王奕升，張錚鈺，徐 勇，周 楊，吳蘭鑫，王 真，張紅艷，吳學(xué)民

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院應(yīng)用化學(xué)系農(nóng)藥研究中心，北京 100193）

阿維菌素別名為阿巴美丁、阿佛菌素、殺蟲(chóng)素等，是一類具有殺蟲(chóng)、殺螨、殺線蟲(chóng)活性的十六元大環(huán)內(nèi)酯化合物，由鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生。其具有很強(qiáng)的胃毒作用和觸殺作用，對(duì)昆蟲(chóng)和螨類均有較好的效果，其中對(duì)植物線蟲(chóng)的活性較高，發(fā)展前景十分廣闊［1］。阿維菌素于1976 年被美國(guó)默克公司分離提取之后便被深入研究，中國(guó)從20 世紀(jì)80 年代末也開(kāi)始研究阿維菌素，應(yīng)用范圍廣泛，作為一種殺線蟲(chóng)劑，登記農(nóng)藥已達(dá)82 種［2］。

阿維菌素可以通過(guò)影響害蟲(chóng)的神經(jīng)生理活動(dòng)，導(dǎo)致神經(jīng)膜電位極化阻斷神經(jīng)傳導(dǎo)以殺滅害蟲(chóng)［3，4］，其對(duì)松樹(shù)病害的防治具有重要意義。松樹(shù)在中國(guó)分布范圍廣泛，是一種重要的林業(yè)資源，同時(shí)被列為國(guó)家戰(zhàn)略儲(chǔ)備樹(shù)種。松樹(shù)可以在不同環(huán)境中生長(zhǎng)，對(duì)土壤的要求較低，能忍耐較為瘠薄的土地，對(duì)水需求小，喜好陽(yáng)光。松樹(shù)在生長(zhǎng)過(guò)程中，容易受到病蟲(chóng)害的影響，且影響程度較大，因此防治病蟲(chóng)害并保護(hù)松樹(shù)具有重要的意義。松樹(shù)常見(jiàn)的病蟲(chóng)害包括松毛蟲(chóng)、松材線蟲(chóng)病、松褐天牛、松干蚧殼蟲(chóng)、松梢螟等，其中松材線蟲(chóng)病對(duì)松樹(shù)的危害最大，被稱為松樹(shù)的“癌癥”，松樹(shù)在感染40 d 左右便會(huì)死亡［5-7］，其傳播速度極快，對(duì)松樹(shù)的致死效果極強(qiáng)，并且難以控制［8］。而阿維菌素能夠有效抑制松材線蟲(chóng)病，具有較強(qiáng)的殺線蟲(chóng)活性［9］。防治松材線蟲(chóng)病的方式之一是向樹(shù)干打孔注藥，適用于古樹(shù)名木以及公園、景區(qū)等區(qū)域內(nèi)松樹(shù)的重點(diǎn)保護(hù)。為了解阿維菌素在松樹(shù)樹(shù)干中的傳輸過(guò)程，需要建立快速、準(zhǔn)確檢測(cè)其在松樹(shù)中殘留的方法。

關(guān)于阿維菌素的測(cè)定方法以液相色譜法為主，分為高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)法（HPLCPDA）、高效液相色譜熒光檢測(cè)法（HPLC-FLD）、高效液相色譜紫外檢測(cè)法（HPLC-UV）、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）等［10］。

本試驗(yàn)將圍繞建立一種利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定松樹(shù)木材中阿維菌素殘留量的方法展開(kāi)，以期為測(cè)定阿維菌素的殘留量并保證殘留安全提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

DFY-500C 型粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）；液相色譜儀-質(zhì)譜儀［島津（香港）有限公司］；低速臺(tái)式大容量離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；HC-2517 型高速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；VORTEX-5 型渦旋混合器（海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司）；UMV-2 型多管漩渦混合器（北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司）；JY2002 型電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；JA2003B 型電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）；AUW220D 型電子天平（日本島津制作所）；移液槍（德國(guó)Eppendorf公司）。

松樹(shù)木材樣品；阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品（純度96.6%，上海市農(nóng)藥研究所有限公司）；C18（天津博納艾杰爾科技有限公司）；硫酸鎂（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙腈（色譜純，美國(guó)Fisher Chemical 公司）；氯化鈉、甲酸（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；純凈水（天津娃哈哈宏振飲料有限公司）。

1.2 試驗(yàn)處理

準(zhǔn)確稱取阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品0.005 2 g，用乙腈溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，并用乙腈定容至刻度線，混合均勻，得到100 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。向10 mL 容量瓶中準(zhǔn)確加入100 mg/L 的阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液1.0 mL，并用乙腈稀釋定容至刻度線，混合均勻，得到10 mg/L 的阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的提取與凈化

1）提取。松樹(shù)木材樣品經(jīng)粉碎機(jī)粉碎混勻后備用。準(zhǔn)確稱取1.00 g 木屑樣品，加入到50 mL 具塞離心管中，并加入10 mL 乙腈、5 mL 水、3 g 氯化鈉，于渦旋混合器中渦旋振蕩提取阿維菌素5 min，以3 800 r/min 離心5 min。

2）凈化。移取1 mL 提取液置于裝有50 mg C18和100 mg 硫酸鎂的2 mL 離心管中，渦旋振蕩1 min，以10 000 r/min 離心1 min，上層清液（乙腈相）經(jīng)0.22 μm 有機(jī)系濾膜過(guò)濾后用液相色譜儀-質(zhì)譜儀分析，使用外標(biāo)法定量。

1.3.2 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀操作條件

1）液相色譜條件。色譜柱為Athena C18-WP 柱（3.0 μm×2.1 mm×50.0 mm），流動(dòng)相A 為乙腈，流動(dòng)相B 為0.1%甲酸水溶液，A∶B=8∶2（V/V）；流速為0.3 mL/min；進(jìn)樣量2 μL；柱溫40 ℃；采用等度洗脫。

2）質(zhì)譜條件。離子化方式為電噴霧離子源，ESI+；加熱塊溫度400 ℃；離子傳輸線溫度200 ℃；離子源溫度300 ℃；加熱氣流速10 L/min；霧化氣流速2 L/min；干燥氣流速10 L/min；駐留時(shí)間30 ms；檢測(cè)方式為多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；目標(biāo)化合物質(zhì)譜參數(shù)如表1 所示。

表1 目標(biāo)化合物質(zhì)譜參數(shù)

1.3.3 方法的線性范圍 為避免基質(zhì)效應(yīng)對(duì)試驗(yàn)的影響，采用基質(zhì)加標(biāo)配制阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品以及外標(biāo)法定量的方法。按照“1.3.1”的方法對(duì)空白木屑樣品進(jìn)行提取、凈化，得到空白基質(zhì)提取液。配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，濃度分別為0.005、0.010、0.100、0.500、1.000 mg/L。采用“1.3.2”中的儀器條件，以橫坐標(biāo)為濃度、縱坐標(biāo)為定量離子對(duì)的峰面積值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算線性決定系數(shù)（R2）。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品提取優(yōu)化

由于暫無(wú)從松樹(shù)木材中提取阿維菌素的案例，因此該試驗(yàn)參考從蔬菜水果中提取阿維菌素所使用的溶劑。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［11-18］，甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯等常用溶劑均可用于提取阿維菌素，因?yàn)樗蓸?shù)與水稻秸稈中均含有油脂，成分類似，且常用乙腈提取水稻秸稈中的阿維菌素，所以本試驗(yàn)也采用乙腈作為溶劑提取松樹(shù)木屑中的阿維菌素。

常用農(nóng)藥殘留分析凈化劑的選擇以C18、PSA為主，凈化劑的種類與用量通過(guò)基質(zhì)的改變而產(chǎn)生不同的基質(zhì)效應(yīng)，影響方法的回收率。該試驗(yàn)分別使用50 mg PSA，30、50、80 mg C18，25 mg C18 與25 mg PSA，50 mg C18 與50 mg PSA 共6 組作為凈化劑，比較不同凈化劑對(duì)回收率的影響，結(jié)果表明，6 組回收率在79%～101%，均滿足農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則中的要求。比較凈化劑種類與用量對(duì)基質(zhì)提取液中雜質(zhì)含量的影響。結(jié)果表明，不同基質(zhì)提取液中雜質(zhì)對(duì)阿維菌素的影響大致相同。比較凈化劑種類與用量對(duì)阿維菌素響應(yīng)值的影響，結(jié)果表明，單獨(dú)使用C18 作為凈化劑時(shí)阿維菌素響應(yīng)值最大，因此單獨(dú)使用C18 作為凈化劑時(shí)阿維菌素的檢出限最低，效果最好?；谏鲜龈鞣矫姹容^考慮，選擇C18作為凈化劑最佳，用量為中間值50 mg。

2.2 色譜條件優(yōu)化

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［14，19，20］，液相色譜流動(dòng)相的選擇包括乙腈和甲酸水溶液、甲醇-水溶液、乙腈-水溶液等，本試驗(yàn)采用乙腈和0.1%甲酸水溶液作為液相色譜的流動(dòng)相，不同比例的流動(dòng)相對(duì)阿維菌素的保留時(shí)間、峰形、響應(yīng)值等都有一定的影響，為了提高阿維菌素的電離效率，通過(guò)改變乙腈和0.1%甲酸水溶液的比例確定最佳色譜條件。結(jié)果表明，0.1%甲酸水溶液所占比例越大，阿維菌素的保留時(shí)間越長(zhǎng)，響應(yīng)值越大。為保證靈敏度，選擇乙腈∶0.1%甲酸水溶液=8∶2（V/V），若再增大0.1%甲酸水溶液所占比例，響應(yīng)值會(huì)增大，但是阿維菌素的保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，造成時(shí)間的浪費(fèi)，不符合本試驗(yàn)的要求。

2.3 線性范圍及方法定量限

阿維菌素的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜（0.1 mg/L）分布如圖1 所示。由圖1 可知，阿維菌素的色譜峰峰形良好，對(duì)稱性高，其他雜質(zhì)影響較小。阿維菌素的線性方程為y=485 936x+6 347.4（R2=0.997 6），結(jié)果表明，阿維菌素濃度在0.005～1.000 mg/L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 阿維菌素的標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜（0.1 mg/L）分布

2.4 精確度與準(zhǔn)確度

對(duì)空白松樹(shù)木材樣品分別進(jìn)行0.1、1.0、5.0 mg/kg添加回收率的試驗(yàn)，每個(gè)濃度重復(fù)5 次，靜置30 min后，其余操作同“1.3.1”并采用基質(zhì)匹配標(biāo)樣校正法測(cè)定，計(jì)算阿維菌素的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見(jiàn)表2。由表2 可知，阿維菌素在松樹(shù)木材樣品中3 個(gè)水平添加濃度的平均回收率為77%～86%，回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.0%～8.0%，方法重現(xiàn)性較好，準(zhǔn)確度和精確度均滿足要求。該方法的定量限為最小添加濃度0.1 mg/kg，滿足檢測(cè)的要求。

表2 方法平均回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）

3 小結(jié)

該試驗(yàn)建立了改進(jìn)的QuEChERS 前處理方法，并結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)松樹(shù)木材中阿維菌素殘留量，采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液外標(biāo)法定量，該方法樣品前處理快速高效、準(zhǔn)確度高、靈敏度高，可以用于檢測(cè)松樹(shù)木材中阿維菌素的農(nóng)藥殘留，為監(jiān)測(cè)松樹(shù)中阿維菌素的殘留量提供了理論依據(jù)，對(duì)保障松樹(shù)的健康與人類的安全有重要意義。