吳小軍，汪漢成，孫美麗，蔡劉體，孟建玉，王 豐，彭麗娟

1. 貴州大學(xué)煙草學(xué)院，貴陽(yáng)市花溪區(qū)花溪大道南段2708 號(hào) 550025

2. 貴州省煙草科學(xué)研究院，貴陽(yáng)市觀山湖區(qū)龍灘壩路29 號(hào) 550081

3. 長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北省荊州市荊州區(qū)荊秘路88 號(hào) 434025

煙草角斑病是煙葉生產(chǎn)上危害較大的一種細(xì)菌性病害，其病原菌為丁香假單胞桿菌角斑?；停≒seudomonas syringae pv. angulata）［1-2］。該病原菌不產(chǎn)生毒素，可通過傷口或氣孔侵染煙株的葉、花和莖等，借助風(fēng)雨、昆蟲在煙田傳播［3-4］。該病害在我國(guó)云南、貴州、四川和福建等主產(chǎn)煙區(qū)均有發(fā)生，且常與赤星病和野火病混合發(fā)生，對(duì)煙葉生產(chǎn)造成較大經(jīng)濟(jì)損失［5-6］。植物葉際菌群結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定程度會(huì)直接影響植物健康［7］。近年來，基于擴(kuò)增子測(cè)序的分析技術(shù)被廣泛用于植物的葉際、根際以及種子內(nèi)生微生物群落結(jié)構(gòu)的研究中［8-11］。有關(guān)煙草葉片真菌性病害的葉際微生物群落結(jié)構(gòu)與多樣性已有較多報(bào)道。劉暢等［12］研究發(fā)現(xiàn)，感煙草赤星病葉際的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為假單胞菌屬（Pseudomonas）和泛菌屬（Pantoea）。向立剛等［13］研究表明，感赤星病的烤后煙葉葉際真菌多樣性低于健康煙葉。陳乾麗等［14］研究發(fā)現(xiàn)，烤后輕度霉變煙葉真菌群落多樣性高于重度霉變煙葉。孫美麗等［15］研究認(rèn)為，感靶斑病煙葉葉際真菌群落多樣性降低，而葉際細(xì)菌群落多樣性增加。劉天波等［16］研究提出，通過施用拮抗菌劑能夠改善感野火病煙葉葉際菌群結(jié)構(gòu)。而目前有關(guān)煙草細(xì)菌性病害葉際微生物的研究卻鮮見報(bào)道，尤其是煙草角斑病等主要細(xì)菌性病害，其葉際微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性特征尚不明確。為此，采用高通量測(cè)序技術(shù)從微觀層面解析感染角斑病煙葉與健康煙葉間葉際細(xì)菌和真菌的菌群結(jié)構(gòu)差異，以期為揭示煙草感染角斑病后其葉際微生物群落的變化規(guī)律提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試煙草品種為云煙87，DNA提取試劑盒（Fast DNA?Spin Kit for Soil）購(gòu)自美國(guó)MP Biomedicals 生物醫(yī)學(xué)公司，GeneJET 膠回收試劑盒（k0691）和Ion Plus Fragment Library Kit 建庫(kù)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 取樣地概況及樣品采集

本試驗(yàn)取樣時(shí)間為2019 年8 月，取樣地點(diǎn)為貴州省施秉縣（107°52′37″～108°28′47″E，26°46′46″～27°20′16″N），取樣煙田煙草角斑病大規(guī)模爆發(fā)且前期未噴藥。在同一煙田內(nèi)隨機(jī)選取明顯感染角斑病的上部煙葉15 片（病斑數(shù)＞10），用消毒剪刀剪取煙葉單個(gè)病斑部位的病葉組織，5片感病煙葉的病葉組織混合作為1 個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)置3 次重復(fù)，分別編號(hào)為SX1、SX2和SX3。再按上述方法在同一煙田隨機(jī)剪取健康煙葉，制備組織樣品，分別編號(hào)為SXJ1、SXJ2 和SXJ3。整個(gè)取樣過程嚴(yán)格消毒，將采集的樣品裝入50 mL無(wú)菌離心管中，低溫保存運(yùn)輸，帶回實(shí)驗(yàn)室并置于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 微生物基因組DNA的提取及擴(kuò)增子測(cè)序

參照Fast DNA?SPIN 試劑盒說明書提取感病與健康煙葉樣品葉際微生物基因組DNA。用NanoDrop 2000（A260/A280為1.8～2.0）檢測(cè)提取的DNA樣本純度和濃度，使用無(wú)菌水將其稀釋至適宜質(zhì)量濃度（1 ng/μL）。以稀釋后的基因組DNA為模板，分別選取引物515F（5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′）、806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）和引物ITS5-1737F（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）、ITS2-2043R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′），參照Apprill等［17］的擴(kuò)增體系及方法分別對(duì)樣品細(xì)菌基因組DNA的16S V4區(qū)域和真菌基因組DNA的ITS1區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR純化產(chǎn)物回收后，使用Ion Plus Fragment Library Kit 建庫(kù)試劑盒構(gòu)建細(xì)菌16S 和真菌ITS 文庫(kù)，并在Ion S5TMXL 平臺(tái)上完成測(cè)序分析。

1.4 微生物群落結(jié)構(gòu)與多樣性分析

對(duì)原始序列優(yōu)化處理后，使用Uparse 軟件（Uparse v7.0.1001）以97%相似性水平對(duì)處理后的Clean reads 進(jìn)行OTU 聚類［18］，用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。使用MUSCLE 軟件對(duì)各樣品的數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理，同時(shí)分別統(tǒng)計(jì)葉際細(xì)菌和真菌在各分類水平的群落組成。使用Qiime軟件（Version 1.9.1）計(jì)算樣品細(xì)菌和真菌群落的α 多樣性指數(shù)。此外，采用Tax4Fun 程序語(yǔ)言分別與Greengene 和FUNGuild 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，進(jìn)一步分析感病與健康煙葉葉際細(xì)菌和真菌群落功能類群；采用R軟件（Version 2.15.3）繪制稀釋曲線圖、Venn 圖、物種組成柱形圖、物種功能柱形圖和功能聚類熱圖［19-20］。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2019 和DPS7.5 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用LSD法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 16S與ITS測(cè)序深度分析

樣品測(cè)序數(shù)據(jù)量是否合理可通過稀釋曲線（Rarefaction Curve）來體現(xiàn)［15］。細(xì)菌和真菌樣品稀釋曲線結(jié)果見圖1。本次測(cè)序的6 個(gè)細(xì)菌樣品除SX2樣品以外，稀釋曲線在測(cè)序數(shù)據(jù)量達(dá)2 500條序列時(shí)已趨于平緩；6 個(gè)真菌樣品的稀釋曲線在測(cè)序數(shù)據(jù)量達(dá)4 000 條序列時(shí)已趨于平緩。表明本次測(cè)序數(shù)據(jù)量已足夠，測(cè)序結(jié)果合理，可進(jìn)行后續(xù)分析。

圖1 煙葉樣品細(xì)菌（A）和真菌（B）的稀釋曲線（OTU水平）Fig.1 Rarefaction curves of bacteria（A）and fungi（B）in tobacco samples（OTU level）

2.2 數(shù)據(jù)質(zhì)控和OTU聚類

測(cè)序的6個(gè)樣品16S序列經(jīng)過濾和優(yōu)化后共獲得高質(zhì)量序列480 756 條，197 383 926 個(gè)堿基，序列平均長(zhǎng)度為410 bp。其中，感病煙葉3個(gè)樣品共獲得高質(zhì)量序列246 144條，健康煙葉3個(gè)樣品共獲得高質(zhì)量序列259 319條，質(zhì)控有效率達(dá)95.21%。對(duì)獲得的高質(zhì)量16S序列進(jìn)行OTU聚類，經(jīng)比對(duì)注釋到數(shù)據(jù)庫(kù)的OTUs數(shù)目為306個(gè)，占100%。注釋到界、門、綱、目、科、屬和種7個(gè)物種分類水平的比例分別為100%、79.08%、76.14%、65.36%、56.86%、42.16%和11.44%。

測(cè)序的6 個(gè)樣品ITS 序列經(jīng)過濾和優(yōu)化后共獲得高質(zhì)量序列378 597 條，106 632 635 個(gè)堿基，序列平均長(zhǎng)度為283 bp。其中，感病煙葉3個(gè)樣品獲得高質(zhì)量序列208 255 條，健康煙葉3 個(gè)樣品獲得高質(zhì)量序列170 342條，質(zhì)控有效率達(dá)99.39%。對(duì)獲得高質(zhì)量ITS 序列進(jìn)行OTU 聚類，經(jīng)比對(duì)注釋到數(shù)據(jù)庫(kù)的OTUs 數(shù)目為268 個(gè)，占96.75%。注釋到界、門、綱、目、科、屬和種的比例分別為96.75%、52.35%、48.38%、47.65%、40.07%、36.82%和25.27%。

感病與健康煙葉葉際細(xì)菌和真菌群落差異分析結(jié)果見圖2。感病與健康煙葉葉際細(xì)菌群落間存在較大差異，感病煙葉葉際存在135 個(gè)特有的OTUs，遠(yuǎn)高于兩者共有及健康煙葉葉際特有的OUTs 數(shù)目（圖2A）。感病與健康煙葉葉際真菌群落間差異不明顯，感病與健康煙葉葉際中存在161 個(gè)共有的OTUs，遠(yuǎn)高于兩者特有的OTUs數(shù)目（圖2B）。

圖2 感病與健康煙葉葉際細(xì)菌（A）和真菌（B）OTUs分布Venn圖Fig.2 Venn diagrams of phyllosphere bacterial（A）and fungal（B）OTUs distribution in diseased and healthy tobacco leaves

2.3 感病與健康煙葉葉際微生物群落α多樣性分析

由表1 可知，測(cè)序的細(xì)菌與真菌樣品組間的覆蓋度指數(shù)（Coverage index）均達(dá)到0.989 以上，表明測(cè)序結(jié)果具備代表性，能夠較真實(shí)、合理地反映樣品葉際細(xì)菌和真菌多樣性。感病煙葉葉際細(xì)菌的多樣性指數(shù)（Shannon）和豐富度指數(shù)（Chaol、ACE）均高于健康煙葉。其中，感病煙葉葉際細(xì)菌Shannon 多樣性指數(shù)顯著高于健康煙葉；感病煙葉葉際真菌多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)也均高于健康煙葉，但差異不顯著。

表1 感病與健康煙葉葉際細(xì)菌和真菌α多樣性指數(shù)①Tab.1 Alpha diversity indices of phyllosphere bacteria and fungi in diseased and healthy tobacco leaves

2.4 感病與健康煙葉葉際細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)分析

在細(xì)菌群落門水平上，感病煙葉與健康煙葉葉際優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門種類一致，但相對(duì)豐度存在差異。其中，感?。⊿X）與健康（SXJ）煙葉葉際均存在的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門為變形菌門（Proteobacteria，相對(duì)豐度分別為76.13%和17.32%）、放線菌門（Actinobacteria，2.04%和0.31%）和厚壁菌門（Firmicutes，3.40% 和0.37%）。其中，感病煙葉葉際的變形菌門相對(duì)豐度顯著高于健康煙葉（圖3A）。在真菌群落門水平上，感病煙葉與健康煙葉葉際優(yōu)勢(shì)真菌門種類一致，但相對(duì)豐度存在差異。其中，感病與健康煙葉葉際均存在的優(yōu)勢(shì)真菌門為子囊菌門（Ascomycota，62.64%和23.37%）、被孢菌門（Mortierellomycota，0.39%和1.05%）。其中，感病煙葉葉際子囊菌門的相對(duì)豐度顯著高于健康煙葉（圖3B）。

圖3 感病與健康煙葉葉際細(xì)菌（A）和真菌（B）門水平的相對(duì)豐度Fig.3 Relative abundance of phyllosphere bacteria（A）and fungi（B）at the phylum level of diseased and healthy tobacco leaves

在細(xì)菌群落屬水平上，感病煙葉與健康煙葉葉際優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬種類與相對(duì)豐度均存在差異。其中，感病煙葉葉際優(yōu)勢(shì)菌屬為假單胞菌屬（Pseudomonas）、泛菌屬（Pantoea）、黃桿菌屬（Xanthomonas）、甲基桿菌屬（Methylobacterium）、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）和屬水平未分類的根瘤科（unidentified_Rhizobiaceae），相對(duì)豐度分別為35.94%、10.68%、4.94%、4.18%、2.38%、2.99%和7.73%（圖4A）。健康煙葉葉際優(yōu)勢(shì)菌屬為假單胞菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、泛菌屬和甲基桿菌屬，相對(duì)豐度分別為8.88%、2.35%、1.84%和1.33%。在真菌群落屬水平上，感病煙葉與健康煙葉葉際優(yōu)勢(shì)真菌種類及相對(duì)豐度均存在差異。其中，感病煙葉葉際優(yōu)勢(shì)菌屬為小不整球殼屬（Plectosphaerella）、亞格孢殼屬（Didymella）、赤霉菌屬（Gibberella）和鏈格孢屬（Alternaria），相對(duì)豐度分別為10.81%、9.06%、3.23%和2.20%。健康煙葉葉際優(yōu)勢(shì)菌屬為小不整球殼屬、枝孢霉屬（Cladosporium）、亞格孢殼屬和Boeremia，相對(duì)豐度分別為6.56%、1.09%、2.98%和1.09%（圖4B）。

圖4 感病與健康煙葉葉際細(xì)菌（A）和真菌（B）屬水平的相對(duì)豐度Fig.4 Relative abundance of phyllosphere bacteria（A）and fungi（B）at the genus level of diseased and healthy tobacco leaves

2.5 感病與健康煙葉葉際細(xì)菌和真菌功能預(yù)測(cè)

煙葉葉際細(xì)菌功能預(yù)測(cè)結(jié)果（圖5）表明，在一級(jí)功能層（L1）上，感病與健康煙葉葉際細(xì)菌均分布于6類功能通路。主要為代謝類（相對(duì)豐度分別為48.34%和50.41%），其次為遺傳信息處理類（16.66%和17.28%）、環(huán)境信息處理類（14.83%和13.15%）、細(xì)胞轉(zhuǎn)化類（3.46%和2.46%）、人類疾病類（1.34%和1.27%），最低的為有機(jī)系統(tǒng)類（0.80%和0.88%）（圖5A）。

圖5 感病與健康煙葉葉際細(xì)菌的KEGG功能預(yù)測(cè)Fig.5 Functional prediction of phyllosphere bacteria in diseased and healthy tobacco leaves

細(xì)菌群落功能聚類熱圖（圖5B）表明，感病與健康煙葉葉際細(xì)菌在二級(jí)功能層（L2）上均主要分布于35 類代謝通路中，感病與健康煙葉葉際細(xì)菌功能通路種類基本相同，但相對(duì)豐度存在差異。其中，感病與健康煙葉葉際細(xì)菌在二級(jí)功能層上相對(duì)豐度最高的均為環(huán)境信息處理類中的膜運(yùn)輸（相對(duì)豐度分別為10.8%和12.3%），但感病與健康煙葉葉際細(xì)菌主要分布于新陳代謝類，功能從強(qiáng)到弱（＞1%）依次為能量代謝（8.0%～10.5%）、氨基酸代謝（8.2%～9.0%）、碳水化合物代謝（8.3%～8.6%）、輔酶和維生素代謝（5.0%～5.9%）、核苷酸代謝（3.2%～3.3%）、脂質(zhì)代謝（2.6%～3.1%）、未分類代謝（2.6%～2.7%）、外源生物降解和代謝（2.2%～2.7%）、萜類化合物和聚酮化合物代謝（1.9%～2.1%）、聚糖生物合成和代謝（1.9%）、其他氨基酸代謝（1.6%～1.7%）。

煙葉葉際真菌群落功能預(yù)測(cè)柱形圖（圖6）表明，感病與健康煙葉葉際真菌生態(tài)功能類群相似，均主要分布于22個(gè)生態(tài)功能類群，其差異主要體現(xiàn)在優(yōu)勢(shì)生態(tài)功能類群的相對(duì)豐度上。感病煙葉葉際真菌主要分布于植物病原菌（14.99%）、植物病原-未定義腐生菌（9.06%）、動(dòng)物病原體-植物病原體-木材病原體-木腐生菌（2.20%）和內(nèi)生植物病原菌（1.04%）。健康煙葉葉際真菌主要分布于植物病原菌（7.69%）、植物病原-未定義腐生菌（2.98%）、內(nèi)生植物病原菌（2.18%）和未定義腐生菌（1.05%）。

圖6 感病與健康煙葉葉際真菌的FUNGuild功能預(yù)測(cè)Fig.6 Functional prediction of phyllosphere fungi in diseased and healthy tobacco leaves

3 討論

植物葉際微生物以營(yíng)腐生、內(nèi)生和自由生活等方式定殖，通過競(jìng)爭(zhēng)、拮抗及誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性等作用保護(hù)宿主植物抵御病原體侵染［21］。研究表明，葉際微生物群落結(jié)構(gòu)改變是誘導(dǎo)植物發(fā)病的一個(gè)重要影響因素［22］。本研究中發(fā)現(xiàn)感染煙草角斑病煙葉葉際優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為假單胞菌屬、泛菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、甲基桿菌屬、黃桿菌屬；優(yōu)勢(shì)真菌屬為小不整球殼屬、亞格孢殼屬、赤霉菌屬和鏈格孢屬，與劉亭亭等［23］報(bào)道的感染赤星病煙葉葉際優(yōu)勢(shì)細(xì)菌、真菌種類部分一致。相比于健康煙葉，感病煙葉葉際細(xì)菌和真菌的優(yōu)勢(shì)菌屬種類均增加。其中，感病煙葉葉際假單胞菌屬的相對(duì)豐度遠(yuǎn)高于健康煙葉。該屬種類繁多、功能類群多樣［24］，被報(bào)道的病原菌有丁香假單胞煙草致病變種（Pseudomonas syringae pv. tabaci）［6］、丁香假單胞桿菌角斑?；停?］，兩者在環(huán)境適宜條件下均能大量繁殖，為害煙葉。該屬被報(bào)道的生防菌有御假單胞菌（P. protegens）、綠針假單胞菌（P.choloeaphtis）、熒光假單胞菌（P. fluorescens）等［25］。此外，該菌屬有些物種還具備生物降解的功能，如產(chǎn)堿假單胞菌（P.alcaligenes）、惡臭假單胞菌（P.putida）等均能代謝產(chǎn)生促進(jìn)生物降解的物質(zhì)［26］。同時(shí)，在環(huán)境方面，由于取樣期間煙田溫度與濕度均較高，高溫高濕有利于細(xì)菌性病害的發(fā)生。因此，推測(cè)環(huán)境與病菌假單胞菌屬共同作用，使煙葉葉際微生物群落結(jié)構(gòu)失調(diào)，從而導(dǎo)致煙葉感角斑病后其葉際優(yōu)勢(shì)細(xì)菌和真菌種類增加，但假單胞菌屬與其他優(yōu)勢(shì)細(xì)菌和真菌間的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

病原菌的侵染通常會(huì)導(dǎo)致葉際微生物多樣性發(fā)生改變，細(xì)菌性病害發(fā)生后，葉際微生物多樣性增加［21］，而真菌性病害則相反。例如，煙草在感染青枯病后，其莖稈病害組織的真菌群落豐富度與多樣性均顯著增加［27］，而煙葉在感染赤星病后，其感病組織葉際微生物多樣性則會(huì)降低［13］。本研究中發(fā)現(xiàn)感病煙葉葉際細(xì)菌和真菌的豐富度和多樣性均高于健康煙葉，尤其是細(xì)菌多樣性差異顯著，說明煙草細(xì)菌性病害的發(fā)生會(huì)使其葉際細(xì)菌、真菌豐富度和多樣性增加。有研究報(bào)道，微生物在植物葉際定殖存在優(yōu)先效應(yīng)，即微生物定殖的先后順序會(huì)影響植物葉際菌群結(jié)構(gòu)［22］。其中，假單胞菌屬為葉際初級(jí)定殖菌，可保護(hù)次級(jí)定殖菌抵御環(huán)境脅迫［28］。因此，推測(cè)煙葉在感病后其葉際假單胞菌屬豐度增加為其他次級(jí)定殖菌提供了有利條件，使葉際真菌和細(xì)菌豐富度和多樣性增加。

植物葉際微生物在葉際定殖通常發(fā)揮其自身特定的生理功能［21］。本研究中發(fā)現(xiàn)感染角斑病煙葉與健康煙葉葉際細(xì)菌分布于6類功能通路中，其中以代謝類為主，其次是遺傳信息處理類。二級(jí)功能層以膜運(yùn)輸相對(duì)豐度最高，其次是氨基酸、碳水化合物、核苷酸等物質(zhì)和能量代謝。有研究報(bào)道，黃桿菌屬能夠降解無(wú)機(jī)磷［29］，甲基桿菌屬能夠利用其他大部分生物不能利用的物質(zhì)（如甲醇、甲醛等）作為碳源和能源生長(zhǎng)［30］。推測(cè)煙葉感染角斑病后，假單胞菌屬在葉際養(yǎng)分的利用上占據(jù)優(yōu)勢(shì)而抑制其他部分菌屬生長(zhǎng)時(shí)，黃桿菌屬和甲基桿菌屬卻能夠利用自身獨(dú)特方式獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，演變?yōu)楦胁熑~葉際優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬。此外，本研究中還發(fā)現(xiàn)感病與健康煙葉葉際真菌均主要分布在植物病原菌和植物病原-未定義腐生菌兩個(gè)功能類群，這與Huang等［31］報(bào)道侵染煙葉的亞格孢殼屬真菌功能預(yù)測(cè)的研究結(jié)果基本一致，進(jìn)一步說明了植物病原菌和植物病原-未定義腐生菌為煙草葉際優(yōu)勢(shì)真菌類群。

4 結(jié)論

感染角斑病煙葉葉際細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌屬為假單胞菌屬、泛菌屬、屬水平未分類的根瘤科、甲基桿菌屬、黃桿菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬和鞘氨醇單胞菌屬；健康煙葉葉際細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌屬為甲基桿菌屬、泛菌屬、鞘氨醇單胞菌屬和假單胞菌屬。感病煙葉葉際真菌優(yōu)勢(shì)菌屬為小不整球殼屬、亞格孢殼屬、赤霉菌屬和鏈格孢屬；健康煙葉葉際真菌優(yōu)勢(shì)菌屬為小不整球殼屬、亞格孢殼屬、枝孢霉屬和Boeremia。感病煙葉葉際細(xì)菌和真菌的多樣性和豐富度指數(shù)均高于健康煙葉。感病與健康煙葉葉際細(xì)菌功能通路種類基本一致，而相對(duì)豐度存在差異。感病與健康煙葉葉際真菌的功能類群大部分相同，但相對(duì)豐度存在差異。