扎西旺堆，王辰龍，柳 泉，謝 怡，羅潤波

（西藏農(nóng)牧學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，西藏 林芝 860000）

藏豬是我國寶貴的地方品種資源，原產(chǎn)于我國青藏高原，是世界上少有的高原型豬種。藏豬是一種適合放牧或半放牧的豬種，脂肪沉積能力強(qiáng)，對高寒、低氧等惡劣環(huán)境具有極強(qiáng)的適應(yīng)能力[1]。

產(chǎn)氣莢膜梭菌是革蘭氏陽性厭氧芽孢菌，是可同時(shí)感染人和多種動(dòng)物的致病菌，廣泛存在于污水、腐殖質(zhì)、泥土、排泄物等環(huán)境中[2]。根據(jù)產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生的毒素種類，可將其分為A—G 7種亞型。產(chǎn)氣莢膜梭菌C型通常被認(rèn)為是0～2周齡仔豬壞死性腸炎發(fā)生的致病菌，A型菌株與乳豬輕度壞死性小腸結(jié)腸炎和絨毛萎縮有關(guān)[3]。產(chǎn)氣莢膜梭菌孢子長期存在于豬的糞便中，常引起仔豬腹瀉，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失[4]。

目前，國內(nèi)外關(guān)于藏豬源產(chǎn)氣莢膜梭菌的生長、流行現(xiàn)狀、耐藥情況研究較少。本試驗(yàn)設(shè)在西藏山南市加查縣，采集8份藏豬腹瀉糞便，對樣品中的產(chǎn)氣莢膜梭菌進(jìn)行分離鑒定、毒素分型和耐藥表型檢測，旨在為加查縣藏豬產(chǎn)氣莢膜梭菌病的診斷和防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品

2023年2月于西藏山南市加查縣無菌采集藏豬腹瀉糞便樣品8份，冷藏送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測。

1.2 試驗(yàn)儀器、試劑、培養(yǎng)基

試驗(yàn)儀器有冷凍離心機(jī)、移液器、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、厭氧產(chǎn)氣袋、厭氧罐等；試劑有DL2000 DNA Marker、2×Tap Master Mix酶、核酸染料、革蘭氏染色液、瓊脂糖、藥敏片；培養(yǎng)基有梭菌增菌培養(yǎng)基（RCM）、羊血瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸瓊脂培養(yǎng)基（TSC）、無菌脫纖維綿羊血等。

1.3 細(xì)菌分離

取適量糞便樣品接種于梭菌增菌培養(yǎng)基，43 ℃厭氧培養(yǎng)12 h；吸取產(chǎn)氣的液體培養(yǎng)基200 μL接種于胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸瓊脂培養(yǎng)基，43 ℃厭氧培養(yǎng)36 h；挑取黑色圓形扁平菌落接種于梭菌增菌培養(yǎng)基上增菌8 h，劃線培養(yǎng)于7%綿羊血瓊脂培養(yǎng)基，43 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，若發(fā)現(xiàn)有溶血環(huán)的單菌落，純化3次，進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。

1.4 生化鑒定

依據(jù)伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊[5]，將純化增殖后的菌液接種于生化鑒定管中，43 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，觀察并記錄試驗(yàn)結(jié)果。

1.5 分離株16S rRNA基因鑒定

參考石蕓等[6]的方法合成細(xì)菌16S rRNA基因通用引物，F(xiàn)：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′?；驍U(kuò)增體系（50 μL）：上、下游引物各1 μL，2×Taq Master Mix酶25 μL，模板2 μL，ddH2O 21 μL。PCR反應(yīng)程序參考2×Tap Master Mix酶說明書進(jìn)行。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，將符合目的條帶大小的PCR產(chǎn)物委托擎科生物科技有限公司成都分公司測序，并進(jìn)行BLAST比對。

1.6 毒素分型

參考Rood等[7]的方法對產(chǎn)氣莢膜梭菌進(jìn)行毒素分型，其分型引物如表1所示。CpA、CpB、Etx、Ia基因檢測多重PCR反應(yīng)體系：上、下游引物各1 μL，2×Taq Mix酶2 5 μL，模板2 μL，ddH2O 15 μL。CpE和NetB的PCR反應(yīng)體系：上、下游引物各1 μL，2×Taq Mix酶25 μL，模板2 μL，ddH2O 21 μL。反應(yīng)程序參考2×Tap Master Mix酶說明書進(jìn)行。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察電泳結(jié)果，具體判定標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表1 產(chǎn)氣莢膜梭菌多重PCR引物信息

表2 產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素分型標(biāo)準(zhǔn)

1.7 藥敏試驗(yàn)

將分離株接種到梭菌增菌培養(yǎng)基43 ℃厭氧培養(yǎng)至OD600nm=0.8，取300 μL菌液均勻涂布于MH瓊脂平板，粘貼藥敏片，43 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈大小。參照《抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》及杭州微生物試劑公司藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)對分離菌的藥物敏感性進(jìn)行判定[10]。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離結(jié)果

經(jīng)分離得到3株疑似藏豬源產(chǎn)氣莢膜梭菌，記作Z-1、Z-2、Z-3。以上3株疑似藏豬源產(chǎn)氣莢膜梭菌的菌株在梭菌增菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)可觀察到明顯的產(chǎn)氣現(xiàn)象，在TSC培養(yǎng)基中長出黑色菌落，在7%綿羊血瓊脂平板中培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)有典型溶血環(huán)的灰白色單菌落，且革蘭氏染色鏡檢下為紫色直桿菌。

2.2 生化試驗(yàn)結(jié)果

生化鑒定結(jié)果顯示，3株疑似藏豬源產(chǎn)氣莢膜梭菌對卵磷脂酶、甘露糖、乳糖、葡萄糖、麥芽糖呈陽性，對酪蛋白、水楊苷、脂酶、吲哚呈陰性。分離菌株生化特性鑒定結(jié)果均符合產(chǎn)氣莢膜梭菌的生化特征。

2.3 16S rRNA基因鑒定結(jié)果

分離菌16S rRNA基因檢測結(jié)果顯示，約1 500 bp處出現(xiàn)條帶。將測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站Nucleotide數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)，3株分離菌與產(chǎn)氣莢膜梭菌的相似性較高，為99.5%～100%。

2.4 毒素分型結(jié)果

毒素分型檢測結(jié)果顯示，3株分離菌均含有CpA毒素基因（324 bp），未檢測出其他毒力基因。結(jié)合比對結(jié)果判定3株分離菌株均為A型產(chǎn)氣莢膜梭菌。PCR凝膠電泳結(jié)果見圖1。

圖1 產(chǎn)氣莢膜梭菌多重PCR分型凝膠電泳結(jié)果

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3株藏豬源產(chǎn)氣莢膜梭菌均對阿莫西林、磺胺甲噁唑耐藥，其中Z-3株的耐藥情況較為嚴(yán)重，對20種藥物耐受，具體結(jié)果見表3。

表3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

本研究通過細(xì)菌的分離培養(yǎng)、生化試驗(yàn)、16S rRNA基因檢測、PCR毒素分型，分離鑒定出3株藏豬源產(chǎn)氣莢膜梭菌，均為A型，分離率為37.5%。張漢云等[11]對我國湖南、浙江、福建、廣東等4省8市的規(guī)?；i場的74份豬糞便樣品進(jìn)行了產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測，同樣發(fā)現(xiàn)分離到的31株產(chǎn)氣莢膜梭菌均為A型；候照峰等[12]分離到的4株鵝源產(chǎn)氣莢膜梭菌同樣為A型；吳丹等[9]對青海牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌的鑒定發(fā)現(xiàn)，14株分離株中10株為A型。以上研究結(jié)果表明臨床上流行的產(chǎn)氣莢膜梭菌優(yōu)勢菌株為A型。

產(chǎn)氣莢膜梭菌主要侵害1周齡仔豬，俗稱仔豬紅痢，但在育肥豬、母豬上也常有報(bào)道，感染后表現(xiàn)為血痢，腹部脹氣且病程短，又稱猝死癥。豬感染的產(chǎn)氣莢膜梭菌病主要是由A型、C型引起的一種急性、致死性腸道傳染病[13]。本研究分離到的菌株均為A型，表明加查縣藏豬有患仔豬紅痢、猝死癥的風(fēng)險(xiǎn)，可以采用二氧化氯對產(chǎn)房、豬舍、周圍環(huán)境進(jìn)行消毒，母豬臨產(chǎn)前清洗乳頭，從而減少產(chǎn)氣莢膜梭菌病的發(fā)生和傳播。

本研究發(fā)現(xiàn)3株藏豬源產(chǎn)氣莢膜梭菌對青霉素類、β-內(nèi)酰胺類、頭孢菌素類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類、氟喹諾酮類、多肽類、磺胺類、硝基呋喃類、氯霉素類等藥物表現(xiàn)出不同程度的耐藥性。楊麗等[13]對4株豬源產(chǎn)氣莢膜梭菌的耐藥性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)分離株對阿米卡星、慶大霉素、鏈霉素、紅霉素、麥迪霉素、阿奇霉素、林可霉素、桿菌肽、多粘菌素B、復(fù)方新諾明、甲氧芐啶表現(xiàn)出完全耐藥性；蔣增海等[14]對1株豬源產(chǎn)氣莢膜梭菌的耐藥性進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)其對青霉素和磺胺甲噁唑表現(xiàn)出完全耐藥性，表明豬源產(chǎn)氣莢膜梭菌耐藥性較為嚴(yán)重。在生豬養(yǎng)殖過程中，應(yīng)合理使用抗生素，防止濫用，避免耐藥菌株產(chǎn)生。