許晨新，張景正，嚴(yán)寶飛，劉 嘉

（江蘇衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院藥學(xué)院，南京 211800）

黃芩為唇形科植物黃芩（Scutellaria baicalensisGeorgi）的干燥根，黃芩湯源自張仲景的《傷寒論》，是清熱解毒的經(jīng)典方劑［1］。此藥方由黃芩、芍藥、甘草和大棗4 味藥組成，具有清熱止痢的功效［2］，現(xiàn)臨床廣泛用于治療腸炎、痢疾和小兒腹瀉等［3-5］。已有研究表明，黃芩湯中的黃酮類、單萜及其苷類和三萜皂苷類成分為主要有效成分［6］，具有抑菌、解痙、解熱、鎮(zhèn)痛等藥理作用［7］。

雖然黃芩湯及其相關(guān)加減藥方制劑應(yīng)用廣泛，如芍藥湯、黃芩芍藥湯等［8，9］，但其配伍機(jī)制仍未明確。關(guān)于黃芩湯不同配伍對其溶出物影響的研究報道較少［10］，對其配伍之后化學(xué)組分的變化研究不深入?；谒幮С煞值闹讣y圖譜變化及多指標(biāo)成分定性定量分析，是探討中藥復(fù)方配伍科學(xué)內(nèi)涵的一種可行思路［11］。因此，本研究對黃芩湯及其減藥方制劑進(jìn)行分析，建立其HPLC 指紋圖譜，并以藥方中6種成分為指標(biāo)，通過高效液相色譜（HPLC）法分別對黃芩湯及其減藥方的物質(zhì)含量進(jìn)行比較分析，為深入闡述黃芩湯藥效物質(zhì)含量及其配伍機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

黃芩湯中4 味藥材產(chǎn)自4 個產(chǎn)地，購于安徽萬生中藥飲片有限公司，每袋500 g，產(chǎn)地信息見表1，經(jīng)江蘇衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院藥學(xué)院中藥教研室鑒定，各味藥材均符合《中華人民共和國藥典（2020 版）》的規(guī)定，黃芩為唇形科植物黃芩的干燥根，白芍為毛茛科植物芍藥（Paeonia lactifloraPall.）的干燥根，甘草為豆科植物甘草（Glycyrrhiza uralensisFisch.）的干燥根和根莖，大棗為鼠李科植物棗（Ziziphus jujubaMill.）的干燥成熟果實。

表1 黃芩湯各味藥材的產(chǎn)地信息

1.2 儀器和藥品

安捷倫1260 Infinity 型高效液相色譜儀、Agilent ZORBAX Extend-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）（美國Agilent 公司）；X105BDU 型十萬分之一電子分析天平、ME104E 型萬分之一電子分析天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；Heraeus Fresco 21型高速冷凍離心機(jī)［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；HH-2 型智能數(shù)顯恒溫水浴鍋（南京華思旭科學(xué)儀器有限公司）；KH5200B 型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；默克Milli-Q 實驗室純水儀（德國Milli-Q 達(dá)姆施塔特默克集團(tuán)）。

沒食子酸（批號C11987277，上海麥克林生化科技有限公司）；芍藥苷（批號RP220609）、野黃芩苷（批號RP201015）、黃芩苷（批號RP200515）、黃芩素（批號RP190604）、漢黃芩素（批號RP200729）均購于成都麥德生科技有限公司，純度均大于98%；乙腈（HPLC 色譜級，Merk 公司）；甲醇（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲酸（分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司），水為實驗室自制超純水。

1.3 試驗方法

1.3.1 色譜條件 Agilent ZORBAX Extend-C18 色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相為0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）；梯度洗脫，0～10 min，5%→8% B，10～20 min，8%→16% B，20～40 min，16%→22% B，40～50 min，22% B，50～60 min，22%→35% B，60～70 min，35%→55% B，70～80 min，55%→5% B；檢測波長為273 nm；流速為1.0 mL∕min；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為5 μL。

1.3.2 混合對照品溶液 分別精密稱取沒食子酸、芍藥苷、野黃芩苷、黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素對照品適量，加甲醇超聲至完全溶解，加超純水定容后制成質(zhì)量濃度分別為0.040、0.329、0.243、0.526、0.026、0.037 mg∕mL 的混合對照品溶液。

1.3.3 供試品溶液

1）黃芩湯水煎液的制備。稱取黃芩藥材3.0 g、白芍藥材2.0 g、甘草藥材2.0 g、大棗藥材2.0 g，加10倍量的超純水浸泡30 min，回流提取1 h，過濾，濾渣再加8 倍量超純水，回流1 h，合并濾液，濾液定容至250 mL。提取液經(jīng)12 000 r∕min 離心后，過0.45 μm濾膜，即得。

2）去黃芩減方制劑水煎液的制備。稱取去黃芩的減方制劑，白芍藥材2.0 g、甘草藥材2.0 g、大棗藥材2.0 g，加10 倍量的超純水浸泡30 min，回流提取1 h，過濾，濾渣再加8 倍量水，回流1 h，合并濾液，濾液定容至250 mL。提取液經(jīng)12 000 r∕min 離心后，過0.45 μm 濾膜，即得。

3）陰性樣品溶液的制備。根據(jù)處方比例，分別稱取黃芩、白芍、甘草和大棗單味藥材，按照黃芩湯水煎液的制備方法，制備各單味藥材的陰性樣品溶液，分別得到黃芩單煎液、白芍單煎液、甘草單煎液、大棗單煎液。

1.4 黃芩湯配伍前后HPLC 指紋圖譜的構(gòu)建

1.4.1 精密度試驗 按“1.3.3”方法制備黃芩湯水煎液，按“1.3.1”的色譜條件分別連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄色譜圖并計算各共有峰的相對保留時間和峰面積的RSD。

1.4.2 穩(wěn)定性試驗 按“1.3.3”方法制備黃芩湯水煎液，按“1.3.1”的色譜條件分別在0、4、8、12、24、48 h進(jìn)樣測定，記錄色譜圖并計算各共有峰的相對保留時間和峰面積的RSD。

1.4.3 重復(fù)性試驗 稱取同一批黃芩、白芍、甘草和大棗藥材，按上述方法平行制備6 份黃芩湯水煎液，按“1.3.1”的色譜條件分別進(jìn)行測定，記錄色譜圖并計算各共有峰的相對保留時間和峰面積的RSD。

1.5 HPLC 指紋圖譜的構(gòu)建

構(gòu)建黃芩湯、去黃芩減方制劑以及單味藥材水煎液的HPLC 指紋圖譜，將其色譜圖的AIA 數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件（2012版），以黃芩湯（S1）圖譜為參照，采用平均數(shù)法，時間寬度設(shè)置為0.1 進(jìn)行多點校正，色譜峰匹配得出對照圖譜，以對照指紋圖譜為參照進(jìn)行相似度評價。

1.6 黃芩湯配伍前后主要成分的HPLC 測定

1.6.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 精密吸取對照品溶液、黃芩湯水煎液和空白溶液，分別注入高效液相色譜儀進(jìn)樣分析，記錄其色譜圖。

1.6.2 線性關(guān)系考察 分別精密吸取混合對照品溶液1、2、4、8、10、20 μL 注入高效液相色譜儀，按“1.3.1”的色譜條件進(jìn)樣分析，記錄其色譜圖。以對照品進(jìn)樣量（X）對峰面積（Y）進(jìn)行線性回歸分析。

1.6.3 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液5 μL，按“1.3.1”的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄其色譜圖，計算沒食子酸、芍藥苷、野黃芩苷、黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素6 種成分峰面積的RSD。

1.6.4 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一黃芩湯供試品溶液5 μL，按“1.3.1”的色譜條件分別于0、1、2、3 d 進(jìn)樣分析，記錄其色譜圖，計算沒食子酸、芍藥苷、野黃芩苷、黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素6 種成分峰面積的RSD。

1.6.5 重復(fù)性試驗 分別稱取黃芩、白芍、甘草和大棗藥材，按“1.3.3”的方法平行制備6 份黃芩湯水煎液，按“1.3.1”的色譜條件分別進(jìn)行測定，記錄色譜圖，并計算上述6 種成分峰面積的RSD。

1.6.6 加樣回收率試驗 取已知含量的黃芩湯方劑中4 味藥材9 份，每3 份一組，按高、中、低3 個水平精密加入適量混合對照品溶液，按“1.3.1”的色譜條件進(jìn)樣測定，計算其加樣回收率。

1.6.7 樣品含量測定 按“1.3.3”的條件制備樣品溶液，按“1.3.1”的色譜條件測定黃芩湯、去黃芩減方制劑、黃芩單煎液和白芍單煎液4 種樣品中沒食子酸、芍藥苷、野黃芩苷、黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素6 種成分的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃芩湯水煎液的穩(wěn)定性分析

精密度試驗結(jié)果顯示，制備的黃芩湯水煎液各共有峰的相對保留時間的RSD為0.02%～1.33%，共有峰面積的RSD為0.04%～1.79%，說明儀器精密度良好。穩(wěn)定性試驗結(jié)果顯示，制備的黃芩湯水煎液各共有峰的相對保留時間的RSD為0.02%～1.69%，共有峰面積的RSD為0.03%～2.02%，說明供試品溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定。重復(fù)性試驗結(jié)果顯示，制備的黃芩湯水煎液各共有峰的相對保留時間的RSD為0.05%～2.16%，共有峰面積的RSD為0.06%～2.62%，說明該方法的重復(fù)性良好。

2.2 黃芩湯配伍前后HPLC指紋圖譜及相似度分析

黃芩湯水煎液、去黃芩減方制劑水煎液以及單味藥材水煎液的HPLC 指紋圖譜見圖1，對照（R）指紋圖譜見圖2，經(jīng)數(shù)據(jù)處理后共標(biāo)定13 個色譜峰。以對照指紋圖譜為參照進(jìn)行相似度評價，相似度結(jié)果見表2。由相似度結(jié)果可知，黃芩湯（S1）與黃芩單煎液（S2）相似度大于0.99，黃芩湯（S1）與去黃芩減方制劑（S3）、白芍單煎液（S4）、甘草單煎液（S5）和大棗單煎液（S6）的相似度均小于0.10，說明黃芩湯中主要成分是黃芩單味藥材的物質(zhì)成分。

圖1 黃芩湯、去黃芩減方制劑以及單味藥材水煎液的HPLC 指紋圖譜

圖2 對照（R）指紋圖譜

表2 黃芩湯配伍前后相似度分析結(jié)果

2.3 黃芩湯配伍后色譜峰的歸屬

結(jié)合對照品、色譜峰保留時間對黃芩湯配伍后的13 個色譜峰進(jìn)行了歸屬分析。黃芩湯水煎液中，峰1、峰2 兩個色譜峰來自白芍；峰3 至峰13 色譜峰來自黃芩。

2.4 黃芩湯配伍前后主要成分的HPLC測定與分析

2.4.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 由圖3 可知，對照品溶液、黃芩湯水煎液和空白溶液的色譜峰基線平穩(wěn)，且其分離度均大于1.5，空白溶液無干擾，試驗方法專屬性良好。

2.4.2 線性關(guān)系考察 以對照品進(jìn)樣量（X）對峰面積（Y）進(jìn)行線性回歸分析，回歸方程見表3。相關(guān)關(guān)系R2均大于0.990 0，表明各成分在線性范圍內(nèi)關(guān)系良好。

表3 各成分回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍

2.4.3 精密度試驗 混合對照品溶液6 個成分峰面積的RSD為0.87%～1.34%，表明試驗儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 同一黃芩湯供試品溶液6 個成分峰面積的RSD為1.39%～3.22%，表明黃芩湯供試品在3 d 內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 重復(fù)性試驗 分別稱取黃芩、白芍、甘草和大棗藥材，平行制備6 份黃芩湯水煎液進(jìn)行測定，得到6 個成分峰面積的RSD均小于4%，說明該方法的重復(fù)性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗 結(jié)果表明，沒食子酸、芍藥苷、野黃芩苷、黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素的平均加樣回收率分別為96.12%、94.33%、93.75%、103.22%、94.86%、96.32%，其RSD分別為2.62%、3.13%、2.69%、2.04%、2.77%、3.04%，6種成分的回收率均符合要求。

2.5 黃芩湯配伍前后的化學(xué)成分變化分析

分別對黃芩湯、去黃芩減方制劑、黃芩單煎液和白芍單煎液的化學(xué)成分含量進(jìn)行比較，結(jié)果見圖4。如圖4（a）所示，黃芩配伍后，其中野黃芩苷含量升高，黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素3 種成分含量降低，說明黃芩配伍后，處方中其余3 種藥材的溶出影響黃芩中有效成分的溶解。如圖4（b）所示，從沒食子酸和芍藥苷來看，黃芩湯和去黃芩減方制劑與白芍單煎液相比，其中沒食子酸和芍藥苷含量均有所降低。

圖4 黃芩湯配伍前后化學(xué)成分含量變化

3 討論

中藥復(fù)方的藥效成分可能并非單味藥材中的物質(zhì)，其在煎煮過程中也會產(chǎn)生相互作用［12］。由于中藥復(fù)方成分的復(fù)雜性、復(fù)方配伍的整體性，導(dǎo)致其在物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)理方面的研究存在一定困難。中藥指紋圖譜是通過現(xiàn)代化的分析技術(shù)揭示某種中藥、中藥復(fù)方中藥效物質(zhì)基礎(chǔ)特征的圖譜［13］。因此，將其應(yīng)用在中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究上具有一定意義。黃芩湯作為傳統(tǒng)方劑，其化學(xué)成分諸多且藥理作用多樣，臨床上應(yīng)用廣泛。本研究通過HPLC 方法，建立了黃芩單味藥材、黃芩湯以及去黃芩湯劑的指紋圖譜，通過對比研究發(fā)現(xiàn)，黃芩單煎液的HPLC 譜圖與黃芩湯的HPLC 譜圖相比，其色譜峰數(shù)目較少，基線平緩，而黃芩湯色譜峰數(shù)目增加，且有些色譜峰的分離度較差，可能與中藥復(fù)方配伍后其中化學(xué)成分變化有關(guān)。

基于HPLC 分析方法，以其中6 種成分為評價指標(biāo)，分別對黃芩湯、去黃芩湯劑、黃芩單煎液以及白芍單煎液進(jìn)行比較分析，試驗結(jié)果表明，黃芩配伍后，原黃芩單味藥材中的黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素含量減少，野黃芩苷含量增加，原白芍單味藥材中的沒食子酸和芍藥苷含量降低，說明藥材配伍后藥物彼此之間有一定影響［14］。本研究結(jié)果為黃芩湯配伍后藥效物質(zhì)含量及其配伍機(jī)制提供理論依據(jù)。