張炳峰，趙園園，秦艷青，任夢娟，張藍月，曾代龍，張瑞娜，雷云康，史宏志*

1. 河南農(nóng)業(yè)大學煙草學院 煙草農(nóng)業(yè)減害研究中心，鄭州市金水區(qū)文化路95 號 450002

2. 四川省煙草公司，成都市高新區(qū)世紀城路936 號 600041

3. 四川中煙工業(yè)有限責任公司長城雪茄煙廠，四川省什邡市經(jīng)濟開發(fā)區(qū)鎣華山路南段128 號 618400

4. 四川省煙草公司德陽市公司，四川省德陽市旌陽區(qū)長江東路176 號 618000

雪茄是一種特殊的煙葉制品，多為純手工卷制，主要原料為雪茄風格較為明顯的晾曬煙，具有香氣醇厚馥郁、吃味香苦透甜、勁頭大、滿足感強的特點［1］。當年收獲調(diào)制后未經(jīng)發(fā)酵或陳化的煙葉煙氣粗糙，香氣質(zhì)和香氣量不足，雜氣較重，刺激性較大［2］，不適用于工廠加工制造雪茄，必須經(jīng)過3～5周的高溫發(fā)酵、18～36 個月的醇化，以改善其吸食品質(zhì)和加工性能［3］。雪茄煙葉發(fā)酵是雪茄加工過程中的重要環(huán)節(jié)，煙葉通過酶和微生物的作用，使煙葉內(nèi)含物質(zhì)發(fā)生一系列生化反應，進一步轉(zhuǎn)化或分解，香味成分增加，吸食品質(zhì)提高。目前的發(fā)酵方式主要分為自然發(fā)酵和人工發(fā)酵兩種。人工發(fā)酵具有發(fā)酵周期短、成本相對低的優(yōu)點，因此工業(yè)企業(yè)多采用人工發(fā)酵煙葉的方法。人工發(fā)酵方法主要有堆積發(fā)酵法、裝箱發(fā)酵法、壓力發(fā)酵法、蒸汽發(fā)酵法和糊米水發(fā)酵法等［4］。目前已有研究表明，煙葉發(fā)酵后其化學成分、香氣物質(zhì)含量變化明顯，感官質(zhì)量及安全性都有較大提高［5］，煙葉還原糖、蛋白質(zhì)、煙堿和總氮含量均降低［6］，香氣物質(zhì)含量較發(fā)酵前有不同程度增加［7］。此外，加料發(fā)酵在改善煙葉品質(zhì)、提高煙葉工業(yè)可用性方面效果更明顯［8］。外源添加植物乳桿菌［9］、米曲霉和黑曲霉發(fā)酵煙葉，可顯著降低煙葉淀粉含量，明顯改善燃吸品質(zhì)，顯著提高感官質(zhì)量［10］。四川什邡是我國雪茄煙的重要生產(chǎn)基地，生態(tài)優(yōu)勢明顯，雪茄種植歷史悠久，尤其是特有的糊米水發(fā)酵工藝，對什邡雪茄風格特色的形成起到了重要作用。糊米水發(fā)酵是一種傳統(tǒng)的人工添加物料的發(fā)酵方法，主要流程是在鐵鍋中將大米炒焦，而后加水熬煮成糊米水，將糊米水過濾冷卻后浸泡煙葉，最后進行碼堆發(fā)酵［11］。目前雪茄煙葉糊米水發(fā)酵仍然依靠經(jīng)驗進行操作，工藝流程尚不規(guī)范，糊米水特色發(fā)酵的機理尚不清楚，不利于優(yōu)質(zhì)特色發(fā)酵工藝的完善。因此，設置了不同炒制程度的糊米水處理雪茄煙葉發(fā)酵試驗，并分析發(fā)酵過程中煙葉化學成分和香氣物質(zhì)的變化，旨在為優(yōu)化糊米水發(fā)酵工藝、進一步彰顯四川雪茄煙葉風格特色及提高雪茄煙葉品質(zhì)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試煙葉為什煙1號（S1）（中部二級）、德雪1號（D1）（中部二級），均為2021年四川德陽市種植和調(diào)制后品質(zhì)均勻一致的煙葉，由四川省德陽市煙草公司提供。調(diào)制方式為晾制（煙葉采收后采用晾棚晾制，晾制溫濕度為當?shù)刈匀画h(huán)境溫濕度）。大米為本地粳米。

1.2 試驗設計

1.2.1 糊米水的制作

以m（煙葉）∶m（大米）=10∶1 稱取大米3 kg，待鐵鍋預熱至200 ℃時將大米放入鐵鍋中炒制并開始計時，達到設定炒制時長時停止。糊米炒制后隨即轉(zhuǎn)移到已準備好的熱水鍋內(nèi)。以炒制前大米質(zhì)量計糊米質(zhì)量，糊米和水以1∶3（質(zhì)量體積比，g/mL）的比例在鍋中熬煮10 min 左右，最終得到的糊米水呈深褐色、帶黏性，將其過濾、冷卻。使用波美度比重計（冀州市耀華器械儀表廠）測定制作成的糊米水溶液質(zhì)量濃度，將其調(diào)至8%左右。根據(jù)大米不同的炒制程度設置3個處理，以清水作為對照（CK），見表1。

表1 糊米炒制程度試驗設置Tab.1 Experimental design for frying rice

1.2.2 煙葉處理與發(fā)酵

試驗于2021年在四川省煙草公司德陽市公司的發(fā)酵倉庫內(nèi)進行。將煙葉樣品混勻后扎把，浸泡在清水及不同處理的糊米水中，使糊米水充分沾濕煙葉，浸泡處理1 min 后取出，將煙葉倒置控制含水率在30%左右。掛牌標記，將標記好的樣品煙葉分散放置在煙堆內(nèi)不同位置，采用堆積發(fā)酵法發(fā)酵。在煙堆內(nèi)不同位置處放置溫濕度自動記錄儀，當堆垛內(nèi)溫度達到45～50 ℃時進行翻堆。按照上翻下、內(nèi)翻外的原則，將煙葉重新堆垛，整個發(fā)酵過程28 d，共翻堆3～4次。發(fā)酵環(huán)境溫度為25～30 ℃，相對濕度70%～80%。發(fā)酵開始后定期從固定位置取樣，直至發(fā)酵結束。

1.2.3 取樣

取未發(fā)酵煙葉，葉片充分混勻作為處理前樣品。之后按照溫濕度要求及不同處理發(fā)酵時長，分別在0、7、14、21 和28 d 取樣為發(fā)酵過程中樣品。煙葉取樣后進行凍干處理，密封保存，用于各項指標的測定，并對發(fā)酵前后樣品進行感官質(zhì)量評價。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 發(fā)酵煙葉樣品的常規(guī)化學成分測定

采用連續(xù)流動分析儀（AA3，德國布朗盧比公司），按照標準YC/T 159—2019［12］方法測定總糖和還原糖含量（質(zhì)量分數(shù)）；按照標準YC/T 161—2002［13］方法測定總氮含量；采用乙醇提取，蒽酮比色法測定淀粉含量［14］；按照標準YC/T 166—2003［15］方法測定總蛋白質(zhì)含量；采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，按照標準YC/T 559—2018［16］方法測定煙堿含量。

1.3.2 發(fā)酵煙葉樣品中性香氣物質(zhì)測定

中性香氣成分前處理采用水蒸氣蒸餾-二氯甲烷溶劑萃取法，所得樣品使用GC/MS 氣質(zhì)聯(lián)用儀（7890A-5975C，美國安捷倫科技公司）進行分析，采用內(nèi)標法（硝基苯）定量［17］。

1.3.3 發(fā)酵煙葉樣品感官質(zhì)量評價

將不同處理的煙葉卷制成單料煙，由四川中煙工業(yè)有限責任公司具備煙草行業(yè)評吸資質(zhì)的9名雪茄工業(yè)企業(yè)評吸專家組成評吸小組，對糊米水發(fā)酵后煙葉進行感官質(zhì)量評吸鑒定，并對煙葉香氣質(zhì)、香氣量、濃度、細膩性、雜氣、勁頭、刺激性、余味和甜潤感等9項指標采用9分制進行打分。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010 軟件進行制圖和數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，采用IBM Statistics SPSS 22.0 軟件對數(shù)據(jù)進行相關分析和方差分析，采用LSD 法進行數(shù)據(jù)間差異的顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 不同炒制程度糊米水發(fā)酵對煙葉常規(guī)化學成分含量的影響

如表2、表3 所示，兩個品種的煙葉發(fā)酵過程中化學成分含量變化規(guī)律基本一致。糊米水處理后煙葉總糖、還原糖和淀粉含量顯著提高，隨著發(fā)酵的進行，煙葉總糖、還原糖和淀粉含量逐漸降低。在發(fā)酵的0～14 d，煙葉總糖、還原糖和淀粉含量下降顯著；在發(fā)酵的14～28 d，煙葉總糖、還原糖和淀粉含量下降速率趨于平緩；各處理發(fā)酵28 d 后，煙葉總糖、還原糖和淀粉含量均高于發(fā)酵前。其中，T3 處理發(fā)酵后，總糖和還原糖含量增幅最?。籘2處理發(fā)酵后，淀粉含量增幅最小。CK 發(fā)酵過程中，總糖、還原糖和淀粉含量均呈下降趨勢，且降幅平緩。

表2 不同處理發(fā)酵過程中什煙1號煙葉化學成分含量的變化①Tab.2 Contents of chemical components in Shiyan No. 1 tobacco leaves during the fermentation under different treatments

表3 不同處理發(fā)酵過程中德雪1號煙葉化學成分含量的變化Tab.3 Contents of chemical components in Dexue No. 1 tobacco leaves during the fermentation under different treatments

各處理煙葉總氮和煙堿含量顯著降低，尤其在發(fā)酵前、中期降低較多。在發(fā)酵的0～14 d，煙葉總氮和煙堿含量顯著下降；在發(fā)酵21 d之后，煙葉總氮和煙堿含量下降速率趨于平緩。CK發(fā)酵過程中，總氮和煙堿含量降低幅度較小。與CK相比，糊米水處理發(fā)酵后其降幅更大，且糊米炒制程度越重，發(fā)酵后煙葉總氮和煙堿含量越低。處理間相比表現(xiàn)為T3＞T2＞T1，T3處理發(fā)酵后煙葉總氮含量較發(fā)酵前分別降低25.05%（S1）和21.78%（D1），煙堿則降低34.47%（S1）和43.66%（D1），顯著低于T1、T2 處理。各處理發(fā)酵后煙葉蛋白質(zhì)含量顯著降低，前中期降低速率較快，發(fā)酵14 d 后趨于平穩(wěn)，其中T3 處理發(fā)酵后蛋白質(zhì)含量降低最多。

糊米水處理后，煙葉總糖、還原糖和淀粉含量顯著升高，隨后在發(fā)酵過程中逐漸下降，發(fā)酵后含量顯著高于發(fā)酵前；總氮和煙堿含量隨著糊米炒制程度加重，降低幅度越大，發(fā)酵后含量越低；發(fā)酵后蛋白質(zhì)含量顯著降低。

2.2 不同炒制程度糊米水發(fā)酵對煙葉中性香氣成分含量的影響

兩個品種煙葉不同處理發(fā)酵前后的中性香氣成分含量如表4 所示，共檢出31 種對煙葉香氣成分有所影響的中性香氣物質(zhì)。按香氣前體物的不同，可分為類胡蘿卜素降解產(chǎn)物、芳香族氨基酸降解產(chǎn)物、棕色化反應產(chǎn)物、西柏烷類降解產(chǎn)物和葉綠素降解產(chǎn)物。不同類別的香氣物質(zhì)變化趨勢不同，煙葉樣品中含量最高的中性香氣成分是新植二烯，約占中性香氣成分總量的50%以上，新植二烯含量的降低是導致中性香氣物質(zhì)總量較低的主要原因。除新植二烯外，其他各類香氣成分中類胡蘿卜素降解產(chǎn)物總量最多，其中含量較高的是巨豆三烯酮2、巨豆三烯酮4 和法尼基丙酮，糊米水發(fā)酵后這3 種物質(zhì)含量升高，T2 處理發(fā)酵后類胡蘿卜素降解產(chǎn)物總量相對較高。與發(fā)酵前相比，經(jīng)過糊米水發(fā)酵后西柏烷類降解產(chǎn)物茄酮含量顯著升高。芳香族氨基酸降解產(chǎn)物總量在發(fā)酵后顯著升高，其中含量較高的是苯乙醛和苯乙醇。棕色化反應產(chǎn)物總量較少，T2 處理發(fā)酵后含量顯著高于其他處理。綜合分析可知，糊米水發(fā)酵前后除新植二烯總量降低以外，其他香氣成分總量顯著升高。對于兩個品種的煙葉而言，均是T2 處理后中性香氣成分總量顯著高于T1和T3處理。

表4 不同處理發(fā)酵后煙葉中性香氣成分含量①②Tab.4 Contents of neutral aroma components in different fermented tobacco leaves（μg/g）

2.3 不同炒制程度糊米水發(fā)酵對煙葉感官質(zhì)量的影響

兩個品種煙葉在發(fā)酵后煙葉感官質(zhì)量評價如表5所示。糊米水發(fā)酵后的煙葉香氣質(zhì)變好，香氣量和濃度顯著增大，煙氣較為細膩柔和，余味舒適，甜潤感顯著增強，雜氣、勁頭和刺激性顯著降低。與發(fā)酵前煙葉相比，S1 品種的T1、T2、T3 處理的香氣質(zhì)、勁頭、刺激性、余味和甜潤感得分，CK、T1、T2、T3處理的香氣量、濃度、細膩性和雜氣得分差異顯著（P＜0.05）；D1 品種的T1、T2、T3 處理的香氣質(zhì)、香氣量、雜氣得分，CK、T1、T2、T3 處理的濃度、細膩性、勁頭、刺激性、余味得分以及T2 處理的甜潤感得分差異顯著（P＜0.05）。兩個品種煙葉各處理當中，均是T2處理各項指標得分最高。

表5 不同處理發(fā)酵后煙葉的感官質(zhì)量比較①②Tab.5 Sensory quality of different fermented tobacco leaves（分）

3 討論

糊米水發(fā)酵對雪茄煙葉品質(zhì)改善明顯，但大米炒制程度差異會導致糊米水最終內(nèi)含物質(zhì)含量差異，進而影響處理發(fā)酵后煙葉的最終品質(zhì)。本研究結果表明，對照組煙葉糖含量在發(fā)酵過程中持續(xù)降低，這是因為在發(fā)酵過程中，微生物的作用以及葉片細胞消耗糖類物質(zhì)，致使雪茄煙葉糖含量低于烤煙［1］，同時糖類物質(zhì)受氧化作用以及發(fā)生棕色化反應等致使其含量逐漸下降［18］；糊米水處理后煙葉的總糖、還原糖和淀粉含量大幅增加，在發(fā)酵過程中逐漸下降，發(fā)酵后含量顯著高于發(fā)酵前。這與普通發(fā)酵方式中煙葉糖含量的變化規(guī)律不同［19-20］，原因可能是大米中富含的主要營養(yǎng)物質(zhì)為糖類、淀粉等［21］，制成糊米水后處理煙葉，會使煙葉中糖類、淀粉含量升高，雖然在后續(xù)發(fā)酵過程中有所消耗，但發(fā)酵后的煙葉總糖、還原糖和淀粉含量仍處于較高水平?？偟康淖兓?guī)律與煙堿相同，在發(fā)酵過程中均呈降低趨勢，因為在發(fā)酵的高溫環(huán)境下，一部分揮發(fā)性含氮化合物分解為氨類物質(zhì)，并通過空氣的流通進一步揮發(fā)［22］，也是發(fā)酵環(huán)境中氨味較重的原因之一。這與趙奕熹［23］的研究結果一致，說明糊米水發(fā)酵有助于降低煙葉的煙堿和總氮含量。發(fā)酵后煙堿含量的降低，可能是因為其在發(fā)酵過程中氧化降解，與硝酸鹽類物質(zhì)發(fā)生亞硝化反應進而生成煙草特有亞硝胺（TSNAs）等［24］，還可能被一些以煙堿為底物的微生物分解［25］。蛋白質(zhì)在發(fā)酵過程中分解為氨基酸，并進一步參與到香氣物質(zhì)形成的化學反應中［23］，因此其含量降低。

煙葉香氣成分是反映煙葉及其制品品質(zhì)的重要指標。在發(fā)酵過程中，糖類物質(zhì)與氨基化合物間發(fā)生棕色化反應［26］、氨基酸和生物堿反應生成氧化衍生物［27］、大分子物質(zhì)降解為揮發(fā)性香氣物質(zhì)等過程都在形成香氣物質(zhì)。有研究表明，西柏烷類降解產(chǎn)物和類胡蘿卜素降解產(chǎn)物作為重要的中性致香成分，其含量的積累對于香型風格的形成和內(nèi)在品質(zhì)的提升具有促進作用［28］。本試驗中，糊米水發(fā)酵后煙葉中西柏烷類降解產(chǎn)物總量和類胡蘿卜素降解產(chǎn)物總量顯著高于發(fā)酵前及對照組煙葉，其中茄酮（新鮮胡蘿卜香味，增加煙草香氣，使煙氣醇和細膩［26］）、巨豆三烯酮類（甘甜香氣，改善煙香，掩蓋雜味［26］）、β-大馬酮（木香、花香、果香和甜香［26］）、法尼基丙酮（甜的青烤煙味［26］）和二氫獼猴桃內(nèi)酯（輕涼爽、消除刺激性）含量增加。芳香族氨基酸降解物中苯甲醛（杏仁香、櫻桃香［26］）、苯乙醛（花香、皂香，強烈［26］）、苯甲醇（弱花香，平和［26］）、苯乙醇（甜、玫瑰花香［26］）含量增加。棕色化反應產(chǎn)物雖然總量低微，但對香味的形成至關重要［29］，其中糠醛（甜，面包香、黃油香［26］）、5-甲基糠醛（甜，增加濃度［26］）、2-乙?；量▓怨?、烤甜、焦甜香［26］）、糠醇（谷香、油香，增加濃度［26］）含量相對較高，在糊米水發(fā)酵后均有所增加。在所有香氣物質(zhì)成分中，新植二烯（增進煙葉吃味和香氣，降解轉(zhuǎn)化形成致香成分［26］）占比最高，其含量的降低是導致中性香氣物質(zhì)總量降低的主要原因，可能是由于糊米水的加入促進了微生物的活動，加速了其進一步的降解。大米中富含的淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪等大分子化合物在炒制和糊化過程中可降解成為小分子物質(zhì)，其中包括糖類、氨基酸等［30］。這些物質(zhì)一方面可為微生物活動提供基質(zhì)，另一方面在加熱過程中可產(chǎn)生糖-氨基酸縮合物，進一步降解轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性香味成分，進而直接或間接影響發(fā)酵煙葉的香味品質(zhì)。另外，大米中含有多種揮發(fā)性物質(zhì)，在這些揮發(fā)物中，2-AP（2-乙酰-1-吡咯啉）、醛類、雜環(huán)類、醇類對大米香氣品質(zhì)具有重要影響［31-32］，但對煙葉香味品質(zhì)的影響還有待進一步試驗。

經(jīng)過糊米水發(fā)酵后的煙葉感官質(zhì)量得分顯著提高，煙葉評吸品質(zhì)顯著改善。各項指標中勁頭和刺激性較發(fā)酵前明顯降低，是因為發(fā)酵過程中高溫高濕的環(huán)境促進了刺激性物質(zhì)的分解和轉(zhuǎn)化，尤其是煙堿、總氮含量的降低使香氣更加柔和。糊米水發(fā)酵后的煙葉吃味醇和，香氣濃而純凈，甜潤感顯著增強，可能與發(fā)酵后多種富有甜香味的香氣物質(zhì)含量增加有關。

本研究中糊米水發(fā)酵過程持續(xù)28 d，此時煙葉含水量已顯著降低。發(fā)酵結束后，煙葉經(jīng)過分選加工再醇化，煙葉質(zhì)量有望進一步得到改善。關于醇化過程中糊米煙香味品質(zhì)的變化有待進一步研究。對于發(fā)酵煙葉而言，由于煙葉的厚薄、長寬等指標不同，還需根據(jù)煙葉類型和葉片品質(zhì)確定相適宜的糊米炒制方式和糊米水濃度，從而提升糊米水發(fā)酵后煙葉質(zhì)量。對于糊米水而言，其液態(tài)環(huán)境復雜，含有豐富的糖類、淀粉等物質(zhì)，這些物質(zhì)為微生物提供了充足的養(yǎng)分，對生化反應的活性也有所影響，進而直接影響發(fā)酵進程。因此，糊米及糊米水的成分和組成后續(xù)需進一步分析，糊米在發(fā)酵過程中對煙葉品質(zhì)改善的機制還有待深入研究。

4 結論

糊米水發(fā)酵后的煙葉化學成分協(xié)調(diào)，除新植二烯外，其他類胡蘿卜素降解產(chǎn)物、西柏烷類降解產(chǎn)物、芳香族氨基酸降解產(chǎn)物和棕色化反應產(chǎn)物含量顯著升高，感官質(zhì)量明顯提升。從不同處理糊米水發(fā)酵后的煙葉品質(zhì)來看，什煙1號和德雪1號較適宜的糊米炒制程度為：鐵鍋預熱至200 ℃后加入大米，炒制時間10 min，大米炒制成黑色團狀，手捻米芯尚白為止。使用此方式制作成的糊米加水熬煮后浸漬煙葉發(fā)酵，發(fā)酵后的煙葉品質(zhì)較好，化學成分含量適宜，香氣成分含量高，感官質(zhì)量好。