劉偉民，熊科輝，劉洋，陳敏，吳思昊，許海順，吳學謙1,

（1. 浙江農(nóng)林大學，浙江 杭州 311300；2. 浙江省特色中藥資源保護與創(chuàng)新利用重點實驗室，浙江 杭州 311300；3. 浙江五養(yǎng)堂中藥集團有限公司，浙江 遂昌 323300）

三葉青學名三葉崖爬藤Tetrastigmahemsleyanum，為葡萄科Vitaceae 崖爬藤屬Tetrastigma多年生藤本植物[1]，主要生長在浙江、江西、福建、廣西等省區(qū)的山林之中，是我國珍貴的林下中藥材[2-3]。三葉青有清熱解毒、化痰散結(jié)、消腫止痛等功效，常用于小兒高熱驚厥、肺炎、肝炎等疾病的治療[4]，現(xiàn)代也常用于惡性腫瘤的治療。三葉青多以干燥塊根入藥[5]，而產(chǎn)量數(shù)倍于塊根的葉片通常被廢棄，造成極大的資源浪費。因此，加強對三葉青葉資源的綜合開發(fā)利用，具有重要的經(jīng)濟效益和社會效益。目前，三葉青葉也開始廣泛用于多種國藥準字中成藥和保健食品, 如結(jié)石康膠囊、排石利膽膠囊、三葉青茶等，但仍需進一步研究[6]。

鑒于此，本研究測定了三葉青葉片不同萃取物的總黃酮、總多酚含量，對各萃取物進行了抗氧化及抗炎比較實驗，來評價三葉青葉片四個萃取物的抗氧化、抗炎活性，并聯(lián)用HPLC 進一步分析相關(guān)性，篩選出開發(fā)潛力較大的萃取物，初步探究其物質(zhì)基礎(chǔ)，為進一步研究開發(fā)三葉青葉資源、提高三葉青資源利用率提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

試驗用三葉青葉片于2022 年5 月采摘自浙江省遂昌縣三葉青種植基地大棚種植的三年生三葉青，隨機采摘成熟葉片，洗凈瀝干后經(jīng)65 ℃干燥處理所得。

蘆?。ㄅ?00080-201811）、沒食子酸（批號110831-201805）購自中國食品藥品檢定研究院；綠原酸（批號DST190906-021）、紫云英苷（批號DST190928-001）、咖啡酸（批號DST190517-013）、新綠原酸（批號DST190124-015）購自成都徳思特生物科技有限公司；2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（Butylated hydroxytoluene, BHT）、青霉素、鏈霉素、二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide, DMSO）、脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）購自美國Sigma公司；1,1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）購自如吉生物科技有限公司；甲醇、乙腈購自美國TEDIA 天地試劑公司；RAW 264.7 細胞購自美國種質(zhì)保藏中心；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（Fetal bovine serum, FBS）購自美國Gibco公司；一氧化氮試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

設(shè)備和儀器包括Waters e2695 高效液相色譜系統(tǒng)（Waters 2998 PDA 檢測器，美國沃特世儀器有限公司）、多功能酶標儀（BioTek Epoch 2，美國伯騰儀器有限公司）、電子分析天平（AL-104，梅特勒-托利多儀器上海有限公司）等。

1.2 三葉青葉提取物的制備與萃取

稱取干燥的三葉青葉100 g，用1 L 70%乙醇于室溫25 ℃浸提6 h，共提取2 次，過濾合并濾液，減壓濃縮至干，加入蒸餾水150 mL，混懸，分別用石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇、水萃取，減壓回收至干，依次命名為L-P，L-E，L-N，L-W。精密稱取以上不同萃取物0.100 0 g，用甲醇定容至50 mL，配制成濃度為2.0 mg·mL-1的樣品溶液。

1.3 總黃酮、總多酚的含量測定

取各樣品溶液2 mL，根據(jù)文獻[7]方法測定各萃取物中總黃酮的含量。取各樣品溶液0.8 mL，根據(jù)文獻[8]的方法測定各萃取物中總多酚的含量。

1.4 三葉青葉不同萃取物的抗氧化實驗

1.4.1 DPPH 自由基清除率的測定 配制濃度0.04 mg·mL-1DPPH 溶液，4 ℃避光保存?zhèn)溆?。按文獻[9]方法進行實驗，計算DPPH 自由基的清除率，實驗重復(fù)3 次。純凈水為空白，2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）為陽性對照。DPPH 自由基清除率計算公式如下：

式中，A0為不加樣品，只加DPPH 溶液測定的吸光度；A1為不加DPPH，只加樣品溶液測定的吸光度；A2為加試樣反應(yīng)后測定的DPPH 溶液吸光度。

1.4.2 還原力的測定 分別取各樣品溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0、1.4、1.8、2.0 mL，用甲醇補足至2 mL；按文獻[10]方法進行實驗測定吸光度，實驗重復(fù)3 次。純凈水為空白，BHT 為陽性對照。

1.4.3 總抗氧化活性測定 分別取各樣品溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，用甲醇補足至1 mL；按文獻[11-12]方法測定吸光度，實驗重復(fù)3 次。純凈水為空白，BHT 為陽性對照。

1.5 三葉青葉不同萃取物的抗炎實驗

按文獻[13]方法對購自美國種質(zhì)保藏中心的RAW 264.7 細胞進行培養(yǎng)傳代，用MTT 比色法檢測細胞活性，通過LPS 建立炎癥模型，將RAW 264.7 細胞用10 μg·mL-1各樣品溶液處理，設(shè)置不添加LPS 及三葉青葉萃取物的空白對照組CK，孵育結(jié)束后取上清液，用NO 試劑盒測定NO 釋放量。

1.6 三葉青葉乙酸乙酯、正丁醇萃取物HPLC 分析

標準品溶液的配制：精密稱取蘆丁、綠原酸、咖啡酸、紫云英苷、新綠原酸標準品各20 mg，加甲醇定容至10 mL，得到濃度為2.0 mg·mL-1的各標準品溶液。

吸取1.5 mL 各萃取物樣品溶液，0.45 μm 濾膜過濾，進樣體積10 μL。島津C18 色譜柱（5020-39203），4.6 mm×250 mm，孔徑5 μm，柱溫30 ℃。色譜條件（A-乙腈，B-0.1%甲酸水含5%甲醇）：0 ～ 25 min，10% ～ 20%A；25 ～ 30 min，20% A；30 ～ 45 min，20% ～ 30% A；45 ～ 50 min，30% ～ 80% A；50 ～ 55 min，80% A。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2021 和SPSS 26 軟件處理與分析數(shù)據(jù)，求得各萃取物樣品溶液的總黃酮、總多酚含量、DPPH 自由基清除率、還原力、抗氧化能力、NO 釋放量，并進行顯著性分析以及相關(guān)性分析，以P＜0.05 為顯著差異水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 三葉青葉不同萃取物總黃酮、總多酚含量測定

如圖1、圖2 所示，蘆丁標準曲線的回歸方程為y=7.681 5x+ 0.002 4，R2= 0.999 4。沒食子酸標準曲線的回歸方程為y= 41.384x+ 0.007 6，R2= 0.999 2。三葉青葉不同萃取物的總黃酮、總多酚含量見表1，單因素方差分析顯示，不同萃取物的總黃酮含量F值為2 324.379，總多酚含量F值為390.220，差異性均為極顯著（P＜0.01）。四種萃取物中總黃酮、總多酚含量的大小順序一致，均為L-E＞L-N＞L-W＞L-P。

圖1 蘆丁標準曲線Fig. 1 Standard curve of rutin

圖2 沒食子酸標準曲線Fig. 2 Standard curve of gallic acid

表1 三葉青葉不同萃取物的總黃酮、總多酚含量Tab. 1 Total flavonoids and polyphenol content of different extracts from leaves of T. hemsleyanum

2.2 三葉青葉不同萃取物的抗氧化實驗結(jié)果

2.2.1 DPPH 自由基清除率 采用DPPH 法測定了三葉青葉不同萃取物樣品對DPPH 自由基的清除能力，結(jié)果如圖3 所示。由圖3 可知，三葉青葉乙醇提取物（醇提物）的不同萃取物均具有不同程度的DPPH 自由基清除能力。在SPSS 軟件中導入圖3 的濃度、DPPH 自由基清除率變量，通過Probit 分析計算半最大效應(yīng)濃度值（EC50）。三葉青葉醇提物不同萃取物的EC50值分別為：L-P 0.5 mg·mL-1、L-E 0.08 mg·mL-1、L-N 0.05 mg·mL-1、L-W 0.3 mg·mL-1；BHT 的EC50值為0.002 mg·mL-1。以EC50值為評價標準，各萃取物的自由基清除能力為：BHT＞L-N＞L-E＞L-W＞L-P；以DPPH 自由基清除率為標準，各萃取物的自由基清除能力為：BHT＞L-E＞L-N＞L-W＞L-P。

圖3 三葉青葉不同萃取物的DPPH 自由基清除率Fig. 3 DPPH radical clearance of different extracts from leaves of T. hemsleyanum

2.2.2 三葉青葉不同萃取物的還原力 一般情況下，物質(zhì)的還原力越強，反映出物質(zhì)的抗氧化活性也越強[14]。三葉青葉提取物不同萃取物的還原力如圖4 所示。由圖4 可知，三葉青葉提取物的不同萃取物均有一定的還原能力，且還原力與樣品濃度呈正相關(guān)。在樣品濃度相同的條件下，各萃取物還原力的排序為BHT＞L-E＞L-P＞L-W＞L-N。

2.2.3 三葉青葉不同萃取物的總抗氧化活性 三葉青葉各萃取物的總抗氧化活性如圖5、圖6 所示。由圖5 可知，三葉青葉提取物不同萃取物的總抗氧化活性存在一定的量效關(guān)系。在實驗設(shè)定的濃度條件范圍內(nèi)，總抗氧化能力為L-P≈L-E＞BHT＞L-N＞L-W。由圖6 可看出，隨著反應(yīng)時間的延長，各萃取物的總抗氧化活性也在逐漸加強。

圖5 三葉青葉不同萃取物的總抗氧化活性與濃度的關(guān)系Fig. 5 Relationship between total antioxidant activity and concentration of different extracts from leaves of T. hemsleyanum

圖6 三葉青葉不同萃取物的總抗氧化活性與時間的關(guān)系Fig. 6 Relation of total antioxidant activity of different extracts from leaves of T. hemsleyanum with duration

2.3 三葉青葉不同萃取物的抗炎活性

NO 是炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用的促炎因子，其分泌量可間接反映炎癥程度。本研究利用濃度為1 μg·mL-1的LPS 誘導RAW 264.7 巨噬細胞炎癥模型，評估了三葉青葉不同萃取物的抗炎活性。圖7 為MTT 法檢測各萃取物對RAW264.7 細胞活力的影響。從圖7 可以看出，各萃取物在2 ～ 20 μg·mL-1濃度時對巨噬細胞RAW 264.7 的生長無影響，說明藥物在選定濃度范圍內(nèi)無細胞毒作用，所以選擇10 μg·mL-1濃度作為處理濃度，考察三葉青葉不同萃取物對巨噬細胞RAW264.7 炎癥模型的作用情況，結(jié)果見圖8。從圖8 表明，與LPS 組相比，三葉青葉不同萃取物的萃取液均降低了NO 的釋放量，模型組的NO 釋放量為28.35 μmol，L-P 為15.02 μmol，降低了47.24%，L-E 為18.87 μmol，降低了33.59%，L-N 為17.57 μmol，降低了38.19%，L-W 為19.00 μmol，降低了33.13%。NO 釋放量排序為L-W＞L-N＞L-E＞L-P。三葉青葉不同萃取物中，L-P 的抗炎活性最佳，其次為L-E，然后是L-N，L-W 效果最差。

圖7 不同質(zhì)量濃度三葉青葉萃取物對細胞RAW264.7存活率的影響Fig. 7 Survival rate of RAW264.7 treated by different extracts from leaves of T. hemsleyanum with different concentrations

圖8 三葉青葉不同萃取物提取液的抗炎活性Fig. 8 Anti-inflammatory activity of different extracts from leaves of T. hemsleyanum

2.4 三葉青葉提取物總黃酮、總多酚含量與抗氧化、抗炎能力的相關(guān)性

為評價三葉青不同萃取物總黃酮、總多酚含量與其抗氧化、抗炎活性的相關(guān)性，試驗對不同萃取物的抗氧化、抗炎活性進行單因素方差分析，并利用Pearson 法進行了相關(guān)性分析，結(jié)果見表2、表3、表4。

表2 不同萃取物抗氧化、抗炎活性的方差分析Tab. 2 ANOVA on antioxidant and anti-inflammatory activity of different extracts

表3 總黃酮、總多酚含量與抗氧化、抗炎活性的相關(guān)性分析Tab. 3 Correlation analysis on total flavonoids and total polyphenols content with antioxidant and anti-inflammatory activities

表4 總抗氧化能力與NO 釋放量的相關(guān)性分析Tab. 4 Correlation analysis on total oxidation capacity and NO-release

由表2 可見，萃取物的不同對DPPH 自由基清除率、還原力、總抗氧化活性、NO 釋放量有極顯著影響（P＜0.01）。表3 雙變量相關(guān)性分析顯示，總黃酮、總多酚含量與DPPH 自由基清除率、還原力極強正相關(guān)，相關(guān)性極顯著（P＜0.01）；與總抗氧化活性、NO 釋放量弱相關(guān)，相關(guān)性均不顯著（P＞0.05）。由表4 雙變量相關(guān)性分析顯示，總抗氧化活性與NO 釋放量負相關(guān)，相關(guān)性極顯著（P＜0.01）。綜上分析，總黃酮、總多酚含量與三葉青葉不同萃取物的抗氧化活性存在一定關(guān)聯(lián)，與抗炎活性關(guān)聯(lián)性不強，總抗氧化活性與NO 釋放量負相關(guān)，可能受同一類活性物質(zhì)的影響。

2.5 三葉青葉中黃酮和多酚類成分的同時測定

從相關(guān)性分析結(jié)果可以看出，三葉青葉中所含的總黃酮、總多酚含量對三葉青葉不同萃取物的抗氧化能力影響顯著。選擇總黃酮、總多酚含量較高的乙酸乙酯、正丁醇萃取物，利用HPLC 測定其中的蘆丁、咖啡酸、葒草苷、新綠原酸、綠原酸含量，結(jié)果見圖9 和表5。由圖9 可見，三葉青葉乙酸乙酯萃取物與正丁醇萃取物均含有蘆丁、葒草苷、咖啡酸、新綠原酸和綠原酸，但部分成分含量存在較大差異。由表5 可知，蘆丁、咖啡酸、綠原酸的含量差異極顯著（P＜0.01）。結(jié)合已知成分絕對含量與數(shù)據(jù)分析結(jié)果，推測蘆丁、咖啡酸、綠原酸可能是三葉青葉不同萃取物抗氧化作用存在差異的成分群之一。

圖9 三葉青葉乙酸乙酯、正丁醇萃取物的HPLC 分析Fig. 9 HPLC analysis on extracts from leaves of T. hemsleyanum by ethyl acetate and n-butanol

表5 三葉青葉乙酸乙酯、正丁醇萃取物的成分含量Tab. 5 Composition and content of extracts from leaves of T. hemsleyanum by ethyl acetate and water saturated n-butanol

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

三葉青是我國特有的林下珍稀藥用植物，生長于我國廣大南方地區(qū)的高山幽谷之間，具有抗腫瘤、消炎、免疫調(diào)節(jié)等功效，其塊根在民間被廣泛使用。三葉青葉（或全株）在民間也供藥用，福建、浙江地區(qū)傳統(tǒng)習用三葉青鮮草，習稱“一粒珠”[15]?！逗Ｄ现参镏尽分杏涊d三葉青全株可用于白喉、風濕性腰痛等，《臺灣藥用植物圖鑒》中記載其鮮葉搗碎可以治皮膚病，且三葉青葉不僅采收加工方便、價格優(yōu)惠，而且產(chǎn)量相較于地下塊根更高，因此，開展三葉青葉的綜合利用開發(fā)研究具有重要意義。

自由基能夠降低細胞內(nèi)的抗氧化酶活性[16]，造成活性氧的濃度增加，促進腫瘤的發(fā)生，而慢性炎癥在癌癥的發(fā)展中同樣起促進作用，因此自由基、炎癥及腫瘤三者之間存在一定關(guān)聯(lián)性。何文等[17]對三葉青塊根的不同萃取物進行了體外抗氧化研究，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯萃取物的抗氧化能力最強，且與總黃酮、總多酚含量顯著相關(guān)。故本文采用DPPH、還原力、總抗氧化活性試驗評價了三葉青葉不同萃取物的體外抗氧化活性，并采用LPS 誘導的細胞炎癥模型評價了不同萃取物的抗炎活性，發(fā)現(xiàn)其抗氧化能力與總黃酮、總多酚含量顯著相關(guān)，而抗炎能力與總黃酮、總多酚含量無明顯相關(guān)性，可以初步推斷影響三葉青葉抗氧化能力、抗炎能力的物質(zhì)基礎(chǔ)并不相同。后續(xù)可以從三葉青葉乙酸乙酯萃取物含量高的單體化合物中進一步篩選強抗氧化活性的物質(zhì)，而具備抗炎活性的單體化合物還有待進一步探究。

3.2 結(jié)論

以上研究結(jié)果表明，三葉青葉的四種萃取物均含有黃酮類和酚類化合物，且均具有一定的抗氧化、抗炎活性，其中，乙酸乙酯萃取物的抗氧化活性最強，石油醚萃取物的抗炎活性最強，這與李紅銳等[18]對蒙自蹄蓋蕨Athyriummengtzeense醇提物的不同萃取物的體外抗氧化、抗炎活性評價結(jié)果相符。相關(guān)性分析證明，三葉青葉四種萃取物的清除自由基能力、還原力與總黃酮、總多酚含量顯著相關(guān)，說明酚類和黃酮類物質(zhì)可能是其抗氧化作用的物質(zhì)基礎(chǔ)?？偪寡趸芰εcNO 釋放量顯著相關(guān)，說明可能受三葉青葉中同一類活性物質(zhì)的影響。HPLC分析結(jié)果表明，蘆丁、咖啡酸、綠原酸可能是三葉青葉不同萃取物抗氧化作用存在差異的成分群之一。后續(xù)可考慮從三葉青葉乙酸乙酯和石油醚萃取物分離純化出有關(guān)單體化合物，進而篩選出其具體的抗氧化、抗炎活性成分，為三葉青葉的進一步開發(fā)利用提供一定的理論基礎(chǔ)。