胡志萍，甘 寧，李 嫚，付皓云，胡齊欣

（湖北省腫瘤醫(yī)院，湖北 武漢 430079）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC） 是全球健康的重大威脅之一，雖然目前人類已經(jīng)在肝癌預防方面取得了巨大的進展，但是肝癌的總發(fā)病率和死亡率仍在持續(xù)上升［1］。有研究發(fā)現(xiàn)，表皮因子生長受體 （epidermal growth factor receptor，EGFR） 可以作為轉(zhuǎn)錄因子直接參與調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄，間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子 （mesenchymalepithelial transition factor，MET） 與癌細胞的惡性表型密切相關［2］。黃芩具有解熱、抗菌、抗炎、抗氧化等藥理作用［3-4］，黃芩苷是其主要成分之一。有較多研究表明，黃芩苷能通過各種信號通路對肝癌細胞增殖、遷移和凋亡產(chǎn)生影響［5-7］，但其對MET/EGFR 通路的作用機制以及其生物學功能尚不明確。本研究以黃芩苷、MET 抑制劑克唑替尼和EGFR 抑制劑吉非替尼處理人肝癌HepG-2 細胞，通過檢測MET/EGFR 信號通路相關的通路蛋白表達探討黃芩苷對肝癌細胞的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 細胞 人肝癌HepG-2 細胞購自中國科學院上海細胞庫，由武漢華聯(lián)科生物技術有限公司實驗室保種。

1.2 試劑與藥物 黃芩苷（上海阿拉丁生化科技有限公司，批號B110209）。MET 抑制劑克唑替尼、EGFR 抑制劑吉非替尼（美國MedChemExpress 公司，批號HY-50878、HY-50895）。MEM 培養(yǎng)基（天津市灝洋生物制品科技有限責任公司，貨號TBD32561）； 胎牛血清（武漢普諾賽生命科技有限公司，批號164210）； 磷酸緩沖鹽溶液（PBS）、0.25%胰蛋白酶（南京森貝伽生物科技有限公司，批號BL-O003、SBJ-L0045）； CCK8 試劑、MET、EGFR、β-actin（武漢貝茵萊生物科技有限公司，批號C1706、PAB36425、PAB30672、PAB36265）； AnnexinV-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒（上海撫生實業(yè)有限公司，批號FS-79505）； PI/Rnase Staining Buffer Solution （上海谷研實業(yè)有限公司，批號GOY-K14070）； p-MET、p-EGFR （英國Abcam 公司，批號ab5662、ab40815）。

1.3 儀器 倒置熒光顯微鏡（東莞市瑞顯光學儀器有限公司）； SpectraMax 酶標儀［美谷分子儀器（上海） 有限公司］；流式細胞儀（美國Agilent 公司）； 電泳儀（美國Bio-Rad 公司）； 全自動化學發(fā)光分析儀（上海天能科技有限公司）。

1.4 黃芩苷最適質(zhì)量濃度、作用時間篩選 HepG-2 細胞以每孔3.0×103個的密度接種于96 孔板，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細胞貼壁后棄培養(yǎng)基，分別加入含0、2.5、5、7.5、10、12.5 μg/mL 黃芩苷的培養(yǎng)基［6］，每組3 個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48 h，每孔加入10 μL CCK8 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，在酶聯(lián)免疫檢測儀450 nm波長處測量各孔吸光度，設置調(diào)零孔（僅加培養(yǎng)基和CCK8 溶液），計算細胞增殖抑制率。

1.5 分組與給藥 HepG-2 細胞以每孔3×103個的密度接種于96 孔板，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細胞貼壁后，分為對照組、黃芩苷組（12.5 μg/mL）、克唑替尼組 （1 μmol/L）、黃芩苷＋克唑替尼組 （12.5 μg/mL＋1 μmol/L）、吉非替尼組（1 μmol/L）、黃芩苷＋吉非替尼組（12.5 μg/mL＋1 μmol/L）、克唑替尼＋吉非替尼組（1 μmol/L＋1 μmol/L）、黃芩苷＋克唑替尼＋吉非替尼組（12.5 μg/mL＋1 μmol/L＋1 μmol/L），棄舊培養(yǎng)基，加入含相應劑量藥物的新培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h。

1.6 CCK-8 檢測細胞增殖抑制率 細胞按“1.5” 項下方法處理，48 h 后每孔加入10 μL CCK8 溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，在酶聯(lián)免疫檢測儀450 nm 波長處測量吸光度，設置調(diào)零孔（僅加培養(yǎng)基和CCK8 溶液），計算細胞增殖抑制率。

1.7 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 收集各組細胞，每組約1×106個，4 ℃、400×g離心5 min，重懸于200 μL PBS 中，加入10 μL Annexin V-FITC、10 μL 碘化丙啶（propidium，PI），混勻后4 ℃避光孵育30 min，加入300 μL PBS 上機檢測，通過NovoExpress 軟件進行分析。

1.8 流式細胞儀檢測細胞周期 收集各組細胞，每組約1×107個，4 ℃、400×g離心5 min，重懸于300 μL PBS 中，加入700 μL 無水乙醇，置于-20 ℃冰箱中固定24 h 以上，4 ℃、700×g離心5 min，100 μL 1 mg/mL RNase A 溶液重懸細胞，于37 ℃培養(yǎng)箱中消化細胞RNA 30 min，加入400 μL 50 μg/mL PI 溶液，4 ℃避光孵育10 min，上機檢測，通過NovoExpress 軟件進行分析。

1.9 Western blot 法檢測細胞MET、EGFR 蛋白表達 取各組細胞，裂解提取蛋白，離心后取上清液，蛋白定量后進行變性，經(jīng)SDS-PAGE 電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%脫脂奶粉溶液室溫封閉過夜，加一抗室溫孵育1 h，PBST 洗滌3次，加HRP 標記的二抗（1 ∶10 000） 室溫孵育1 h，PBST洗滌3 次，加入ECL 發(fā)光液，于全自動化學發(fā)光分析儀中顯影，通過TANON GIS 軟件讀取相關條帶灰度值，以βactin 為內(nèi)參，計算目的蛋白相對表達。

1.10 統(tǒng)計學分析 通過SPSS 19.0 軟件進行處理，計量資料以（±s） 表示，2 組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芩苷最適質(zhì)量濃度、作用時間篩選 如表1 所示，除12.5 μg/mL 外，其他質(zhì)量濃度黃芩苷在干預12、24、48 h 后均對HepG-2 細胞增殖抑制率無明顯影響 （P＞0.05）； 12.5 μg/mL 黃芩苷干預12、24、48 h 后，HepG-2細胞增殖抑制率升高（P＜0.05），以48 h 最顯著，因此選擇12.5 μg/mL 黃芩苷作用48 h。

表1 不同質(zhì)量濃度黃芩苷作用不同時間對HepG-2 細胞增殖抑制率的影響（±s，n＝3）

表1 不同質(zhì)量濃度黃芩苷作用不同時間對HepG-2 細胞增殖抑制率的影響（±s，n＝3）

注： 與同一作用時間其他質(zhì)量濃度比較，*P＜0.05。

黃芩苷/（μg·mL-1）時間12 h24 h48 h 2.5-0.17±4.42-0.71±1.25-0.39±2.60 5-2.05±4.051.58±1.950.74±2.13 7.51.07±2.22-1.57±1.982.92±2.68 10-0.92±1.50-1.33±0.654.86±1.87 12.56.66±2.48*9.75±1.03*23.26±1.37*

2.2 黃芩苷和MET、EGFR 信號通路抑制劑對HepG-2 細胞凋亡、增殖的影響 與對照組比較，其余組細胞凋亡率和G1期細胞比例升高（P＜0.05），黃芩苷＋吉非替尼組細胞凋亡率和G1期細胞比例高于吉非替尼組（P＜0.05），黃芩苷＋克唑替尼組細胞凋亡率和G1期細胞比例高于克唑替尼組（P＜0.05），黃芩苷＋克唑替尼＋吉非替尼組細胞凋亡率和G1期細胞比例高于克唑替尼＋吉非替尼組（P＜0.05），見圖1～2、表2。

圖1 各組HepG-2 細胞凋亡情況

圖2 各組HepG-2 細胞周期變化

表2 各組HepG-2 細胞凋亡率、細胞周期比較（±s，n＝3）

表2 各組HepG-2 細胞凋亡率、細胞周期比較（±s，n＝3）

注： 與對照組比較，*P＜0.05； 與克唑替尼組比較，＃P＜0.05；與吉非替尼組比較，△P ＜0.05； 與克唑替尼＋吉非替尼組比較，▲P＜0.05。

組別凋亡率/%G1 期細胞比例/%對照組2.34±1.3036.05±0.52黃芩苷組34.48±0.20*49.74±0.29*克唑替尼組18.16±0.8844.65±1.34黃芩苷＋克唑替尼組43.17±0.64＃53.02±0.60＃吉非替尼組23.03±0.7345.88±0.39黃芩苷＋吉非替尼組47.22±1.08△54.60±0.59△克唑替尼＋吉非替尼組38.06±1.1249.44±0.73黃芩苷＋克唑替尼＋吉非替尼組 52.51±0.18▲59.86±0.55▲

2.3 黃芩苷和MET、EGFR 信號通路抑制劑對HepG-2 細胞增殖抑制率的影響 與對照組比較，其余組細胞增殖抑制率均升高（P＜0.05），黃芩苷＋吉非替尼組細胞增殖抑制率高于吉非替尼組（P＜0.05），黃芩苷＋克唑替尼組細胞增殖抑制率高于克唑替尼組（P＜0.05），黃芩苷＋克唑替尼＋吉非替尼組細胞增殖抑制率高于克唑替尼＋吉非替尼組（P＜0.05），見表3。

表3 各組HepG-2 細胞增殖抑制率比較（±s，n＝3）

表3 各組HepG-2 細胞增殖抑制率比較（±s，n＝3）

注： 與對照組比較，*P＜0.05； 與克唑替尼組比較，＃P＜0.05；與吉非替尼組比較，△P ＜0.05； 與克唑替尼＋吉非替尼組比較，▲P＜0.05。

組別增殖抑制率/%對照組0.00±0.93黃芩苷組29.35±0.54*克唑替尼組13.90±1.33黃芩苷＋克唑替尼組37.29±0.41＃吉非替尼組17.22±0.04黃芩苷＋吉非替尼組39.94±0.41△克唑替尼＋吉非替尼組31.87±0.46黃芩苷＋克唑替尼＋吉非替尼組45.95±0.33▲

2.4 黃芩苷和MET、EGFR 信號通路抑制劑對MET/EGFR信號通路蛋白表達的影響 與對照組比較，其余組細胞p-MET、p-EGFR 蛋白表達降低（P＜0.05），黃芩苷＋吉非替尼組細胞p-MET、p-EGFR 蛋白表達低于吉非替尼組（P＜0.05），黃芩苷＋克唑替尼組細胞p-MET、p-EGFR 蛋白表達低于克唑替尼組（P＜0.05），黃芩苷＋克唑替尼＋吉非替尼組細胞p-MET、p-EGFR 蛋白表達低于克唑替尼＋吉非替尼組（P＜0.05），見表4、圖3。

圖3 各組HepG-2 細胞MET/EGFR 通路蛋白條帶

表4 各組HepG-2 細胞MET/EGFR 信號通路蛋白表達比較（±s，n＝3）

表4 各組HepG-2 細胞MET/EGFR 信號通路蛋白表達比較（±s，n＝3）

注： 與對照組比較，*P＜0.05； 與克唑替尼組比較，＃P＜0.05； 與吉非替尼組比較，△P＜0.05； 與克唑替尼＋吉非替尼組比較，▲P＜0.05。

組別METp-METEGFRp-EGFR對照組1 412.33±38.891 183.67±50.611 424.67±32.02932.67±28.50黃芩苷組1 467.00±23.261 067.00±39.15*1 399.33±35.70770.00±31.80*克唑替尼組1 429.00±41.15836.00±26.511 409.67±39.21690.33±27.10黃芩苷＋克唑替尼組1 426.00±36.04755.33±30.57＃1 400.00±33.60652.33±24.34＃吉非替尼組1 462.67±28.291 046.67±23.031 452.67±38.07555.67±20.40黃芩苷＋吉非替尼組1 382.00±46.00900.67±24.13△1 454.33±28.02467.67±21.13△克唑替尼＋吉非替尼組1 382.00±44.03614.00±16.521 441.00±39.61378.00±21.28黃芩苷＋克唑替尼＋吉非替尼組1 360.33±47.75496.33±25.77▲1 460.67±34.59261.00±22.91▲

3 討論

黃芩是我國傳統(tǒng)中藥材，主產(chǎn)于河北、山東等地，具有解熱、抗菌、抗炎、抗氧化等藥理作用［8-9］。Oh 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，從甘草中提取的甘草查爾酮可以通過抑制EGFR和MET 來抑制肺癌細胞活性。傳統(tǒng)中藥在治療癌細胞中的價值越來越高。本研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷干預后HepG-2 細胞增殖抑制率升高，與MET、EGFR 信號通路抑制劑單獨干預的效果相似； 黃芩苷與MET、EGFR 信號通路抑制劑同時干預，能夠達到更好的HepG-2 細胞增殖抑制效果，與先前大鼠膽汁中黃芩苷的代謝物黃芩素6-O-β-D-葡萄糖醛酸苷的研究相類似［11］。

細胞凋亡作為程序性細胞死亡，在正常組織的發(fā)育和體內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起著重要的作用，不正常的凋亡可能表現(xiàn)為癌癥或自身免疫疾?。?2-13］。細胞凋亡減少和細胞周期縮短都是腫瘤細胞的特點之一。細胞凋亡與細胞周期也有一定的關系，誘導細胞凋亡信號通路的激活會終止細胞周期進程［14］。目前已有研究指出，黃芩苷能夠通過PI3K/Akt/mTOR 途徑和線粒體功能障礙來抑制人軟骨肉瘤細胞生長和促進細胞凋亡［15］。黃芩苷與信號通路調(diào)控細胞的凋亡和細胞周期密切相關［16-17］。本研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷干預后HepG-2 細胞凋亡率和G1期細胞比例升高，與MET、EGFR信號通路抑制劑單獨干預的效果相似，且聯(lián)合干預也能獲得更好效果。這與黃芩苷可能通過JNK/FoxO1/BIM 信號通路抑制胰腺癌SW1990 細胞的增殖并促進其凋亡的研究［18］及黃芩苷能夠抑制慢性糜爛性胃炎濁毒患者體內(nèi)的Met 信號來減少炎癥并恢復細胞周期的研究相一致［19］。

MET/EGFR 信號通路與肝臟發(fā)育、增殖和肝細胞癌的發(fā)生密切相關［20］。該通路的研究已經(jīng)成為了癌癥治療的一大突破口。本研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷干預后HepG-2 細胞中p-MET 和p-EGFR 蛋白表達均降低，表明黃芩苷具有抑制MET 和EGFR 信號通路的效果； 且黃芩苷和MET、EGFR信號通路抑制劑聯(lián)合干預后，MET、EGFR 通路蛋白表達降低更顯著，提示黃芩苷能單獨作為MET 和EGFR 信號通路的蛋白抑制劑，同時也能夠增強這2 條信號通路蛋白抑制劑的抑制作用。MET/EGFR 信號通路可作為多種中藥發(fā)揮藥效的信號通路，例如白藜蘆醇能夠靶向EGFR 和c-Met 信號通路來抑制非小細胞肺癌細胞增殖［21］。

綜上所述，黃芩苷對人肝癌細胞有明顯的抑制作用，對其凋亡和細胞周期較大影響，并且可能通過抑制MET/EGFR 信號通路來調(diào)控其細胞增殖和凋亡，提示黃芩苷有治療肝癌的潛力。