周一帆 李 軼 王鐵成 梁 冰 李 閻紀(jì) 雪 馮 娜 孫 洋

犬腸道病原體監(jiān)測(cè)是為了掌握從民間新引進(jìn)犬的常見細(xì)菌、病毒和寄生蟲的感染情況，為警犬疫病防控提供指導(dǎo)。本試驗(yàn)采集了哈爾濱某警犬基地初訓(xùn)警犬的糞便或肛拭子，采用PCR 及熒光定量PCR 方法進(jìn)行病原菌和病毒檢測(cè)，對(duì)陽性樣品進(jìn)行病原分離鑒定；使用飽和食鹽水漂浮法和水洗沉淀法進(jìn)行寄生蟲卵檢測(cè)，并對(duì)藥物驅(qū)蟲效果進(jìn)行復(fù)檢評(píng)估。結(jié)果顯示：犬細(xì)小病毒、犬瘟熱病毒、志賀氏菌、沙門氏菌以及巴氏桿菌均為陰性，產(chǎn)氣莢膜梭菌檢出率為7.59%，寄生蟲感染率高達(dá)94.12%，驅(qū)蟲后感染率下降至33.3%。說明此次初訓(xùn)警犬感染常見病原菌及病毒的風(fēng)險(xiǎn)較低，寄生蟲感染情況較為嚴(yán)重，應(yīng)定期驅(qū)蟲并加強(qiáng)衛(wèi)生管理，防范人獸共患寄生蟲病的傳播。

警犬因其嗅覺敏銳、視野寬廣、耐力持久，在邊境管控、執(zhí)法辦案、反恐維穩(wěn)、預(yù)警防范等一系列警務(wù)活動(dòng)中具有不可替代的作用。由于警犬工作環(huán)境和內(nèi)容的復(fù)雜多變，且經(jīng)?？绲貐^(qū)執(zhí)行任務(wù)，易受疲勞等應(yīng)激因素的影響，一旦發(fā)病將直接影響其正常工作。對(duì)于疫病應(yīng)以預(yù)防為主，只有有效降低發(fā)病率才能最大程度發(fā)揮警犬的作用。篩查警犬腸道感染常見病原，不僅有助于警犬常見疾病的預(yù)防，對(duì)保障警犬健康和正常工作也有重要意義。另一方面，由于警犬與人類密切接觸，了解警犬?dāng)y帶病原的種類，可降低人畜共患病的風(fēng)險(xiǎn)。本研究對(duì)初訓(xùn)警犬腸道內(nèi)常見病原進(jìn)行篩查，監(jiān)測(cè)常見病毒、病原菌和寄生蟲的感染情況，為警犬疫源疫病防控提供指導(dǎo)。

一、材料與方法

（一）樣品來源

哈爾濱某警犬基地2021年7 月份從天津、遼寧等地民間犬場(chǎng)引進(jìn)一批初訓(xùn)警犬，用于補(bǔ)充犬源不足，年齡1.5～2 歲，犬種為馬里努阿犬、拉布拉多犬、德國牧羊犬和史賓格犬。采集樣品145 份，其中糞便123 份，肛拭子22 份，采樣管置于冷藏箱，加冰袋24h 內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

（二）主要儀器

正置顯微鏡（LEICA DM2500），購自德國徠卡公司；生物安全柜（1300A2），購自美國Thermo Fisher公司；PCR 擴(kuò)增儀（ETC-811），購自北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；生化培養(yǎng)箱（LRH-70），購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；搖床（HNY-100B），購自天津市歐諾儀器儀表有限公司；水平電泳儀（JY600-PJ），購自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。

（三）主要試劑

腦心浸液肉湯、液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（FTG）、胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸瓊脂基礎(chǔ)（TSC）及其添加成分和厭氧袋，均購自青島海博生物技術(shù)有限公司；2×Taq Master Mix，購自康為試劑生物科技有限公司；DL-2000Marker，購自TaKaRa 公司；DNA提取試劑盒，購自Axygen 公司、Pfu高保真酶、Pfu Buffer 和dNTP，購自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；病毒RNA 提取試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司。引物由吉林省庫美生物科技有限公司合成，探針由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列信息見表1。

表1 本研究所用引物及探針序列

（四）試驗(yàn)方法

1.樣品處理

糞便樣品挑取0.2 g 于1.5mL 離心管中，加入1mL 無菌生理鹽水，肛拭子樣品置于加有1 mL 無菌生理鹽水的1.5mL 離心管中，渦旋混勻，12000×g 離心2min，吸取500μL 上清液用于病毒檢測(cè)。剩余樣品重懸，分別吸取20μL 糞便懸液進(jìn)行腦心肉湯需氧培養(yǎng)和FTG 厭氧培養(yǎng)，用于病原菌檢測(cè)。每份糞便樣品取2g 于50mL 離心管中，每組含10 份糞便樣品，加入少量清水將樣品混勻，平均分為兩份，用于寄生蟲卵的檢測(cè)。

2.病毒的檢測(cè)

（1）犬細(xì)小病毒檢測(cè)

吸取140μL 糞便上清液按照Axygen DNA 提取試劑盒說明書提取糞便樣品DNA。使用犬細(xì)小病毒通用引物和VP2 全長引物對(duì)樣品檢測(cè)。PCR 擴(kuò)增體系（50μL）：Pfu buffer 10μL；2.5mM dNTP 4μL；上下游引物各2μL；Pfu 高保真酶1μL；DNA 模板 5μL；ddH2O 26μL。PCR 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2min，95℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，共35 個(gè)循環(huán)，72℃再延伸7min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)記錄分析。陽性對(duì)照為本實(shí)驗(yàn)室保存的細(xì)胞毒樣品，陰性對(duì)照為去離子水。

（2）犬瘟熱病毒檢測(cè)

吸取140μL 糞便上清液按照天根病毒RNA 提取試劑盒說明書提取糞便樣品RNA 模板。實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 法檢測(cè)犬瘟熱病毒，RT-PCR 擴(kuò)增體系（25μL）：2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ 12.5μL；5U/μL Ex Taq HS 0.5μL；PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ 0.5μL；10μmol/L 上下游引物各0.5μL；10μmol/L 探針1μL；RNA 模板 5μL；RNase-Free ddH2O 4.5μL。RT-PCR 擴(kuò)增程序：42℃ 5min；95℃ 10s；95℃ 5s、60℃ 31s，40 個(gè)循環(huán)。檢測(cè)結(jié)束后，根據(jù)收集的熒光曲線和Cq 值判定結(jié)果。陰性對(duì)照為去離子水，無Cq 值且無典型擴(kuò)增曲線；陽性對(duì)照為本實(shí)驗(yàn)室保存犬瘟熱細(xì)胞毒，Cq 值在15 ～35之間，且存在典型擴(kuò)增曲線。

3.病原菌的檢測(cè)

（1）模板制備

參照參考文獻(xiàn)進(jìn)行模板DNA 的制備。

（2）目的菌的檢測(cè)

參照參考文獻(xiàn)，用PCR 方法檢測(cè)常見病原菌。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)記錄分析。陽性對(duì)照為本實(shí)驗(yàn)室保存的陽性分離株，陰性對(duì)照為去離子水。

（3）產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離鑒定及分型

將PCR 結(jié)果呈陽性的FTG 增菌液接種于TSC 培養(yǎng)基，（36±1）℃厭氧培養(yǎng)16～18h，觀察菌落形態(tài)，挑取疑似單菌落（中心黑色的單菌落）于TSC培養(yǎng)基純化培養(yǎng)。對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株進(jìn)行cpa、cpb、etx、iap、cpe、cpb2 和NetB 毒素鑒定。引物序列見表1。

4.寄生蟲的檢測(cè)

（1）飽和食鹽水漂浮法

向裝有糞便樣品的50mL 離心管中加入40mL 飽和食鹽水，充分混勻，兩層紗布過濾到干凈的50mL 離心管中，3000×g 離心8min，加飽和食鹽水至瓶口形成凸起液面，瓶口蓋一載玻片靜置15min 左右，迅速上提翻轉(zhuǎn)，蓋上蓋玻片，低倍顯微鏡（100×）檢查蟲卵。

（2）水洗沉淀法

向糞便平行檢測(cè)樣品中加入40mL 清水充分?jǐn)噭?，再用雙層紗布濾過到干凈的50mL 離心管中，1000×g 離心10min，棄去上清液，加水重懸，離心沉淀，重復(fù)操作2～3 次，最后傾去上清液，吸取沉淀物于載玻片上，蓋上蓋玻片，低倍顯微鏡（100×）檢查蟲卵。

（3）驅(qū)蟲及復(fù)檢

對(duì)采樣犬群按體重每10kg 口服復(fù)方非班太爾片1片，進(jìn)行驅(qū)蟲，2 個(gè)月后對(duì)犬群按每體重25mg/kg口服芬苯達(dá)唑進(jìn)行第2 次驅(qū)蟲。半月后選取初篩嚴(yán)重感染寄生蟲的3組犬進(jìn)行寄生蟲復(fù)檢，后續(xù)對(duì)三組（n=22）初訓(xùn)警犬進(jìn)行單犬復(fù)檢。

二、結(jié)果

（一）病毒篩查結(jié)果

犬細(xì)小病毒（見圖1）和犬瘟熱病毒（見圖2）核酸檢測(cè)結(jié)果均為陰性。該批初訓(xùn)警犬未感染這兩種病毒。

圖1 部分樣品犬細(xì)小病毒通用引物PCR 結(jié)果M1. DL2000；1-4. 警犬糞便樣品DNA；+. 陽性對(duì)照；-. 陰性對(duì)照

圖2 犬瘟熱病毒核酸檢測(cè)結(jié)果紅線：陽性對(duì)照；藍(lán)線：陰性對(duì)照；綠線：犬糞便樣品

（二）病原菌篩查結(jié)果

未檢測(cè)到巴氏桿菌、沙門氏菌和志賀氏菌，產(chǎn)氣莢膜梭菌的陽性率為7.59%（11/145）。僅在德國牧羊犬和馬里努阿犬中檢出，檢出率分別為15.09%（8/53）和4.48%（3/67）。5 份陽性增菌液中分離出A 型產(chǎn)氣莢膜梭菌（見圖3）。

圖3 部分樣品產(chǎn)氣莢膜梭菌擴(kuò)增結(jié)果M2. DL2000；1-6. 部分樣品；+. A 型標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC13124；-. 陰性對(duì)照

（三）寄生蟲篩查結(jié)果

1.寄生蟲卵感染種類

17 組糞便混樣中共檢出4 種寄生蟲蟲卵，如圖4（A-D）所示，分別為蛔蟲卵、鞭蟲卵、復(fù)孔絳蟲卵和吸蟲卵，以蛔蟲為優(yōu)勢(shì)蟲種。對(duì)兩種常規(guī)方法的結(jié)果進(jìn)行比較（見表2）發(fā)現(xiàn)，用漂浮法檢查蛔蟲卵和鞭蟲卵的效果較好，沉淀法檢查吸蟲卵和絳蟲卵的效果較好。

圖4 警犬腸道寄生蟲卵顯微鏡觀察結(jié)果（100×）A：吸蟲卵；B：復(fù)孔絳蟲卵；C：蛔蟲卵；D：鞭蟲卵；E：復(fù)合感染；F：復(fù)合感染

表2 兩種方法檢測(cè)寄生蟲感染情況的比較

2.寄生蟲感染情況

16 組檢出感染性蟲卵，總體感染率為94.12%?；紫x、吸蟲、鞭蟲和復(fù)孔絳蟲的感染率為分別為64.71%、23.53%、5.88% 和5.88%。最常見的是復(fù)合感染，達(dá)52.94%（見圖4 E、F）。

3.寄生蟲復(fù)檢情況

其中兩組驅(qū)蟲效果明顯，感染率下降為33.33%。單犬復(fù)檢寄生蟲的感染率為13.64%（3/22），其中3頭犬仍存在明顯的寄生蟲感染，以蛔蟲為主。

三、討論

警犬調(diào)運(yùn)頻繁、犬源補(bǔ)充渠道增加、初訓(xùn)犬和參訓(xùn)人員接觸密集，都可導(dǎo)致警犬罹患傳染性疾病的風(fēng)險(xiǎn)增大。犬細(xì)小病毒和犬瘟熱病毒在犬群中傳播迅速，較難診治，預(yù)防困難且致死率高。近些年疫苗的使用，較好地控制了這些病毒傳染病的發(fā)生，本次糞便樣品也未檢測(cè)出這兩類病毒。產(chǎn)氣莢膜梭菌是引起犬猝死癥最主要的病原菌。本次初訓(xùn)警犬分離獲得的產(chǎn)氣莢膜梭菌屬于A 型產(chǎn)氣莢膜梭菌，僅在德國牧羊犬和馬里努阿犬中檢出。這一現(xiàn)象出現(xiàn)可能與犬的品種、相關(guān)訓(xùn)練活動(dòng)及其活動(dòng)范圍有關(guān)。警犬在訓(xùn)練過程中經(jīng)常從地上銜取物品也是從環(huán)境中感染產(chǎn)氣莢膜梭菌的因素之一。有研究表明，犬的品種與消化功能有關(guān)，體型較大的犬通常消化食物的能力較差，從而腸道菌群有所差異。

本次試驗(yàn)蛔蟲檢出率最高，這一結(jié)果與修福曉的調(diào)查結(jié)果相近。天津市警犬腸道檢出了復(fù)孔絳蟲和蛔蟲，與本次結(jié)果一致，但感染率遠(yuǎn)低于本次結(jié)果，推測(cè)原因主要有兩點(diǎn)：一是年齡，本次采樣警犬均為1.5～2 歲青年犬，有研究表明隨著犬年齡的增長，腸道內(nèi)寄生蟲豐度降低，患病率也降低；二是警犬基地犬繁育方式的改變，以前警犬是自繁自養(yǎng)，現(xiàn)在外購犬的比例大大增加，本次檢測(cè)對(duì)象均為外購犬，這些初訓(xùn)犬購自各地犬場(chǎng)，難以保證犬場(chǎng)對(duì)犬的衛(wèi)生防疫管理。此次初訓(xùn)警犬尚未表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，表明當(dāng)前為帶蟲狀態(tài)，一旦機(jī)體免疫力下降，腸道內(nèi)蟲體可奪取宿主營養(yǎng)，其他機(jī)會(huì)致病菌引起感染從而使發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)大大增加。寄生蟲卵抗逆性強(qiáng)，可以在環(huán)境中存活很長時(shí)間，有必要進(jìn)一步加強(qiáng)犬只驅(qū)蟲和衛(wèi)生管理。被測(cè)犬服用2 次驅(qū)蟲藥后，感染情況明顯下降，部分初訓(xùn)警犬驅(qū)蟲效果不明顯可能與其感染的寄生蟲存在耐藥情況有關(guān)。

綜上所述，被測(cè)初訓(xùn)警犬僅檢出A 型產(chǎn)氣莢膜梭菌和腸道寄生蟲卵，危害更為嚴(yán)重的病毒和細(xì)菌性病原體未檢出，表明警犬訓(xùn)養(yǎng)相關(guān)工作人員對(duì)于犬舍以及警犬的健康防控基本達(dá)到相關(guān)要求。警犬技術(shù)的特殊性加大了警犬疫病防治難度，相關(guān)從業(yè)人員要持續(xù)對(duì)警犬加強(qiáng)關(guān)注，對(duì)其居住和訓(xùn)練場(chǎng)所定期消殺，做好糞便無害化處理，同時(shí)也要注意自身防護(hù)。

（本文照片由作者提供）