汪 茜，周泉佚

（定西市種草飼料站，甘肅 定西 743000）

纖維素是地球上最豐富的天然有機(jī)物，也是一種極其豐富的可再生資源，廣泛存在于自然界中，占植物界總碳含量的50%以上。我國(guó)的秸稈資源非常豐富，據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年秸稈產(chǎn)量超過(guò)8億t，占世界秸稈總產(chǎn)量的1/5[1]。但這些豐富的秸稈資源利用率非常低，主要原因是秸稈中含有大量的纖維素、木質(zhì)素以及半纖維素等難以降解的成分，而且纖維素除了反芻動(dòng)物可以利用部分外，豬、雞等單胃動(dòng)物都無(wú)法利用。利用化學(xué)方式處理和加工秸稈是比較普遍的做法，主要是通過(guò)酸性或者堿性的化學(xué)物質(zhì)對(duì)秸稈進(jìn)行處理。酸堿處理對(duì)分解玉米秸稈纖維素具有一定效果，但處理后的玉米秸稈需進(jìn)行沖洗或者中和酸堿后才能飼喂或者發(fā)酵，不僅浪費(fèi)了水資源，而且產(chǎn)生的廢液也會(huì)造成環(huán)境污染。除了用酸堿處理秸稈外，生產(chǎn)中使用較多的化學(xué)處理方法還有氨化法，氨化后的秸稈木質(zhì)纖維素被破壞，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值提高，但也有研究表明用尿素氨化后的秸稈殘氮量較低[2]，而且在生產(chǎn)中應(yīng)用氨化法成本較高。因此，用生物方法分解秸稈纖維素已成為飼料工業(yè)研究和發(fā)展的方向之一。

目前，纖維素的利用方法主要包括傳統(tǒng)方法和酶解方法。傳統(tǒng)方法主要指堆肥、青貯等發(fā)酵方式[3-4]。酶解法雖然應(yīng)用不廣泛，但卻是目前最成熟的生物降解方法，它利用某些微生物產(chǎn)生的纖維素酶將秸稈中的纖維素水解成纖維素二糖或葡萄糖[5-7]，使纖維素進(jìn)一步分解，增加可溶性糖的含量，使其更容易被家畜消化。秸稈分解過(guò)程中需要多種酶，其中纖維素酶對(duì)促進(jìn)秸稈降解起著重要作用，但是自然環(huán)境中的秸稈纖維素分解菌較少，其在土壤中產(chǎn)生的纖維素酶活性較低，無(wú)法完全降解自然環(huán)境中的秸稈纖維素，因此添加外源秸稈分解菌成為促進(jìn)秸稈纖維素降解的有效途徑[8]。本研究旨在從自然腐殖土樣中篩選出分解秸稈能力強(qiáng)且可以應(yīng)用于秸稈發(fā)酵的菌株，從而為飼用秸稈中纖維素的降解提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

土壤取樣：在枯枝落葉腐爛較嚴(yán)重處采集腐殖土，地點(diǎn)位于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地，使用土鉆從地表0～20 cm處采集土壤樣品，取回的土樣放置于陰涼處風(fēng)干，備用。

1.2 培養(yǎng)基

初選平板培養(yǎng)基為羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基[9]：羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）10 g，Na2HPO42.5 g，KH2PO41.5 g，蛋白2.5 g，酵母膏0.5 g，瓊脂18 g，去離子水1 000 mL。pH值為7.0～7.4。

復(fù)選平板培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，去離子水1 000 mL。

以上培養(yǎng)基均在121 ℃高溫滅菌25 min后使用。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌株的分離與篩選 首先，配制羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基，將其倒入培養(yǎng)皿中，使用前倒置1 d。將采集的腐殖土樣稱量10 g，倒入裝有90 mL無(wú)菌水的三角瓶中，密封后將三角瓶置于搖床上振蕩15 min，靜置；將1 mL上清液加入裝有9 mL無(wú)菌水的1號(hào)試管中，混合均勻后，將1號(hào)試管中的溶液吸取1 mL加入裝有9 mL無(wú)菌水的2號(hào)試管中，依次處理3號(hào)試管，得到稀釋土壤樣品的濃度為10-2、10-3、10-4。將上述土壤樣品稀釋液均勻涂布于培養(yǎng)基上，每個(gè)梯度設(shè)置5個(gè)重復(fù)。接種完成后將所有培養(yǎng)皿倒置，并在25 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。7 d后，將質(zhì)量濃度為1 mg/mL的剛果紅（CR）溶液覆蓋在長(zhǎng)出菌落的培養(yǎng)基上，15 min后將CR溶液倒出，再繼續(xù)加入質(zhì)量濃度為1 mol/L的NaCl溶液，15 min后再將NaCl溶液倒出，此時(shí)產(chǎn)生纖維素酶的菌落周圍將會(huì)出現(xiàn)一個(gè)透明圈[10-13]。

菌株的初步篩選采用剛果紅染色法[14]。染色結(jié)束后，在纖維素分解菌分解的位置會(huì)形成透明的水解圈，通過(guò)測(cè)量菌落直徑以及透明圈直徑，從而計(jì)算水解圈R（D/d），對(duì)纖維素分解菌的分解能力進(jìn)行初步篩選判斷。

水解圈R=透明圈直徑（D）/菌落直徑（d）（1）

式中，R值表示透明圈直徑與菌落直徑的比值，一般來(lái)講，纖維素分解菌的降解能力與R值呈正相關(guān)關(guān)系。R值作為纖維素降解能力的參數(shù)之一，可用于初步篩選菌株是否具有降解纖維素的能力。

1.3.2 菌株的純化 將篩選出的菌株轉(zhuǎn)接到裝有馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)7 d，重復(fù)多次進(jìn)行純化，將得到的純菌株進(jìn)行編號(hào)并保存[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 土樣初篩結(jié)果

利用羧甲基纖維素固體培養(yǎng)基從腐殖土中初步分離出纖維素分解菌，經(jīng)過(guò)多代分離純化和篩選比較，得到2株具有纖維素分解能力的菌株，分別標(biāo)記為F-1和F-2，2個(gè)菌株在羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速率見(jiàn)表1。

表1 菌株在羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速率

從表1可以看出，F(xiàn)-1和F-2在羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基上都能較好地生長(zhǎng)。土樣稀釋液濃度為10-3時(shí)，F(xiàn)-1和F-2在培養(yǎng)第3天時(shí)的菌落數(shù)量和菌落平均直徑差別不明顯，土樣稀釋液濃度為10-4時(shí)，F(xiàn)-1在培養(yǎng)第3天時(shí)的菌落數(shù)量比F-2多，且菌落平均直徑比F-2大。從培養(yǎng)第6天的菌落數(shù)量來(lái)看，無(wú)論土樣稀釋液濃度為10-3還是10-4，2種菌株的菌落數(shù)量均發(fā)生明顯變化，F(xiàn)-1的菌落數(shù)量明顯多于F-2，但2種菌株的菌落平均直徑大致相同。

2.2 剛果紅染色結(jié)果

剛果紅染色法基本原理是剛果紅可以與培養(yǎng)基中的纖維素形成紅色復(fù)合物，但當(dāng)纖維素酶將纖維素分解后，剛果紅與纖維素的復(fù)合物就無(wú)法形成，會(huì)在培養(yǎng)基中出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈，因此是否產(chǎn)生透明圈可以作為纖維素分解菌的一個(gè)初篩標(biāo)準(zhǔn)。將剛果紅染液倒入含有纖維素的培養(yǎng)基中，再用NaCl漂洗，可以洗去結(jié)合不牢的剛果紅，從而留下大大小小的透明圈。剛果紅染色法處理后3個(gè)梯度的菌落及透明圈見(jiàn)圖1。

圖1 不同梯度的菌落透明圈

通過(guò)剛果紅染色發(fā)現(xiàn)，在稀釋濃度為10-3和10-4的平板培養(yǎng)皿中，可觀察到一些菌落周圍有清晰的透明圈。具有清晰透明圈的菌株有2種，分別挑取這2種菌落轉(zhuǎn)接于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行進(jìn)一步純化。由于稀釋濃度10-2過(guò)大，無(wú)法準(zhǔn)確觀察到菌落周圍的透明圈，所以不作比較。結(jié)果表明，以腐殖土為材料的土壤稀釋液中可提取出2株纖維素分解菌，2株菌株在不同稀釋濃度下的菌落直徑及菌落周圍透明圈的直徑比較見(jiàn)表2。

表2 不同稀釋濃度下的菌落直徑及菌落周圍透明圈直徑

在用剛果紅染色法處理過(guò)的培養(yǎng)基上可以看到清晰的透明圈，通過(guò)測(cè)量不同梯度下2株菌株的菌落直徑以及菌落周圍的透明圈直徑，可以計(jì)算出不同梯度下透明圈與菌落直徑的比值，從而初步判斷2株菌株對(duì)纖維素的分解能力。結(jié)果顯示，在稀釋濃度為10-3和10-4時(shí)，F(xiàn)-2的透明圈直徑均比F-1的大，而且F-2的透明圈直徑與菌落直徑的比值也比F-1的大。綜合可知，在稀釋梯度為10-3和10-4時(shí)，F(xiàn)-2菌株對(duì)纖維素的分解能力要略強(qiáng)于F-1的分解能力。通過(guò)對(duì)2株菌株的比較，可以篩選出透明圈直徑大、透明圈直徑與菌落直徑比值大的菌株。稀釋梯度為10-2時(shí)，由于土壤樣品的稀釋濃度太大，培養(yǎng)出的菌落太多而連成片，不易分離和觀察，因此該稀釋梯度下的結(jié)果不作為考量。

3 討論

試驗(yàn)結(jié)果表明通過(guò)培養(yǎng)基分離，純化土壤中的纖維素分解菌的方法是可行的，得到的2株纖維素分解菌分解纖維素的能力都較強(qiáng)。稀釋濃度為10-3時(shí)，F(xiàn)-1和F-2的透明圈直徑與菌落直徑的比值分別為8.06和10.30；稀釋濃度為10-4時(shí)，F(xiàn)-1和F-2的比值分別為5.22和6.10。2種菌株的纖維素分解能力不同，在不同稀釋濃度下F-2的分解能力均比F-1的強(qiáng)。

纖維素分解菌主要通過(guò)纖維素酶降解纖維素，但由于時(shí)間所限，纖維素酶的活力并未測(cè)定，因此對(duì)于纖維素分解菌對(duì)纖維素的分解能力只能通過(guò)試驗(yàn)中測(cè)得的2種菌株的生長(zhǎng)速率以及透明圈直徑與菌落直徑的比值進(jìn)行初步判斷。此外，由于采集的腐殖土土樣過(guò)于單一，所以得到的具有分解纖維素能力的菌株并不多，且由于對(duì)土壤樣品的稀釋濃度把握不準(zhǔn)確，導(dǎo)致稀釋濃度過(guò)大，部分菌落連成片地生長(zhǎng)，對(duì)菌落分離、純化產(chǎn)生了一定影響，干擾了試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

分解纖維素微生物的分離純化方法有很多，但多以羧甲基纖維素固體培養(yǎng)基分離為主[16-17]。近年來(lái)的研究表明，羧甲基纖維素固體培養(yǎng)基和赫奇遜濾紙條液體培養(yǎng)基在分離纖維素分解菌的過(guò)程中應(yīng)用較多，但2種培養(yǎng)基分離出的菌株及種類存在較大差異，因此一般在試驗(yàn)中將2種培養(yǎng)基篩選方法結(jié)合應(yīng)用[18]。本研究中，分離纖維素分解菌時(shí)，僅使用了羧甲基纖維素固體培養(yǎng)基，導(dǎo)致纖維素分解菌類型較少，因此在后續(xù)纖維素分解菌分離試驗(yàn)中應(yīng)將這2種培養(yǎng)基分離方法結(jié)合起來(lái)，以進(jìn)一步提高分離效率及準(zhǔn)確性。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)腐殖土樣中的菌種進(jìn)行培養(yǎng)、分離及多次轉(zhuǎn)接純化，并利用剛果紅染色法復(fù)篩，得到了2株具有纖維素降解能力的菌株；通過(guò)透明圈直徑與菌落直徑比值初步分析2株菌株的纖維素降解能力，發(fā)現(xiàn)本試驗(yàn)中篩選到的F-2可以作為降解秸稈纖維素的待培養(yǎng)菌種資源，但其對(duì)秸稈纖維素的降解效果還需進(jìn)一步研究。