糖、乳糖、果糖、甘露醇、海藻糖等糖類作為冷凍保護(hù)劑。張樹(shù)山等［21］研究表明，在豬精液冷凍稀釋液中添加海藻糖的冷凍保護(hù)效果顯著優(yōu)于蔗糖、乳糖。郭志林等［22］研究發(fā)現(xiàn)，在稀釋液中加入果糖可以提高烏骨羊精液解凍后精子的運(yùn)動(dòng)和存活能力、質(zhì)膜與頂體的完整性。劉維平等［23］研究了海藻糖對(duì)牛精液冷凍保存效果的影響，發(fā)現(xiàn)添加海藻糖能提高牛精液冷凍保存后精子存活率，添加0.06 mg∕mL 海藻糖時(shí)精子頂體完整率最高。

卵黃在精液冷凍過(guò)程中也具有很好的冷凍保護(hù)作用，卵黃中的低密度脂蛋白會(huì)依附到精子的細(xì)胞膜上，形成一種凝膠化狀態(tài)的保護(hù)膜，保護(hù)精子質(zhì)膜的完整性，避免其受到損傷，從而達(dá)到保護(hù)精子的作用，不同物種中卵黃的添加量也各不相同。研究表明，在山羊精液稀釋液中加入2.5%的卵黃，精子解凍后，用于人工授精效果較好［24］。在牛的精液稀釋液中添加8%的椰子油與20%的卵黃，可以提高解凍后精子活力［25］。在豬冷凍精液稀釋液中，研究不同濃度卵黃對(duì)冷凍后精子質(zhì)量的影響發(fā)現(xiàn)，精液冷凍稀釋液中卵黃的濃度以20%為宜［26］。張桐煒等［27］對(duì)遼寧絨山羊冷凍稀釋液的配方研究發(fā)現(xiàn)，遼寧絨山羊最適細(xì)管冷凍基礎(chǔ)稀釋液E（100 mL）配方為T(mén)ris 3.44 g、檸檬酸1.83 g、果糖1.26 g、15%的卵黃、5%的甘油。

此外，精液稀釋液的成分還包括添加劑、抗氧化劑、緩沖液等。研究表明，在豬精液冷凍稀釋液中添加咖啡因、乙酮可可堿、細(xì)胞因子、氨基多糖、抗生素等物質(zhì)，不僅可以提高精子活力，還可以延緩精子衰老［28］。在精液冷凍過(guò)程中，由于受低溫環(huán)境的影響，精子會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），過(guò)量的活性氧會(huì)對(duì)精子頂體、質(zhì)膜、蛋白質(zhì)、線粒體等結(jié)構(gòu)造成損傷，從而影響精子冷凍保存后的功能及活性［29］。為了減少ROS 對(duì)精子的損傷，可以在精子稀釋液中加入抗氧化劑，如白藜蘆醇、蝦青素和黃芪多糖等。Zhu 等［30］對(duì)豬精液冷凍保存中白藜蘆醇是否通過(guò)激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）保護(hù)豬精子免受ROS 脅迫進(jìn)行研究，結(jié)果表明，添加50 μmol∕L 白藜蘆醇可顯著提高豬精液解凍后精子的活力、質(zhì)膜及頂體的完整性、線粒體活性、谷胱甘肽（GSH）水平及AMPK 的磷酸化水平等。Guo 等［31］研究表明，在豬精液冷凍稀釋液中添加蝦青素（AST）可以抑制精子質(zhì)膜過(guò)氧化，調(diào)節(jié)質(zhì)膜脂肪酸的組成，能夠有效提高解凍后精子的質(zhì)膜及頂體的完整性、精子活力等。Weng 等［32］研究表明，在豬精液稀釋液中添加黃芪多糖可以降低ROS 的濃度，提高精子的抗氧化能力，避免精子受氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響。

3.2.2 精液的稀釋方法 常用的精液稀釋法有一次稀釋法和二次稀釋法。一次稀釋法是將精液與含有甘油的稀釋液按比例一次性稀釋后直接進(jìn)行冷凍；二次稀釋法是將精液與稀釋液Ⅰ（不含甘油）等體積混勻（降溫前），隨后緩慢降溫至5 ℃后與等體積的稀釋液Ⅱ（含有甘油）混合，置于5 ℃環(huán)境平衡5 min，使溶液中的甘油充分混勻。二次稀釋法可有效減少甘油對(duì)精液中精子的毒害作用。

根據(jù)精液分裝保存方式的不同，可分為安瓿法、顆粒法、細(xì)管法和扁平塑料袋法。顆粒法一般使用一次稀釋法制作，細(xì)管法和扁平塑料袋法常選擇二次稀釋法。在實(shí)際生產(chǎn)中，使用頻率較高的是細(xì)管凍精法，其具有冷卻迅速、密閉無(wú)菌、不易污染、操作方便等特點(diǎn)，細(xì)管保存法常用的規(guī)格有0.25、0.50、5.00 mL。Bwanga 等［33］研究發(fā)現(xiàn)，0.25 mL 細(xì)管凍后精子活率明顯高于5.00 mL 細(xì)管。薛琦［34］通過(guò)分析細(xì)管類型對(duì)豬精液冷凍保存解凍后精子活力的影響發(fā)現(xiàn)，-80 ℃條件下，0.25、0.50 mL 細(xì)管冷凍效果無(wú)明顯的差異，而-196 ℃條件下，0.50 mL 細(xì)管冷凍效果明顯優(yōu)于0.25 mL 細(xì)管。

3.2.3 精液的冷凍 精液冷凍方法主要采用的是程序冷凍法和液氮熏蒸法。程序冷凍法主要是通過(guò)程序化控制液氮噴入冷凍儀的量來(lái)控制降溫的速率。程序冷凍法可以實(shí)時(shí)監(jiān)控溫度的變化，通過(guò)控制溫度下降的速率，減少降溫速率對(duì)精子形成的損傷，但程序冷凍法對(duì)儀器設(shè)備的要求較高。液氮熏蒸法一般采用泡沫箱或自制的冷凍儀裝液氮，過(guò)程簡(jiǎn)單、快捷、易操作，對(duì)儀器設(shè)備的要求較低，但無(wú)法控制冷凍過(guò)程中溫度下降的速率。吳衍等［35］通過(guò)研究對(duì)比犬精液的冷凍方法發(fā)現(xiàn)，使用程序冷凍法的冷凍效果顯著優(yōu)于液氮熏蒸法。

3.3 冷凍精液的解凍

冷凍精液的解凍方式一般有干解法和濕解法。干解法是將冷凍的精液放置于設(shè)定溫度的水浴鍋中解凍，隨后與預(yù)熱的解凍液按一定的比例混勻。細(xì)管法凍存的精液一般使用干解法解凍。濕解法是將凍存的精子直接放到預(yù)熱的解凍液中解凍，顆粒法凍存的精液一般使用濕解法解凍。

冷凍精液的解凍溫度、時(shí)間對(duì)解凍后精子的存活率、頂體及質(zhì)膜的完整性等具有重要影響。精子在解凍時(shí)存在1 個(gè)溫度危險(xiǎn)區(qū)，即-25～-5 ℃，為避免精液解凍過(guò)程對(duì)精子造成損傷，需快速越過(guò)溫度危險(xiǎn)區(qū)，減少在溫度危險(xiǎn)區(qū)停留的時(shí)間［36］。冷凍精液解凍時(shí)，可以根據(jù)不同的解凍溫度設(shè)置不同的時(shí)間來(lái)提高解凍后精子的活力，延長(zhǎng)精子存活時(shí)間。郝愛(ài)玲等［37］通過(guò)使用不同解凍方法解凍豬冷凍精液后發(fā)現(xiàn)，50 ℃快速解凍16 s 后，置于30 ℃靜置40 s的解凍方式較38 ℃慢速解凍30 s 的精子活力好，頂體完整率高。鄭筱峰等［36］通過(guò)對(duì)姜曲海豬不同解凍方法的冷凍效果研究發(fā)現(xiàn)，在解凍精液時(shí)，直接將冷凍精液從液氮中轉(zhuǎn)移到37 ℃水浴的解凍效果（精子質(zhì)量）較置于室溫一定時(shí)間后轉(zhuǎn)移至37 ℃水浴的解凍效果好。凌培鳳［38］研究發(fā)現(xiàn)，豬冷凍精液的較佳解凍溫度及時(shí)間分別為37℃解凍30 s、65 ℃解凍5 s。王鳳改等［39］通過(guò)研究肉牛解凍溫度對(duì)精子活力的影響發(fā)現(xiàn)，39.5 ℃解凍30 s 精子活力最好。馬玉婷等［40］在牛精子活力的影響試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，牛冷凍精液解凍的較佳解凍溫度和時(shí)間分別為90 ℃解凍3～4 s、80 ℃解凍4～5 s、70 ℃解凍4～6 s 及80 ℃解凍8～9 s。

4 展望

通過(guò)不斷的研究與探索，精液冷凍保存技術(shù)在國(guó)內(nèi)外都得到了迅速發(fā)展。雖然精液冷凍技術(shù)正在逐步應(yīng)用于畜禽的精液保存中，但是仍存在很多問(wèn)題需要解決，如降低精子在冷凍過(guò)程中受損傷的程度、提高精液解凍后精子的活力、頂體及質(zhì)膜的完整性等。影響精液冷凍質(zhì)量的因素很多，如冷凍稀釋液的成分、冷凍保存液的選擇、冷凍方法、冷凍下降速率、解凍方式、解凍溫度及時(shí)間等，這些因素與精液冷凍保存成功與否有密切聯(lián)系。此外，精液冷凍的相關(guān)機(jī)理、變化規(guī)律等尚不清晰，冷凍過(guò)程中發(fā)生的分子機(jī)制及機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

精液冷凍保存技術(shù)對(duì)于畜禽遺傳資源的保存及利用具有重要意義，通過(guò)對(duì)冷凍保存關(guān)鍵技術(shù)的研究，探索適合的冷凍保存液，優(yōu)化試劑成分和物質(zhì)濃度，尋找最佳降溫速率，使用恰當(dāng)?shù)睦鋬?解凍方法及程序等，減少精子在冷凍保存中受到的化學(xué)和物理?yè)p傷，進(jìn)一步提高精子存活率及解凍后的受精能力，將有助于畜禽精液冷凍技術(shù)的建立、完善和標(biāo)準(zhǔn)化，從而加快地方優(yōu)良種質(zhì)資源的保存與利用。