吳小軍，汪漢成，孫美麗，蔡劉體，孟建玉，王 豐，彭麗娟

1. 貴州大學煙草學院，貴陽市花溪區(qū)花溪大道南段2708 號 550025

2. 貴州省煙草科學研究院，貴陽市觀山湖區(qū)龍灘壩路29 號 550081

3. 長江大學農(nóng)學院，湖北省荊州市荊州區(qū)荊秘路88 號 434025

煙草角斑病是煙葉生產(chǎn)上危害較大的一種細菌性病害，其病原菌為丁香假單胞桿菌角斑?；停≒seudomonas syringae pv. angulata）［1-2］。該病原菌不產(chǎn)生毒素，可通過傷口或氣孔侵染煙株的葉、花和莖等，借助風雨、昆蟲在煙田傳播［3-4］。該病害在我國云南、貴州、四川和福建等主產(chǎn)煙區(qū)均有發(fā)生，且常與赤星病和野火病混合發(fā)生，對煙葉生產(chǎn)造成較大經(jīng)濟損失［5-6］。植物葉際菌群結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定程度會直接影響植物健康［7］。近年來，基于擴增子測序的分析技術(shù)被廣泛用于植物的葉際、根際以及種子內(nèi)生微生物群落結(jié)構(gòu)的研究中［8-11］。有關(guān)煙草葉片真菌性病害的葉際微生物群落結(jié)構(gòu)與多樣性已有較多報道。劉暢等［12］研究發(fā)現(xiàn)，感煙草赤星病葉際的優(yōu)勢細菌屬為假單胞菌屬（Pseudomonas）和泛菌屬（Pantoea）。向立剛等［13］研究表明，感赤星病的烤后煙葉葉際真菌多樣性低于健康煙葉。陳乾麗等［14］研究發(fā)現(xiàn)，烤后輕度霉變煙葉真菌群落多樣性高于重度霉變煙葉。孫美麗等［15］研究認為，感靶斑病煙葉葉際真菌群落多樣性降低，而葉際細菌群落多樣性增加。劉天波等［16］研究提出，通過施用拮抗菌劑能夠改善感野火病煙葉葉際菌群結(jié)構(gòu)。而目前有關(guān)煙草細菌性病害葉際微生物的研究卻鮮見報道，尤其是煙草角斑病等主要細菌性病害，其葉際微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性特征尚不明確。為此，采用高通量測序技術(shù)從微觀層面解析感染角斑病煙葉與健康煙葉間葉際細菌和真菌的菌群結(jié)構(gòu)差異，以期為揭示煙草感染角斑病后其葉際微生物群落的變化規(guī)律提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試煙草品種為云煙87，DNA提取試劑盒（Fast DNA?Spin Kit for Soil）購自美國MP Biomedicals 生物醫(yī)學公司，GeneJET 膠回收試劑盒（k0691）和Ion Plus Fragment Library Kit 建庫試劑盒均購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 取樣地概況及樣品采集

本試驗取樣時間為2019 年8 月，取樣地點為貴州省施秉縣（107°52′37″～108°28′47″E，26°46′46″～27°20′16″N），取樣煙田煙草角斑病大規(guī)模爆發(fā)且前期未噴藥。在同一煙田內(nèi)隨機選取明顯感染角斑病的上部煙葉15 片（病斑數(shù)＞10），用消毒剪刀剪取煙葉單個病斑部位的病葉組織，5片感病煙葉的病葉組織混合作為1 個處理，每個處理設(shè)置3 次重復，分別編號為SX1、SX2和SX3。再按上述方法在同一煙田隨機剪取健康煙葉，制備組織樣品，分別編號為SXJ1、SXJ2 和SXJ3。整個取樣過程嚴格消毒，將采集的樣品裝入50 mL無菌離心管中，低溫保存運輸，帶回實驗室并置于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 微生物基因組DNA的提取及擴增子測序

參照Fast DNA?SPIN 試劑盒說明書提取感病與健康煙葉樣品葉際微生物基因組DNA。用NanoDrop 2000（A260/A280為1.8～2.0）檢測提取的DNA樣本純度和濃度，使用無菌水將其稀釋至適宜質(zhì)量濃度（1 ng/μL）。以稀釋后的基因組DNA為模板，分別選取引物515F（5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′）、806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）和引物ITS5-1737F（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）、ITS2-2043R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′），參照Apprill等［17］的擴增體系及方法分別對樣品細菌基因組DNA的16S V4區(qū)域和真菌基因組DNA的ITS1區(qū)域進行PCR擴增。PCR純化產(chǎn)物回收后，使用Ion Plus Fragment Library Kit 建庫試劑盒構(gòu)建細菌16S 和真菌ITS 文庫，并在Ion S5TMXL 平臺上完成測序分析。

1.4 微生物群落結(jié)構(gòu)與多樣性分析

對原始序列優(yōu)化處理后，使用Uparse 軟件（Uparse v7.0.1001）以97%相似性水平對處理后的Clean reads 進行OTU 聚類［18］，用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。使用MUSCLE 軟件對各樣品的數(shù)據(jù)進行均一化處理，同時分別統(tǒng)計葉際細菌和真菌在各分類水平的群落組成。使用Qiime軟件（Version 1.9.1）計算樣品細菌和真菌群落的α 多樣性指數(shù)。此外，采用Tax4Fun 程序語言分別與Greengene 和FUNGuild 數(shù)據(jù)庫比對，進一步分析感病與健康煙葉葉際細菌和真菌群落功能類群；采用R軟件（Version 2.15.3）繪制稀釋曲線圖、Venn 圖、物種組成柱形圖、物種功能柱形圖和功能聚類熱圖［19-20］。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2019 和DPS7.5 軟件進行數(shù)據(jù)處理，采用LSD法進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 16S與ITS測序深度分析

樣品測序數(shù)據(jù)量是否合理可通過稀釋曲線（Rarefaction Curve）來體現(xiàn)［15］。細菌和真菌樣品稀釋曲線結(jié)果見圖1。本次測序的6 個細菌樣品除SX2樣品以外，稀釋曲線在測序數(shù)據(jù)量達2 500條序列時已趨于平緩；6 個真菌樣品的稀釋曲線在測序數(shù)據(jù)量達4 000 條序列時已趨于平緩。表明本次測序數(shù)據(jù)量已足夠，測序結(jié)果合理，可進行后續(xù)分析。

圖1 煙葉樣品細菌（A）和真菌（B）的稀釋曲線（OTU水平）Fig.1 Rarefaction curves of bacteria（A）and fungi（B）in tobacco samples（OTU level）

2.2 數(shù)據(jù)質(zhì)控和OTU聚類

測序的6個樣品16S序列經(jīng)過濾和優(yōu)化后共獲得高質(zhì)量序列480 756 條，197 383 926 個堿基，序列平均長度為410 bp。其中，感病煙葉3個樣品共獲得高質(zhì)量序列246 144條，健康煙葉3個樣品共獲得高質(zhì)量序列259 319條，質(zhì)控有效率達95.21%。對獲得的高質(zhì)量16S序列進行OTU聚類，經(jīng)比對注釋到數(shù)據(jù)庫的OTUs數(shù)目為306個，占100%。注釋到界、門、綱、目、科、屬和種7個物種分類水平的比例分別為100%、79.08%、76.14%、65.36%、56.86%、42.16%和11.44%。

測序的6 個樣品ITS 序列經(jīng)過濾和優(yōu)化后共獲得高質(zhì)量序列378 597 條，106 632 635 個堿基，序列平均長度為283 bp。其中，感病煙葉3個樣品獲得高質(zhì)量序列208 255 條，健康煙葉3 個樣品獲得高質(zhì)量序列170 342條，質(zhì)控有效率達99.39%。對獲得高質(zhì)量ITS 序列進行OTU 聚類，經(jīng)比對注釋到數(shù)據(jù)庫的OTUs 數(shù)目為268 個，占96.75%。注釋到界、門、綱、目、科、屬和種的比例分別為96.75%、52.35%、48.38%、47.65%、40.07%、36.82%和25.27%。

感病與健康煙葉葉際細菌和真菌群落差異分析結(jié)果見圖2。感病與健康煙葉葉際細菌群落間存在較大差異，感病煙葉葉際存在135 個特有的OTUs，遠高于兩者共有及健康煙葉葉際特有的OUTs 數(shù)目（圖2A）。感病與健康煙葉葉際真菌群落間差異不明顯，感病與健康煙葉葉際中存在161 個共有的OTUs，遠高于兩者特有的OTUs數(shù)目（圖2B）。

圖2 感病與健康煙葉葉際細菌（A）和真菌（B）OTUs分布Venn圖Fig.2 Venn diagrams of phyllosphere bacterial（A）and fungal（B）OTUs distribution in diseased and healthy tobacco leaves

2.3 感病與健康煙葉葉際微生物群落α多樣性分析

由表1 可知，測序的細菌與真菌樣品組間的覆蓋度指數(shù)（Coverage index）均達到0.989 以上，表明測序結(jié)果具備代表性，能夠較真實、合理地反映樣品葉際細菌和真菌多樣性。感病煙葉葉際細菌的多樣性指數(shù)（Shannon）和豐富度指數(shù)（Chaol、ACE）均高于健康煙葉。其中，感病煙葉葉際細菌Shannon 多樣性指數(shù)顯著高于健康煙葉；感病煙葉葉際真菌多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)也均高于健康煙葉，但差異不顯著。

表1 感病與健康煙葉葉際細菌和真菌α多樣性指數(shù)①Tab.1 Alpha diversity indices of phyllosphere bacteria and fungi in diseased and healthy tobacco leaves

2.4 感病與健康煙葉葉際細菌和真菌群落結(jié)構(gòu)分析

在細菌群落門水平上，感病煙葉與健康煙葉葉際優(yōu)勢細菌門種類一致，但相對豐度存在差異。其中，感?。⊿X）與健康（SXJ）煙葉葉際均存在的優(yōu)勢細菌門為變形菌門（Proteobacteria，相對豐度分別為76.13%和17.32%）、放線菌門（Actinobacteria，2.04%和0.31%）和厚壁菌門（Firmicutes，3.40% 和0.37%）。其中，感病煙葉葉際的變形菌門相對豐度顯著高于健康煙葉（圖3A）。在真菌群落門水平上，感病煙葉與健康煙葉葉際優(yōu)勢真菌門種類一致，但相對豐度存在差異。其中，感病與健康煙葉葉際均存在的優(yōu)勢真菌門為子囊菌門（Ascomycota，62.64%和23.37%）、被孢菌門（Mortierellomycota，0.39%和1.05%）。其中，感病煙葉葉際子囊菌門的相對豐度顯著高于健康煙葉（圖3B）。

圖3 感病與健康煙葉葉際細菌（A）和真菌（B）門水平的相對豐度Fig.3 Relative abundance of phyllosphere bacteria（A）and fungi（B）at the phylum level of diseased and healthy tobacco leaves

在細菌群落屬水平上，感病煙葉與健康煙葉葉際優(yōu)勢細菌屬種類與相對豐度均存在差異。其中，感病煙葉葉際優(yōu)勢菌屬為假單胞菌屬（Pseudomonas）、泛菌屬（Pantoea）、黃桿菌屬（Xanthomonas）、甲基桿菌屬（Methylobacterium）、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）和屬水平未分類的根瘤科（unidentified_Rhizobiaceae），相對豐度分別為35.94%、10.68%、4.94%、4.18%、2.38%、2.99%和7.73%（圖4A）。健康煙葉葉際優(yōu)勢菌屬為假單胞菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、泛菌屬和甲基桿菌屬，相對豐度分別為8.88%、2.35%、1.84%和1.33%。在真菌群落屬水平上，感病煙葉與健康煙葉葉際優(yōu)勢真菌種類及相對豐度均存在差異。其中，感病煙葉葉際優(yōu)勢菌屬為小不整球殼屬（Plectosphaerella）、亞格孢殼屬（Didymella）、赤霉菌屬（Gibberella）和鏈格孢屬（Alternaria），相對豐度分別為10.81%、9.06%、3.23%和2.20%。健康煙葉葉際優(yōu)勢菌屬為小不整球殼屬、枝孢霉屬（Cladosporium）、亞格孢殼屬和Boeremia，相對豐度分別為6.56%、1.09%、2.98%和1.09%（圖4B）。

圖4 感病與健康煙葉葉際細菌（A）和真菌（B）屬水平的相對豐度Fig.4 Relative abundance of phyllosphere bacteria（A）and fungi（B）at the genus level of diseased and healthy tobacco leaves

2.5 感病與健康煙葉葉際細菌和真菌功能預測

煙葉葉際細菌功能預測結(jié)果（圖5）表明，在一級功能層（L1）上，感病與健康煙葉葉際細菌均分布于6類功能通路。主要為代謝類（相對豐度分別為48.34%和50.41%），其次為遺傳信息處理類（16.66%和17.28%）、環(huán)境信息處理類（14.83%和13.15%）、細胞轉(zhuǎn)化類（3.46%和2.46%）、人類疾病類（1.34%和1.27%），最低的為有機系統(tǒng)類（0.80%和0.88%）（圖5A）。

圖5 感病與健康煙葉葉際細菌的KEGG功能預測Fig.5 Functional prediction of phyllosphere bacteria in diseased and healthy tobacco leaves

細菌群落功能聚類熱圖（圖5B）表明，感病與健康煙葉葉際細菌在二級功能層（L2）上均主要分布于35 類代謝通路中，感病與健康煙葉葉際細菌功能通路種類基本相同，但相對豐度存在差異。其中，感病與健康煙葉葉際細菌在二級功能層上相對豐度最高的均為環(huán)境信息處理類中的膜運輸（相對豐度分別為10.8%和12.3%），但感病與健康煙葉葉際細菌主要分布于新陳代謝類，功能從強到弱（＞1%）依次為能量代謝（8.0%～10.5%）、氨基酸代謝（8.2%～9.0%）、碳水化合物代謝（8.3%～8.6%）、輔酶和維生素代謝（5.0%～5.9%）、核苷酸代謝（3.2%～3.3%）、脂質(zhì)代謝（2.6%～3.1%）、未分類代謝（2.6%～2.7%）、外源生物降解和代謝（2.2%～2.7%）、萜類化合物和聚酮化合物代謝（1.9%～2.1%）、聚糖生物合成和代謝（1.9%）、其他氨基酸代謝（1.6%～1.7%）。

煙葉葉際真菌群落功能預測柱形圖（圖6）表明，感病與健康煙葉葉際真菌生態(tài)功能類群相似，均主要分布于22個生態(tài)功能類群，其差異主要體現(xiàn)在優(yōu)勢生態(tài)功能類群的相對豐度上。感病煙葉葉際真菌主要分布于植物病原菌（14.99%）、植物病原-未定義腐生菌（9.06%）、動物病原體-植物病原體-木材病原體-木腐生菌（2.20%）和內(nèi)生植物病原菌（1.04%）。健康煙葉葉際真菌主要分布于植物病原菌（7.69%）、植物病原-未定義腐生菌（2.98%）、內(nèi)生植物病原菌（2.18%）和未定義腐生菌（1.05%）。

圖6 感病與健康煙葉葉際真菌的FUNGuild功能預測Fig.6 Functional prediction of phyllosphere fungi in diseased and healthy tobacco leaves

3 討論

植物葉際微生物以營腐生、內(nèi)生和自由生活等方式定殖，通過競爭、拮抗及誘導植物系統(tǒng)抗性等作用保護宿主植物抵御病原體侵染［21］。研究表明，葉際微生物群落結(jié)構(gòu)改變是誘導植物發(fā)病的一個重要影響因素［22］。本研究中發(fā)現(xiàn)感染煙草角斑病煙葉葉際優(yōu)勢細菌屬為假單胞菌屬、泛菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、甲基桿菌屬、黃桿菌屬；優(yōu)勢真菌屬為小不整球殼屬、亞格孢殼屬、赤霉菌屬和鏈格孢屬，與劉亭亭等［23］報道的感染赤星病煙葉葉際優(yōu)勢細菌、真菌種類部分一致。相比于健康煙葉，感病煙葉葉際細菌和真菌的優(yōu)勢菌屬種類均增加。其中，感病煙葉葉際假單胞菌屬的相對豐度遠高于健康煙葉。該屬種類繁多、功能類群多樣［24］，被報道的病原菌有丁香假單胞煙草致病變種（Pseudomonas syringae pv. tabaci）［6］、丁香假單胞桿菌角斑專化型［4］，兩者在環(huán)境適宜條件下均能大量繁殖，為害煙葉。該屬被報道的生防菌有御假單胞菌（P. protegens）、綠針假單胞菌（P.choloeaphtis）、熒光假單胞菌（P. fluorescens）等［25］。此外，該菌屬有些物種還具備生物降解的功能，如產(chǎn)堿假單胞菌（P.alcaligenes）、惡臭假單胞菌（P.putida）等均能代謝產(chǎn)生促進生物降解的物質(zhì)［26］。同時，在環(huán)境方面，由于取樣期間煙田溫度與濕度均較高，高溫高濕有利于細菌性病害的發(fā)生。因此，推測環(huán)境與病菌假單胞菌屬共同作用，使煙葉葉際微生物群落結(jié)構(gòu)失調(diào)，從而導致煙葉感角斑病后其葉際優(yōu)勢細菌和真菌種類增加，但假單胞菌屬與其他優(yōu)勢細菌和真菌間的作用機制還有待進一步研究。

病原菌的侵染通常會導致葉際微生物多樣性發(fā)生改變，細菌性病害發(fā)生后，葉際微生物多樣性增加［21］，而真菌性病害則相反。例如，煙草在感染青枯病后，其莖稈病害組織的真菌群落豐富度與多樣性均顯著增加［27］，而煙葉在感染赤星病后，其感病組織葉際微生物多樣性則會降低［13］。本研究中發(fā)現(xiàn)感病煙葉葉際細菌和真菌的豐富度和多樣性均高于健康煙葉，尤其是細菌多樣性差異顯著，說明煙草細菌性病害的發(fā)生會使其葉際細菌、真菌豐富度和多樣性增加。有研究報道，微生物在植物葉際定殖存在優(yōu)先效應，即微生物定殖的先后順序會影響植物葉際菌群結(jié)構(gòu)［22］。其中，假單胞菌屬為葉際初級定殖菌，可保護次級定殖菌抵御環(huán)境脅迫［28］。因此，推測煙葉在感病后其葉際假單胞菌屬豐度增加為其他次級定殖菌提供了有利條件，使葉際真菌和細菌豐富度和多樣性增加。

植物葉際微生物在葉際定殖通常發(fā)揮其自身特定的生理功能［21］。本研究中發(fā)現(xiàn)感染角斑病煙葉與健康煙葉葉際細菌分布于6類功能通路中，其中以代謝類為主，其次是遺傳信息處理類。二級功能層以膜運輸相對豐度最高，其次是氨基酸、碳水化合物、核苷酸等物質(zhì)和能量代謝。有研究報道，黃桿菌屬能夠降解無機磷［29］，甲基桿菌屬能夠利用其他大部分生物不能利用的物質(zhì)（如甲醇、甲醛等）作為碳源和能源生長［30］。推測煙葉感染角斑病后，假單胞菌屬在葉際養(yǎng)分的利用上占據(jù)優(yōu)勢而抑制其他部分菌屬生長時，黃桿菌屬和甲基桿菌屬卻能夠利用自身獨特方式獲取營養(yǎng)物質(zhì)進行生長繁殖，演變?yōu)楦胁熑~葉際優(yōu)勢細菌屬。此外，本研究中還發(fā)現(xiàn)感病與健康煙葉葉際真菌均主要分布在植物病原菌和植物病原-未定義腐生菌兩個功能類群，這與Huang等［31］報道侵染煙葉的亞格孢殼屬真菌功能預測的研究結(jié)果基本一致，進一步說明了植物病原菌和植物病原-未定義腐生菌為煙草葉際優(yōu)勢真菌類群。

4 結(jié)論

感染角斑病煙葉葉際細菌優(yōu)勢菌屬為假單胞菌屬、泛菌屬、屬水平未分類的根瘤科、甲基桿菌屬、黃桿菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬和鞘氨醇單胞菌屬；健康煙葉葉際細菌優(yōu)勢菌屬為甲基桿菌屬、泛菌屬、鞘氨醇單胞菌屬和假單胞菌屬。感病煙葉葉際真菌優(yōu)勢菌屬為小不整球殼屬、亞格孢殼屬、赤霉菌屬和鏈格孢屬；健康煙葉葉際真菌優(yōu)勢菌屬為小不整球殼屬、亞格孢殼屬、枝孢霉屬和Boeremia。感病煙葉葉際細菌和真菌的多樣性和豐富度指數(shù)均高于健康煙葉。感病與健康煙葉葉際細菌功能通路種類基本一致，而相對豐度存在差異。感病與健康煙葉葉際真菌的功能類群大部分相同，但相對豐度存在差異。