宋世文，張 玲，王 瑞，陳 怡，林思淇，宋曉儀

（深圳市質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，廣東 深圳 518040）

隨著生活水平的提高，人們對(duì)農(nóng)藥殘留問(wèn)題也越來(lái)越重視，最新標(biāo)準(zhǔn)GB 2763—2021《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中對(duì)564 種農(nóng)藥的10 092 項(xiàng)最大殘留限量進(jìn)行了嚴(yán)格的規(guī)定［1］。然而，根據(jù)各地監(jiān)管部門公開抽檢結(jié)果［2］，均能在蔬菜水果中檢測(cè)出農(nóng)殘超標(biāo)等問(wèn)題。因此，建立快速、可靠的高通量農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法是當(dāng)務(wù)之急，對(duì)于保障農(nóng)產(chǎn)品安全具有非常重要的意義。

QuEChERS 方法主要包括萃取、鹽析、凈化3 個(gè)步驟。與傳統(tǒng)前處理方法相比，QuEChERS 方法更為簡(jiǎn)便快速、試劑耗材損耗少、可同時(shí)提取多種組分，廣泛應(yīng)用于復(fù)雜基質(zhì)樣品多種組分的同時(shí)提取、凈化，是各實(shí)驗(yàn)室普遍采用的適用于多種農(nóng)藥殘留分析的前處理方法［3-8］。

農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法較多，HPLC-MS/MS 因具有分析范圍廣、分離能力強(qiáng)、檢測(cè)限低及分析快速等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用［9-14］。

擬除蟲菊酯類農(nóng)藥是一類廣譜殺蟲劑，因殺蟲毒力強(qiáng)、使用量少、對(duì)人畜毒性低、能生物降解，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用的主流品種。果蔬中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留的研究方法主要集中在氣相色譜或氣質(zhì)聯(lián)用上［15-19］，在液相色譜或液質(zhì)聯(lián)用上的應(yīng)用鮮有報(bào)道，包括最新的國(guó)標(biāo)方法GB23200.121—2021 中所分析的擬除蟲菊酯的種類也非常有限，僅為9 種［20］。試驗(yàn)所選擇的111 種農(nóng)藥，均為日常果蔬檢測(cè)中常見的且易超標(biāo)的農(nóng)藥種類［21］，同時(shí)包含了常見的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥，填補(bǔ)了國(guó)標(biāo)GB23200.121—2021的14 項(xiàng)缺失（氯氰菊酯、氯氟氰菊酯、氟氯氰菊酯、生物丙烯菊酯、苯醚氰菊酯、丙烯菊酯、炔咪菊酯、氟丙菊酯、甲基對(duì)硫磷、克螨特、百菌清、三氯殺螨醇、殺螟硫磷、滅蠅胺）。采用QuEChERS 方法進(jìn)行前處理，結(jié)合超高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，建立了果蔬中常見農(nóng)藥及其代謝物殘留的快速檢測(cè)方法。該方法穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性良好，分析時(shí)間短，基質(zhì)效應(yīng)低，回收率和精密度均符合相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，可滿足大批量果蔬類農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全快速檢測(cè)的需求。

1 材料與方法

1.1 農(nóng)藥

111 種農(nóng)藥見表1，均為1 000 mg/L，由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢測(cè)中心提供。

表1 111 種農(nóng)藥

1.2 儀器與試劑

液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（軟件為Analyst，Triple Quad 5500 型，美國(guó)AB SCIEX 公司）；氮吹儀（N-EVAP 112 型，美國(guó)Organomation Associates 公司）；純水機(jī)（Elix5 型，美國(guó)Millipore 公司）；旋渦混合儀（XH-B 型，康健醫(yī)療器具有限公司）；臺(tái)式高速離心機(jī)（TG16G 型，凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司）。

甲酸，優(yōu)級(jí)純，純度≥88%，安譜科學(xué)儀器有限公司；乙酸銨，分析純，純度≥98%，德國(guó)CNW 公司；甲醇、乙腈，色譜純，購(gòu)自美國(guó)J.T.Bake 公司；丙酮，色譜純，德國(guó)Merck 公司；乙二胺-N-丙基硅烷吸附劑PSA（粒徑40～60 μm）和石墨化碳黑GCB（粒徑40～120 μm）均購(gòu)自美國(guó)Agilent 公司；固體氯化鈉（分析純，純度≥99.8%）和無(wú)水硫酸鎂（分析純，純度≥99%）均購(gòu)自江西化工股份有限公司；檸檬酸鈉二水合物和檸檬酸二鈉鹽倍半水合物（分析純，純度均≥99.8%）均購(gòu)自北京本立科技有限公司。試驗(yàn)用水符合GB/T 6682—2008 規(guī)定的一級(jí)水標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 方法

1.3.1 溶液配置

1）混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液10 mg/L（三氯殺螨醇50 mg/L）。依據(jù)農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品的序號(hào)（表1），分為A（編號(hào)1～55）和B（編號(hào)56～111）2 組。每組分別準(zhǔn)確移取農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（1 000 mg/L）0.1 mL（三氯殺螨醇0.5 mL）至10 mL 容量瓶，加入丙酮定容，配制成A、B 2 組10 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，保存于-18 ℃條件下，備用。

2）混合標(biāo)準(zhǔn)工作液2 mg/L（三氯殺螨醇10 mg/L）。準(zhǔn)確移取上述混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各1 mL 于5 mL 容量瓶中，丙酮定容至刻度線，現(xiàn)配現(xiàn)用。

3）甲醇-水溶液（1∶9，體積比）。精密量取100 mL 甲醇，加入900 mL 水混勻。

4）0.1%甲酸鹽水溶液（含5 mmol 乙酸銨溶液）。準(zhǔn)確稱取0.385 g 乙酸銨，準(zhǔn)確吸取1 mL 甲酸，置于1 000 mL 容量瓶中，加水稀釋至刻度，超聲脫氣。

5）0.1%甲酸甲醇鹽溶液（含5 mmol 乙酸銨溶液）。準(zhǔn)確稱取0.385 g 乙酸銨，準(zhǔn)確吸取1 mL 甲酸，置于1 000 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，超聲脫氣。

1.3.2 樣品前處理 優(yōu)化文獻(xiàn)［19］中蔬菜水果食用菌的QuEChERS 前處理法，稱取10 g 試樣于50 mL塑料離心管中，加入10 mL 乙腈及1 顆陶瓷均質(zhì)子，劇烈振蕩1 min，加入4 g 無(wú)水硫酸鎂、1 g 氯化鈉、1 g檸檬酸鈉二水合物、0.5 g 檸檬酸二鈉鹽倍半水合物，劇烈振蕩3 min 后，10 000 r/min 離心5 min。定量吸取上清液至內(nèi)含除水劑和凈化材料的塑料離心管中（每毫升提取液使用150 mg 無(wú)水硫酸鎂、25 mg PSA 和3.0 mg GCB），渦旋混勻3 min，10 000 r/min 離心3 min，靜置。定量吸取第二次離心上清液加入等量水，劇烈振蕩1 min 后過(guò)微孔濾膜，待測(cè)定。

滅蠅胺檢測(cè)，稱取10 g 試樣于50 mL 塑料離心管中，加入10 mL 乙腈及1 顆陶瓷均質(zhì)子，劇烈振蕩3 min，10 000 r/min 離心5 min。上清液全部轉(zhuǎn)移至20 mL 容量瓶中，用1∶1（V∶V）乙腈水定容。定量吸取上清液至內(nèi)含凈化材料的塑料離心管中（每毫升提取液50 mg PSA 和10 mg GCB），渦旋混勻3 min；10 000 r/min 離心5 min，吸取上清液過(guò)微孔濾膜，待測(cè)定。

1.4 HPLC-MS/MS 測(cè)定條件

1.4.1 色譜條件 Acquity UPLC BEH C18 色譜柱（1.7 μm，50 mm×2.1 mm）；柱溫40 ℃；流速0.30 mL/min；進(jìn)樣量為2 μL；流動(dòng)相A 為0.1%甲酸鹽水溶液（含5mmol 乙酸銨溶液），流動(dòng)相B 為0.1%甲酸甲醇鹽溶液（含5 mmol 乙酸銨溶液）；流動(dòng)相梯度洗脫程序，0 min 流動(dòng)相98%A+2% B；1.50 min 流動(dòng)相98%A+2% B；2.0 min 流動(dòng)相90%A+10% B；4.0 min 流動(dòng)相20%A+80% B；5.0 min 流動(dòng)相10%A+90% B；5.5 min 流動(dòng)相10%A+90% B；6.0 min流動(dòng)相30%A+70% B；6.5 min 流動(dòng)相98%A+2% B；8.0 min 流動(dòng)相98%A+2%B。

1.4.2 質(zhì)譜條件 離子監(jiān)測(cè)模式為ESI 正負(fù)離子模式同時(shí)掃描；氣簾氣0.28 MPa；電噴霧電壓正離子5 500 V，負(fù)離子-4 500 V；離子源溫度600 ℃；霧化氣0.41 MPa；噴霧氣0.38 MPa。

1.4.3 質(zhì)譜優(yōu)化參數(shù) 只列出缺失農(nóng)藥（表2），其他組分可通過(guò)查詢相關(guān)方法獲得。

表2 14 種缺失農(nóng)藥的多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)參數(shù)和定量限（LOQ）

2 結(jié)果與分析

2.1 液相條件的優(yōu)化

液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)方法沒列入氯氰菊酯、氟氯氰菊酯、氯氟氰菊酯等的原因之一，是因?yàn)檫@些農(nóng)藥都有8 個(gè)異構(gòu)體，通常會(huì)出3～4 個(gè)色譜峰，定量與定性較困難。在氣質(zhì)聯(lián)用方法GB23200.113—2018 中，上述3 種農(nóng)藥都是用4 個(gè)峰分別積分，不便定量，定性也不科學(xué)。

111 種目標(biāo)農(nóng)藥的總離子流色譜（TIC）見圖1。液相色譜流動(dòng)相采用12～30 min，圖1A 為流動(dòng)相12 min 有機(jī)相B 梯度（0 min 2%；0.5 min 2%；1 min 15%；4 min 60%；4.5 min 65%；5.5 min 70%；8.5 min 95%；9 min 15%；10 min 2%；12 min 2%）的總離子色譜，梯度特點(diǎn)是開始有機(jī)相比較高，1 min 時(shí)15%；設(shè)定最高有機(jī)相濃度比較晚，8.5 min 到95%；這樣出峰比較快，也較均勻，多數(shù)目標(biāo)物質(zhì)在2～10 min 出峰，易造成多異構(gòu)體物質(zhì)如氯氰菊酯出現(xiàn)多個(gè)色譜峰（圖2）。該方法通過(guò)流動(dòng)相調(diào)節(jié)，將流動(dòng)相壓縮至8 min，降低初始階段有機(jī)相濃度，1.5 min 到2%；2 min 到10%；將最高有機(jī)相濃度95%提前到5.5 min，目標(biāo)物質(zhì)出峰集中在3.5～6.5 min（圖1B），可使具有異構(gòu)體的物質(zhì)（如氯氰菊酯、氟氯氰菊酯等）合多而為一（圖2B），同時(shí)將所有組分快速優(yōu)化分離并準(zhǔn)確定量定性檢測(cè)，最后確定流動(dòng)相為8 min，一方面消除了異構(gòu)體多峰現(xiàn)象，提高了方法的準(zhǔn)確性，另一方面縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高了檢測(cè)效率。

圖1 111 種目標(biāo)農(nóng)藥的總離子流色譜（TIC）

圖2 氯氰菊酯色譜

2.2 同位素母離子和同位素子離子的選擇

在質(zhì)譜ESI 源檢測(cè)方法中，如目標(biāo)物不裂解，通常只形成一個(gè)母離子，再選擇這個(gè)母離子碰撞產(chǎn)生的2 個(gè)信號(hào)足夠強(qiáng)的子離子，形成2 組離子對(duì)進(jìn)行檢測(cè)。如治螟磷，母離子是323.0（質(zhì)荷比，下同），兩個(gè)子離子是115.0 和171.1，組成2 組母離子/子離子對(duì)323.0/115.0 和323.0/171.1 進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。氯氰菊酯、氟氯氰菊酯、氯氟菊酯原母離子只能找到1 個(gè)信號(hào)強(qiáng)的子離子，不能同時(shí)找到2 個(gè)信號(hào)強(qiáng)的子離子，如氯氰菊酯433.1/191.2；氟氯氰菊酯451.0/191.2；氯氟氰菊酯467.1/225.0。氯有35Cl 和37Cl 2 種同位素，天然豐度都比較高，氯氰菊酯、氟氯氰菊酯、氯氟氰菊酯還有1 個(gè)同位素母離子和相應(yīng)的同位素子離子，分別是氯氰菊酯435.1/193.2；氟氯氰菊酯453.0/193.2；氯氟氰菊酯469.1/227.0?？梢赃x擇2 組信號(hào)強(qiáng)的同位素母離子及這個(gè)母離子產(chǎn)生的同位素子離子，分別是氯氰菊酯433.1/191.2 和435.1/193.2；氟氯氰菊酯451.0/191.2 和453.0/193.2；氯氟氰菊酯467.1/225.0 和469.1/227.0。經(jīng)過(guò)質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化，同位素母離子/子離子信號(hào)穩(wěn)定性及技術(shù)指標(biāo)如回收率、靈敏度都完全達(dá)到檢測(cè)方法要求。

2.3 質(zhì)譜條件及優(yōu)化

采用蠕動(dòng)泵進(jìn)樣的方式，將0.2 mg/L 各農(nóng)藥單標(biāo)溶液以20 μL/min 的流速連續(xù)注入ESI 源中，考察ESI 源正、負(fù)模式下111 種農(nóng)藥的響應(yīng)，并根據(jù)目標(biāo)物的分子結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描，得到待測(cè)物的準(zhǔn)分子離子峰。最后優(yōu)化離子源氣流、電壓、溫度等參數(shù)使離子峰的響應(yīng)強(qiáng)度最優(yōu)且響應(yīng)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，對(duì)準(zhǔn)分子離子峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，確定子離子和優(yōu)化去簇電壓及碰撞能量。

2.4 凈化過(guò)程中GCB 加入量的確定

樣品目標(biāo)物質(zhì)提取后，需要凈化。由于植物性樣品色素較多，基質(zhì)效應(yīng)大，可以加入石墨化碳黑（GCB）凈化色素以減少基質(zhì)效應(yīng)。但加入量過(guò)大，對(duì)有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥如多菌靈和菊酯類農(nóng)藥有吸附作用而降低回收率，因此加入量的選擇應(yīng)保障回收率在60%以上，同時(shí)基質(zhì)效應(yīng)較低。設(shè)計(jì)了陰性菠菜基質(zhì)試驗(yàn)，菠菜色素較多，具有代表性。4個(gè)GCB 處理（0、2.5、3.0、3.5 g/mL）進(jìn)行提取，觀察回收率的變化和基質(zhì)效應(yīng)。

由表3 可見，不加GCB，回收率變化比較大，最低在44.7%，最高在194.8%；加入3.5 g/mL GCB，最高回收率120.9%，最低回收率是33.3%。加入2.5、3.0 g/mL GCB，回收率和RSD基本符合通用方法60%～120%的要求，但3.0 g/mL GCB 比2.5 g/mL GCB更優(yōu)，因RSD小且GCB 加入量較大，去色素效果更好。因此該方法選擇3.0 g/mL GCB。

表3 GCB 加入量對(duì)回收率的影響（單位：%）

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

選擇2 種蔬菜（菠菜和甘藍(lán)）和1 種水果（橙）的基質(zhì)，純乙腈為對(duì)照，添加111 種農(nóng)藥0、0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mg/L ，選擇線性系數(shù)大于0.990 的5 個(gè)點(diǎn)作曲線，用曲線斜率的變化做指標(biāo)來(lái)衡量基質(zhì)效應(yīng)。溶劑乙腈的相對(duì)斜率為100，其他農(nóng)藥取與溶劑乙腈的相對(duì)值，稱為相對(duì)斜率。

111種農(nóng)藥相對(duì)斜率變化，菠菜為81.4%～118.8%；甘藍(lán)為81.2%～118.1%，橙為83.3%～117.9%，全部在正負(fù)20%以內(nèi)，說(shuō)明該方法的基質(zhì)效應(yīng)超過(guò)正負(fù)20%。可見該方法預(yù)處理基質(zhì)效應(yīng)較少，符合通用方法對(duì)基質(zhì)效應(yīng)不超過(guò)正負(fù)20%的要求。

2.6 線性范圍、檢出限和定量限

根據(jù)各化合物的靈敏度選定合適的標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍，分別對(duì)各系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行HPLC-MS/MS檢測(cè)，設(shè)計(jì)陰性基質(zhì)加標(biāo)濃度為0、0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、1.00 mg/L，以各組分的色譜峰面積對(duì)基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度進(jìn)行線性回歸，選擇111 種農(nóng)藥相關(guān)系數(shù)R≥0.990 的5 個(gè)點(diǎn)作曲線。線性范圍多數(shù)為0～100 和0～200 μg/L，少數(shù)為0～500 和0～1 000 μg/L，可見線性范圍足夠?qū)挷⒃? 個(gè)數(shù)量級(jí)以上，完全能滿足通用方法1 個(gè)數(shù)量級(jí)以上的要求。以≥10 倍信噪比的最低添加濃度為方法定量限（LOQ），設(shè)計(jì)陰性基質(zhì)添加濃度梯度0、0.01、0.10、10.00、20.00、30.00、50.00 μg/kg。結(jié)果顯示LOQ為0.005～0.100 mg/kg（表2），遠(yuǎn)低于中國(guó)規(guī)定的最大殘留限量要求，可以滿足實(shí)際檢測(cè)工作需要。

2.7 添加回收試驗(yàn)結(jié)果

選取甘藍(lán)進(jìn)行111 種農(nóng)藥高、中、低3 個(gè)濃度水平的添加回收試驗(yàn)，低濃度為0.005～0.010 mg/kg，中濃度為0.010～0.100 mg/kg，高濃度為0.100～1.00 mg/kg（依據(jù)LOQ而定）。每個(gè)濃度水平進(jìn)行6 次重復(fù)，結(jié)果見圖3。 111 種目標(biāo)農(nóng)藥在各樣品基質(zhì)中的平均回收率為65.2%～113.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.7%～21.3%，準(zhǔn)確度、精密度均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的通用要求。

圖3 甘藍(lán)基質(zhì)中111 種農(nóng)藥添加平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）（n=6）

3 結(jié)論

采用QuEChERS 方法對(duì)蔬菜樣品進(jìn)行前處理［21］，結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，建立了果蔬中包括菊酯類共111種農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)方法。該方法首次納入了氯氰菊酯、氟氯氰菊酯、氯氟氰菊酯等重要菊酯類農(nóng)藥。111 種農(nóng)藥在甘藍(lán)基質(zhì)中3 個(gè)添加水平下的回收率范圍為65.2%～113.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為0.7%～21.3%，定量限范圍為0.005～0.100 mg/kg。優(yōu)化了GCB 加入量，基質(zhì)效應(yīng)少。方法簡(jiǎn)便、快速，有較高的靈敏度，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，能滿足果蔬中農(nóng)藥多殘留的日常檢測(cè)要求。