吳福海,陳孟毅,王曉明,王春林,孫明月,邱珊珊,周佳駿,秦祥宇,沈浪濤,*

(1.原子高科股份有限公司,北京 102413;2.國家原子能機構(gòu)核技術(shù)(放射性藥物工程轉(zhuǎn)化)研發(fā)中心,北京 102413;3.中核集團放射性藥物工程技術(shù)研究中心,北京 102413)

鎵[68Ga]是一種正電子(β+)發(fā)射體,其半衰期約為68 min,以89%的正電子分支比衰變?yōu)榉€(wěn)定的鋅[68Zn][1]。2016年6月至今已有多種鎵[68Ga]藥物經(jīng)美國FDA或歐洲EMA批準上市,如用于神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤PET顯像診斷的68Ga-DOTATATE、68Ga-DOTATOC[2]以及用于前列腺腫瘤PET顯像診斷的68Ga-PSMA-11[3],但國內(nèi)目前尚無批準上市的鎵[68Ga]藥物,僅有部分醫(yī)院開展了相關研究[4]。隨著鎵[68Ga]藥物的研發(fā)和應用,對滿足質(zhì)量標準的鎵[68Ga]核素的需求也將日益增加。

鎵[68Ga]可通過68Ge/68Ga發(fā)生器淋洗獲得,也可由加速器通過68Zn(p,n)68Ga核反應制備得到,目前主要獲得途徑是68Ge/68Ga發(fā)生器。68Ge/68Ga發(fā)生器商品化程度高,加之其尺寸小,具有自屏蔽功能,使用方便,是目前氯化鎵[68Ga]溶液的主要來源,淋洗出的鎵[68Ga]以氯化鎵[68Ga]溶液的形式存在,溶液中存在一定濃度的鹽酸。商品化的幾種68Ge/68Ga發(fā)生器由于分離材料和工藝路線的差異,淋洗出的氯化鎵[68Ga]溶液中的鹽酸濃度不同,一般在0.01～0.6 mol/L之間,淋洗體積一般為1～7 mL[5-8]。盡管氯化鎵[68Ga]溶液的來源及規(guī)格有多種,但作為關鍵原料,其質(zhì)量應滿足一定要求。若氯化鎵[68Ga]溶液中存在的雜質(zhì)不加以控制,既可能影響鎵[68Ga]的標記率,也可能引入到標記后的放射性藥物中后,導致診斷影像結(jié)果失真[9-11]。申請上市的鎵[68Ga]藥物,必須使用GMP級68Ge/68Ga發(fā)生器。目前為止,國際上已批準了3個GMP級68Ge/68Ga發(fā)生器,分別是Eckert &Ziegler公司、IRE Elit公司和ITG公司產(chǎn)品。我國尚無GMP級68Ge/68Ga發(fā)生器上市。因此,有必要研究建立源自藥用的68Ge/68Ga發(fā)生器的氯化鎵[68Ga]溶液雜質(zhì)檢測的分析方法及相應的質(zhì)量標準,確保其質(zhì)量可控,以保障我國未來鎵[68Ga]上市藥物的安全性和有效性。

氯化鎵[68Ga]溶液的雜質(zhì)分為放射化學雜質(zhì)、元素雜質(zhì)及放射性核素雜質(zhì)。氯化鎵[68Ga]溶液的放射化學雜質(zhì)可能有以非離子形式存在的鎵[68Ga],如鎵[68Ga]膠體等;元素雜質(zhì)來源于發(fā)生器本身或淋洗操作的環(huán)境,可能會有多種;放射性核素雜質(zhì)可能有其母體核素鍺[68Ge]等[12]?！吨袊幍洹?2020年版)[13]未收錄氯化鎵[68Ga]溶液?！稓W洲藥典》(EP10.0)[14]收錄了用于放射性標記的氯化鎵[68Ga]溶液,給出了其質(zhì)量標準和相應的分析方法。采用EP10.0收錄的放射性薄層色譜法檢測樣品,發(fā)現(xiàn)色譜峰峰型差,Rf值和放射化學純度難以穩(wěn)定地滿足質(zhì)量標準。由于68Ge/68Ga發(fā)生器淋洗出的氯化鎵[68Ga]溶液體積小,而EP10.0收錄的原子吸收光譜法分析進樣量大,且每次只能檢測1種元素,結(jié)合ICH《Q3D(R1):元素雜質(zhì)指導原則》[15],根據(jù)注射劑的元素限度值(PDE),需控制的風險較大的元素雜質(zhì)不止鐵、鋅兩種。因此,有必要選用更合適的元素雜質(zhì)檢測方法。

本文擬對來自68Ge/68Ga發(fā)生器的氯化鎵[68Ga]溶液雜質(zhì)進行研究,建立其放射化學雜質(zhì)、元素雜質(zhì)及放射性核素雜質(zhì)的檢測方法,基于ICH及EANM等分析方法驗證指導原則[16,17]對建立的方法進行驗證,為我國建立發(fā)生器來源的氯化鎵[68Ga]溶液質(zhì)量標準奠定基礎。

1 實驗方法

1.1 主要試劑與儀器

氯化鎵[68Ga]溶液由比利時IRE Elit68Ge/68Ga發(fā)生器淋洗得到。該發(fā)生器的生產(chǎn)日期為2020年10月,有效期為1年或淋洗450次,初始活度為50 mCi,單次淋洗出的氯化鎵[68Ga]溶液為1.1 mL。本工作于2020年12月—2021年5月使用時發(fā)生器仍在有效期內(nèi),單次淋洗出的活度約為20～35 mCi。

二乙烯三胺五乙酸(DTPA,分析純)、乙腈(色譜純)、三氟乙酸(TFA,分析純),國藥集團化學試劑有限公司;iTLC-SG玻璃纖維硅膠板,安捷倫科技有限公司;多元素混合標準溶液(10 μg/mL,含Ag、Al、As、Ba、Be、Ca、Cd、Co、Cr、Cs、Cu、Fe、Ga、K、Li、Mg、Mn、Na、Ni、Pb、Rb、Se、Sr、Tl、U、V、Zn)、Hg標準溶液(10 μg/mL),安捷倫科技有限公司;Sb標準溶液(100 μg/mL),中國計量科學研究院。使用前用2%硝酸溶液將上述標準溶液混合稀釋至0、5、10、20、50 ng/mL。混合內(nèi)標溶液(濃度10 μg/mL,含Bi、Ge、In、Sc、Tb、Y、6Li),安捷倫科技有限公司,使用前用2%硝酸溶液將其稀釋至1 μg/mL。

AR2000放射性薄層色譜儀(Radio-TLC),Bioscan公司;7800電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS),安捷倫科技有限公司;DSPEC高純鍺(HPGe)γ譜儀,ORTEC公司;CRC-55tW活度計,Capintec公司;XSE205DU電子天平、S210酸度計,梅特勒托利多公司。

1.2 放射化學純度檢測

氯化鎵[68Ga]溶液放射化學純度檢測中的關鍵影響因素有:固定相種類、流動相種類、樣品溶液狀態(tài)等。有效分離主成分和放射化學雜質(zhì)是方法研究的重點。在方法建立時需了解樣品的化學性質(zhì),如樣品在不同酸度下的價態(tài)變化、絡合或沉淀等行為,在流動相的作用下,通過合理控制其在固定相上的吸附與分配,實現(xiàn)各組分間的分離[18-19]。具體方法如下:1) 以iTLC-SG為固定相,分別以甲醇-1 mol/L乙酸銨(甲醇和乙酸銨體積比分別為1∶1、3∶1、4∶1)、4%TFA水溶液、0.1 mol/L檸檬酸鈉溶液(pH=5.0)為流動相,采用68Ga-DTPA作系統(tǒng)適用性溶液,采用薄層色譜法檢測氯化鎵[68Ga]溶液、系統(tǒng)適用性溶液空白及系統(tǒng)適用性溶液的放射化學純度,考察流動相對檢測結(jié)果的影響;2) 以iTLC-SG為固定相,以甲醇-1 mol/L乙酸銨(體積比為1∶1)為流動相,用鹽酸調(diào)節(jié)乙酸銨的pH值分別至1.35、2.35、2.82、3.00、3.70、4.99、7.49,采用68Ga-DTPA作系統(tǒng)適用性溶液,采用相同方法檢測氯化鎵[68Ga]溶液、系統(tǒng)適用性溶液空白及系統(tǒng)適用性溶液的放射化學純度,考察流動相pH值對檢測結(jié)果的影響;3) 以iTLC-SG為固定相,分別以甲醇-1 mol/L乙酸銨(體積比為1∶1)和4%TFA水溶液為流動相,分別采用68Ga-DTPA和檸檬酸鎵[68Ga]溶液作系統(tǒng)適用性溶液,采用相同方法檢測氯化鎵[68Ga]溶液、68Ga-DTPA系統(tǒng)適用性溶液空白、68Ga-DTPA和檸檬酸鎵[68Ga]溶液的放射化學純度,考察系統(tǒng)適用性溶液對檢測結(jié)果的影響。

方法優(yōu)化并確定后,對方法的系統(tǒng)適用性與分離度、線性、定量限、精密度、耐用性進行驗證。取適量氯化鎵[68Ga]溶液,對樣品平行檢測6次,記錄Rf值、放射化學純度、分離度,考察系統(tǒng)適用性與分離度;取0.74×107～7.4×107Bq/mL的氯化鎵[68Ga]溶液,考察其計數(shù)率(min-1)與放射性濃度的線性關系;取適量氯化鎵[68Ga]溶液,將樣品逐級稀釋后進行檢測,每個樣品重復檢測6次,考察定量限;取適量氯化鎵[68Ga]溶液,通過6次重復性實驗和6次中間精密度實驗考察樣品的精密度;取適量氯化鎵[68Ga]溶液,通過對點樣量、流動相pH值、固定相批次等條件進行微小調(diào)整后,進行6次重復性檢測,考察方法的耐用性。

1.3 元素雜質(zhì)檢測

淋洗出的氯化鎵[68Ga]溶液放置48 h至無放射性后,取適量用2%硝酸溶液稀釋50倍后直接進樣進行元素雜質(zhì)檢測。操作參數(shù)如下:ICP-MS射頻功率1 500 W,等離子氣流速15.0 L/min、輔助氣流速0 L/min、載氣流速1.2 L/min,采樣深度8.0 mm、采樣錐孔徑1.0 mm、截取錐孔徑0.4mm,霧化室溫度2 ℃,蠕動泵轉(zhuǎn)速0.12 r/s。采集模式為“He”模式,分析室真空(動態(tài))為1×10-5～2×10-5Torr。檢測參數(shù)如下:檢測方式為跳峰式,數(shù)據(jù)采集重復次數(shù)為3,每峰采樣點為3,采樣時間為100 s,試液提升速率為1.0 mL/min。采用內(nèi)標法依次檢測儀器空白(2%硝酸溶液)、多元素系列標準溶液、樣品空白和供試品,供試品平行檢測3次,計算3次檢測平均值。根據(jù)稀釋倍數(shù)計算原始樣品中各待測元素的含量。

方法的專屬性考察:取空白溶液、多元素系列標準溶液、供試品溶液以及加標供試品溶液分別進樣檢測,觀察以上樣品是否干擾待測元素的檢測。方法的線性考察:配制不同濃度的多元素系列標準溶液后進樣分析,考察各待測元素濃度與信號響應值的線性關系。

方法的檢測限與定量限考察:將多元素系列標準溶液逐級稀釋后檢測,考察各待測元素的檢測限與定量限,其中檢測限溶液平行檢測13次,定量限溶液平行檢測6次。

方法的精密度考察:取供試品溶液,重復檢測6次,考察重復性;取供試品溶液,換不同操作人員在不同時間重復檢測6次,考察中間精密度。對于供試品中含量低于定量限的元素,以標準溶液進行評估。

方法的準確度考察:取供試品溶液,加入含供試品溶液元素濃度80%、100%、120%的標準溶液,每個加標濃度下平行制備3份,檢測加標樣品的濃度,計算各元素的回收率。方法的耐用性考察:取供試品溶液,改變霧化氣流速和試液提升速率后各進行6次重復性檢測,考察各元素組內(nèi)信號響應值和組間響應值的相對標準偏差(RSD)。

1.4 放射性核純度檢測

參考《高純鍺γ能譜分析通用方法》(GB/T 11713—2015)[20],進行氯化鎵[68Ga]溶液放射性核純度檢測。具體方法為:取氯化鎵[68Ga]溶液適量,校正衰變時間后進行全譜測量分析,檢測γ雜質(zhì)活度;將氯化鎵[68Ga]溶液樣品放置24 h后,再次進行全譜測量分析,檢測鍺[68Ge]和其他γ雜質(zhì)活度。

方法的專屬性考察:在氯化鎵[68Ga]溶液中加入約3.7×104Bq的鋇 [133Ba]和鈷[60Co]雜質(zhì)核素后,采用上述方法檢測其初始放射性核純度,考察方法的專屬性。方法的線性考察:取不同體積放射性濃度約3.7×106Bq/mL的氯化鎵[68Ga]溶液,考察取樣體積和測試活度的線性關系。

方法的檢測限考察:用高純鍺γ譜儀檢測空白樣品(純化水)的γ譜,按照式(1)計算鎵[68Ga]活度檢測限,計數(shù)區(qū)域為峰位3倍半高寬。

(1)

其中:t為測量時間;Nb為本底峰位計數(shù);α為特征γ射線的分支比;ε為探測效率。

方法的準確度考察:取約7.4×104Bq的氯化鎵[68Ga]溶液先用高純鍺γ譜儀檢測活度,然后將其送至國防科技工業(yè)一級計量站標定樣品活度,比較檢測結(jié)果的差異。

方法的精密度考察:取約7.4×104Bq氯化鎵[68Ga]溶液,檢測其樣品初始時和放置24 h后的放射性核純度,各重復6次,考察方法的精密度。

方法的耐用性考察:取約3.7×104Bq氯化鎵[68Ga]溶液,檢測放射性核純度,更換不同尺寸的測試支架重復檢測,比較檢測結(jié)果。

1.5 氯化鎵[68Ga]溶液雜質(zhì)檢測

采用驗證后的各檢測方法,檢測氯化鎵[68Ga]溶液的放射化學純度、元素雜質(zhì)、放射性核純度,并分析其雜質(zhì)情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 放射化學純度檢測

1) 流動相選擇

流動相對檢測結(jié)果的影響列于表1。由表1可見:采用甲醇-1 mol/L乙酸銨為流動相時,系統(tǒng)適用性溶液峰型差,不滿足要求,后續(xù)可通過改變流動相pH值進一步優(yōu)化;采用4%TFA溶液和0.1 mol/L檸檬酸鈉溶液為流動相時,供試品和系統(tǒng)適用性溶液峰型尚可,但二者Rf值一致,不滿足系統(tǒng)適用性要求。

表1 流動相對檢測結(jié)果的影響Table 1 Influence of mobile phase on detection result

2) 流動相pH值

流動相pH值對檢測結(jié)果的影響列于表2。由表2可見,乙酸銨pH值過低時,供試品出現(xiàn)雙峰或峰型較差,不滿足要求,乙酸銨pH≥2.82時,供試品峰型較好,但pH≥3.7時,系統(tǒng)適用性溶液峰型變差。因此較佳的條件為乙酸銨pH值約為3.0。

表2 乙酸銨酸度對檢測結(jié)果的影響Table 2 Influence of ammonium acetate on detection result

3) 系統(tǒng)適用性溶液

系統(tǒng)適用性溶液檢測結(jié)果列于表3。由表3可見,采用甲醇-1 mol/L乙酸銨(體積比1∶1)為流動相,系統(tǒng)適用性溶液為檸檬酸鎵[68Ga]時,供試品和系統(tǒng)適用性溶液的Rf值滿足分離度要求,但檸檬酸鎵[68Ga]和68Ga-DTPA峰型差,不符合要求。采用4%TFA溶液為流動相時,兩種系統(tǒng)適用性溶液Rf值均與供試品一致,均不符合要求。

表3 系統(tǒng)適用性溶液對檢測結(jié)果的影響Table 3 Influence of system suitability solution on detection result

4) 放射化學純度檢測方法確定

通過以上優(yōu)化確定氯化鎵[68Ga]溶液放射化學純度檢測的方法如下:以iTLC-SG為固定相、甲醇-1 mol/L乙酸銨為流動相,二者體積比為1∶1,其中乙酸銨用鹽酸將pH值調(diào)至2.8,氯化鎵[68Ga]溶液體系為含10.3 g/L的鹽酸溶液。系統(tǒng)適用性溶液采用68Ga-DTPA。

5) 放射化學純度檢測方法驗證

放射化學純度檢測方法的驗證結(jié)果列于表4。由表4可見:系統(tǒng)適用性和分離度符合要求;氯化鎵[68Ga]溶液放射化學純度檢測定量限為3.7×105Bq/mL;計數(shù)率與放射性濃度呈良好的線性關系;精密度、耐用性良好。驗證結(jié)果均滿足中國藥典及ICH指導原則對分析方法驗證的要求。

表4 放射化學純度檢測方法驗證結(jié)果Table 4 Verification result of radiochemical purity detection method

2.2 元素雜質(zhì)檢測方法驗證

元素雜質(zhì)檢測方法驗證結(jié)果列于表5。由表5可見:本方法專屬性良好;在線性范圍內(nèi)各元素線性相關系數(shù)R均大于0.99;精密度實驗中,供試品和標準溶液的重復性及中間精密度檢測結(jié)果均滿足組內(nèi)RSD不大于15%、組間RSD不大于32%的要求;準確度檢測中各元素平均回收率在88.5%～103.4%之間;耐用性試驗中,檢測結(jié)果的RSD符合可接受標準。驗證的各項結(jié)果均在可接受范圍內(nèi),證明該方法適用于氯化鎵[68Ga]溶液元素雜質(zhì)的檢測。

表5 元素雜質(zhì)檢測方法驗證結(jié)果Table 5 Verification results of elemental impurity detection method

2.3 放射性核純度檢測方法驗證

放射性核純度檢測方法驗證結(jié)果列于表6。由表6可見,在有少量核素干擾時不影響檢測結(jié)果,方法專屬性良好;取樣體積與檢測活度之間有良好的線性關系;68Ga的檢測限滿足可接受標準;重復性檢測結(jié)果表明,方法精密度良好;樣品檢測活度與標定活度的相對偏差為4.6%,準確度滿足可接受標準;采用不同支架不影響檢測結(jié)果,方法有一定的耐用性,驗證各項結(jié)果均在可接受范圍內(nèi)。

表6 放射性核純度檢測方法驗證結(jié)果Table 6 Verification results of radionuclide purity detection method

2.4 氯化鎵[68Ga]溶液雜質(zhì)檢測

采用上文所建立的方法對3批氯化鎵[68Ga]溶液的雜質(zhì)進行檢測,結(jié)果列于表7,某批次樣品的放射化學純度檢測色譜圖示于圖1,某批次樣品的放射性核純度初檢γ譜圖示于圖2。由圖1可見,樣品的色譜呈高斯分布,無明顯的前沿和拖尾;3批樣品中,鋰、釩、鈷、砷、鎘、汞等6種元素未檢出,其余元素中鐵含量≤459.3 ng/mL、鎳含量≤51.2 ng/mL、銅含量≤13.9 ng/mL、鋅含量≤200.8 ng/mL、銻含量≤6.2 ng/mL、鉛含量≤491.7 ng/mL,其中鉛含量較高可能是由于操作環(huán)境中的鉛輻射屏蔽材料所致,各元素均不超PDE限值的30%。圖2中可見805.8、1 077.3、1 261.1、1 883.2 keV等鎵[68Ga]的特征峰;3批樣品放射性核純度初檢均未檢出雜質(zhì)核素,24 h后檢出含量低于0.001%的雜質(zhì)核素。其中各雜質(zhì)含量均符合EP10.0的質(zhì)量標準[14],證明建立的方法可用于氯化鎵[68Ga]溶液雜質(zhì)檢測,適用于氯化鎵[68Ga]溶液的質(zhì)量控制。

圖1 氯化鎵[68Ga]溶液放射化學純度檢測色譜圖Fig.1 Chromatogram of gallium [68Ga] chloride solution for radiochemical purity detection

圖2 氯化鎵[68Ga]溶液γ譜Fig.2 γ spectrum of gallium [68Ga] chloride solution

表7 氯化鎵[68Ga]溶液雜質(zhì)檢測結(jié)果Table 7 Impurity detection result of gallium [68Ga] chloride solution

與文獻[21]相比,本文所用放射性薄層色譜法在EP10.0 標準方法的基礎上進行了優(yōu)化,樣品檢測結(jié)果均符合EP10.0標準的要求,說明該方法較為成熟。元素雜質(zhì)檢測除可采用ICP-MS法外,還可采用電感耦合等離子體光譜(ICP-AES)法,兩種方法均有可同時檢測多種元素、進樣量少的優(yōu)點,文獻[21]和本文所檢測樣品中鐵、鋅含量也均低于EP10.0的限度要求。放射性核純度檢測主要采用高純鍺γ能譜法,由68Ge/68Ga發(fā)生器(IRE)得到的氯化鎵[68Ga]溶液的放射性核純度和鍺漏穿均符合EP10.0質(zhì)量標準。

3 結(jié)論

1) 研究建立了檢測發(fā)生器來源的氯化鎵[68Ga]溶液雜質(zhì)的分析方法。放射化學純度檢測以EP10.0收錄的方法為基礎,通過對供試品溶液體系、流動相、固定相等條件的優(yōu)化,開發(fā)了放射性薄層色譜(Radio-TLC)法;采用ICP-MS法檢測樣品中鐵、鋅及其他10種限度值較低、毒性較大的雜質(zhì)元素(包括第1類:砷、鎘、汞、鉛;2A類:鈷、鎳、釩及第3類中限度值較低的鋰、銅、銻);采用EP10.0推薦的γ能譜法檢測其放射性核純度。

2) 所建立的放射性薄層色譜法操作簡單,結(jié)果可靠;ICP-MS法進樣量少,可同時測定12種元素雜質(zhì);高純鍺γ能譜法方法成熟,穩(wěn)定性好。結(jié)合樣品和分析方法的特點,對開發(fā)的方法進行了驗證,確保了各分析方法的科學性、合理性。

3) 開發(fā)出的方法用于發(fā)生器來源的氯化鎵[68Ga]溶液雜質(zhì)的檢測,各雜質(zhì)含量均符合EP10.0的質(zhì)量標準,后續(xù)可基于檢測結(jié)果建立企業(yè)質(zhì)量標準。