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        土著菌群介導(dǎo)下多機制協(xié)同治理鈾污染水體

        2023-10-27 03:58:38章志悅王晨旭鄧心怡肖權(quán)津王國華
        原子能科學(xué)技術(shù) 2023年10期
        關(guān)鍵詞:生物

        章志悅,賀 珊,宋 建,王晨旭,鄧心怡,肖權(quán)津,王國華,2,3,*

        (1.南華大學(xué) 土木工程學(xué)院,湖南 衡陽 421001;2.南華大學(xué) 污染控制與資源化技術(shù)湖南省高校重點實驗室,湖南 衡陽 421001;3.南華大學(xué) 鈾礦冶生物技術(shù)國防重點學(xué)科實驗室,湖南 衡陽 421001)

        礦物開采、核武器試驗等人為活動存在環(huán)境鈾污染的危險[1]。放射性核素污染具有長期毒性和致癌作用,對水生生物和人類健康可能構(gòu)成嚴(yán)重威脅[2]。因此,降低鈾的遷移能力,將鈾長期、穩(wěn)定地從水相中固定勢在必行。

        近期,Nature報道了微生物基因具有環(huán)境特異性[12],因此鈾污染地區(qū)的土著菌群經(jīng)過長期自然馴化,具有較好的鈾耐受能力;通過代謝互補及協(xié)同作用可以適應(yīng)復(fù)雜的鈾污染環(huán)境[13]。這項研究中,是通過篩選以甘油磷酸鈉作為唯一的碳源和磷源的土著菌群來除鈾。土著菌群可能包含多種作用機制,弄清楚多種機制的作用可以更好地對修復(fù)治理過程進行調(diào)控,提高效率及修復(fù)產(chǎn)物的穩(wěn)定性。目前關(guān)于在微環(huán)境中表現(xiàn)出4種除鈾機制的研究還甚少。

        為探索土著菌群降解甘油磷酸鈉誘導(dǎo)鈾生物礦化的動態(tài)過程、產(chǎn)物結(jié)構(gòu)以及可能的機制,本文擬對磷酸固相鈾離子的生物礦化過程進行系統(tǒng)研究,以進一步了解水溶液中微生物群落與鈾的相互作用,從而為潛在微生物群落在鈾污染水體原位修復(fù)中的應(yīng)用提供實驗數(shù)據(jù)。

        1 實驗

        1.1 主要材料

        所有實驗均在人工地表水中進行,其化學(xué)組成如下:MgSO4·7H2O,0.758 g/L;KNO3,0.008 8 g/L;FeSO4·7H2O,0.5 g/L;CaCl2,0.1 g/L;KCl,0.035 8 g/L;NaHCO3,0.034 g/L;MnSO4·H2O,0.01 g/L;NH4Cl,0.5 g/L。所用試劑均為分析純,購自上海麥克林生化科技有限公司,所有實驗溶液均用蒸餾水配制。UO2(NO3)2·6H2O,購自阿拉丁生化科技股份有限公司,使用前將其溶解于0.01 mg/L硝酸溶液中,制成1.0 g/L U(Ⅵ)原液。

        土壤、地表水和沉積物樣品取自中國南部某鈾尾礦池附近的污染環(huán)境,取樣后立即裝入無菌密封取樣袋中,覆蓋冰袋保存,運回實驗室后放入-20 ℃冰箱保存。

        1.2 設(shè)備與儀器

        UV-2450紫外分光光度計,北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;Nicolet-iS10傅里葉變換紅外光譜儀(FT-IR),美國賽默飛;QUANTA FEG 450掃描電子顯微鏡(SEM),美國FEI;X-Max能譜儀(EDS),英國牛津;Escalab 250Xi X射線光電子能譜儀(XPS),美國Themo Fisher公司;D8 Advance X-射線衍射儀(XRD),德國布魯克;HT7700生物透射電鏡(TEM),日本日立公司。

        1.3 方法

        1) 細(xì)菌群落篩選及結(jié)構(gòu)分析

        土壤和沉積物用pH=7.0~7.2的無菌水清洗和過濾,將收集的濾液與地表水樣品(含1.65 mg/L U)放入150 mL的錐形瓶中,置于搖床中振蕩30 min,得到含菌混合溶液。然后取含菌混合溶液中的懸浮液加入到鈾濃度梯度以5 mg/L依次提高的含鈾模擬地表水中,同時向其中加入3 g/L的C3H7Na2O6P·5H2O(β-甘油磷酸二鈉鹽(GP),作為碳源和磷源),并用NaOH和HCl將溶液的pH值調(diào)至7.0,將錐形瓶(裝有含鈾模擬地表水、GP和微生物)置于恒溫?fù)u床上在30 ℃下以150 r/min進行菌群馴化培養(yǎng)。共馴化培養(yǎng)5代,每代培養(yǎng)2周。

        采用Soil DNA Extract Kit (OMEGA)試劑盒提取馴化后的土著菌群的DNA,利用16SrDNA V3-V4區(qū)引物338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGT-WTCTAAT-3′)對提取的DNA片段進行擴增,然后用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增后的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)物,最后在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的測序平臺(美國Illumina公司)上用MiSeqPE250測序儀進行高通量測序,獲得微生物菌群的組成信息及多樣性。

        2) 生物固鈾實驗

        實驗分為兩組,一組為接種土著菌的生物固鈾組,另一組為不接種土著菌的對照組。向250 mL錐形瓶中加入100 mL含3 g/L GP的模擬地表水,并將初始pH值調(diào)整為7.0,過濾滅菌后接種土著菌,使初始微生物濃度控制在4×106mL(對照組不接種土著菌),然后加入U(Ⅵ)原液使U(Ⅵ)濃度達到20 mg/L后置于恒溫?fù)u床中,在30 ℃下以180 r/min進行培養(yǎng),期間每隔一定時間取上清液,測量其pH值、正磷酸鹽濃度、鈾濃度和微生物數(shù)量。實驗結(jié)束后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω=10%的檸檬酸解吸吸附在細(xì)胞壁表面的鈾。

        1.4 表征

        采用血球計數(shù)板對微生物進行計數(shù)。磷酸鹽濃度采用磷鉬藍法、紫外分光光度計測量。鈾濃度采用ICP-MS測量。通過FT-IR、SEM-EDS、XPS、XRD等表征沉淀的官能團、形貌特征、元素含量、主要元素價態(tài)和晶體結(jié)構(gòu)。通過TEM觀察細(xì)菌細(xì)胞的超薄切片,獲得細(xì)菌的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 溶液參數(shù)變化

        實驗期間溶液參數(shù)的變化示于圖1。由圖1a可見,在前60 h,微生物出現(xiàn)了生長滯后現(xiàn)象。60~228 h,微生物快速生長,在鈾的脅迫下釋放了更多的胞外磷酸酶來降解GP,即激活了微生物的解毒機制,降低了鈾對微生物的毒害作用[8],且提供了碳源和磷源,有助于微生物的生長。

        圖1 實驗過程中微生物濃度、pH值濃度和U(Ⅵ)去除率的變化Fig.1 Variation of microbial density, pH, and removal ratio of U(Ⅵ) during reaction

        由圖1b可見,生物固鈾組和對照組的整體pH值變化很小,說明微生物對反應(yīng)體系的pH值影響較小。

        由圖1d可見,不使用微生物時,實驗所用體系只能去除極少量的鈾。這可能和前文所述GP在溶液中存在微量降解有關(guān)。使用微生物后,36 h內(nèi)鈾的去除率增加到90.68%,36~228 h鈾的去除率緩慢增加,最終達到98.34%。這應(yīng)是微生物對鈾的吸附和鈾與因微生物對GP的降解而釋放的磷酸鹽的絡(luò)合作用的共同結(jié)果。

        2.2 固鈾產(chǎn)物的穩(wěn)定性

        沉積物中鈾解吸率的變化示于圖2。由圖2可看出,在整個反應(yīng)過程中,沉積物的解吸率持續(xù)下降,即隨著反應(yīng)時間的延長,固鈾后形成的產(chǎn)物穩(wěn)定性變好[14-15]。鈾的解吸率在前64 h大于75%,可能是生物吸附在鈾的前期處理過程中發(fā)揮了主要作用。在此后的88~228 h,解吸率不高,并繼續(xù)下降,說明吸附態(tài)的鈾發(fā)生了相轉(zhuǎn)變。鈾被吸附后,可能以吸附位點作為成核位點形成了局部高濃度狀態(tài),隨后被生物礦化成鈾礦物[16];還有可能發(fā)生了鈾的胞內(nèi)富集和生物還原成礦作用。因此,需要進一步對固鈾產(chǎn)物進行XRD、XPS、TEM表征分析,以驗證此推測。

        圖2 沉積物中鈾解吸率的變化Fig.2 Variation of uranium resolution in sediments

        2.3 固鈾產(chǎn)物分析

        1) FT-IR和SEM-EDS分析

        圖3 土著菌群吸附U(Ⅵ)前后的FT-IR譜Fig.3 FT-IR spectra of indigenous bacterial communities before and after adsorption of U(Ⅵ)

        土著菌群吸附U(Ⅵ)后的SEM形貌如圖4a所示,圖4a中方框區(qū)域的EDS分析結(jié)果如圖4b如示。從圖4a可見,吸附U(Ⅵ)后,細(xì)菌表面有顆粒狀沉淀物。從圖4b可見,細(xì)菌表面的顆粒狀沉淀物有明顯的鈾特征峰,證明顆粒狀沉淀物中有鈾的富集[15,20-21]。同時從圖4b 也可見C、O、P的特征峰,也作為組成官能團的重要依據(jù),在吸附過程中起到重要作用。

        圖4 土著菌群吸附U(Ⅵ)后的SEM圖像和EDS譜Fig.4 SEM image and EDS result of indigenous bacterial communities before and after adsorption of U(Ⅵ)

        2) XRD 分析

        通過XRD進一步探索在不同反應(yīng)時間下實驗組中鈾的存在形式[14]。土著菌群吸附U(Ⅵ)后不同時間點的XRD譜示于圖5。從圖5可見,吸附后12、60 h均沒有明顯的特征峰出現(xiàn),在228 h出現(xiàn)明顯的特征峰。說明在該混合菌體系中鈾的生物積累從無定形相轉(zhuǎn)化為明顯的晶體相需要60 h以上。與PDF標(biāo)準(zhǔn)譜相比,可以找到最佳匹配的礦物是變鉀鈾云母(K(UO2)(PO4)·3H2O,PDF#29-1061)和UO2(PDF#97-016-0815)。根據(jù)上述結(jié)果可知,混合菌群中結(jié)晶U(Ⅵ)礦物的形成是一個相對緩慢的過程,其中U(Ⅵ)經(jīng)歷了3個階段:吸附、積累、礦化反應(yīng)。

        圖5 土著菌群吸附U(Ⅵ)后不同時間點的XRD譜Fig.5 XRD patterns of indigenous bacteria at different time

        3) TEM 分析

        為了進一步研究微生物與鈾之間的微觀相互作用,將吸附U(Ⅵ)前后的樣品切片,用TEM進行分析。結(jié)合EDX確定鈾被細(xì)菌細(xì)胞積累后的位置,觀察細(xì)菌細(xì)胞和細(xì)菌細(xì)胞的超薄切片,結(jié)果示于圖6。由圖6a可見,吸附U(Ⅵ)前,細(xì)菌細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)都完整,細(xì)菌周圍、表面和體內(nèi)都沒有出現(xiàn)纖維狀、針狀、顆粒狀結(jié)構(gòu)沉淀。由圖6b可看見,吸附U(Ⅵ)后,細(xì)菌周圍、表面和體內(nèi)出現(xiàn)了纖維狀、顆粒狀結(jié)構(gòu)沉淀。通過mapping分析了細(xì)胞內(nèi)外及周圍的沉淀,發(fā)現(xiàn)U、P、K三個元素出現(xiàn)位置一樣。圖5c中可見較強的P峰、U峰和K峰。結(jié)合XRD的結(jié)果,基本可以確定該礦物是K(UO2)(PO4)·3H2O。鈾沒有生物功能且沒有發(fā)現(xiàn)其進入細(xì)胞的轉(zhuǎn)運蛋白。一般情況下,游離態(tài)鈾的金屬毒性遠(yuǎn)高于固定態(tài)鈾,在重金屬或其他壓力條件下,由于細(xì)胞膜的滲透性增加,導(dǎo)致鈾在細(xì)胞內(nèi)積累[1]。為了減輕鈾的毒性,通過磷酸鹽與鈾共沉淀是一種解毒機制[22]。

        a、b——吸附U(Ⅵ)前、后土著菌群的TEM圖像;c~f——吸附U(Ⅵ)后的EDX結(jié)果圖6 土著菌群的TEM圖像和EDX分析結(jié)果Fig.6 TEM images and EDX analysis results of indigenous bacteria

        4) XPS 分析

        為了進一步研究土著菌群在反應(yīng)過程中固鈾作用機制和XRD中發(fā)現(xiàn)的U(Ⅵ)礦化物UO2,用XPS分析了固鈾產(chǎn)物的組成信息和價態(tài)。U 4f光譜的擬合結(jié)果如圖7所示。由圖7可見,12 h時有1個雙峰,382.7 eV和393.5 eV對應(yīng)于U(Ⅵ),60 h和228 h有2個雙峰,383.3、394.1 eV和382.6、393.4 eV的擬合峰對應(yīng)于U(Ⅵ),而382.2、393.0 eV和381.9、391.7 eV的擬合峰則對應(yīng)于U(Ⅳ)[23]。Yu等[24]也在好氧條件下發(fā)現(xiàn)了鈾的生物還原,生物酶可能對鈾的還原有一定作用。因此在有氧條件下,鈾離子被混合菌群中具有還原能力的細(xì)菌從U(Ⅵ)還原成U(Ⅳ)[25],提高產(chǎn)物穩(wěn)定性,以還原方式協(xié)同固鈾。還可以發(fā)現(xiàn),隨著時間的延長,U(Ⅳ)的比例在減少,從60 h的32.7%降低到228 h的21.8%??赡苁且驗樵谟醒醐h(huán)境下,反應(yīng)的后期有部分U(Ⅳ)被重新氧化成U(Ⅵ)。反應(yīng)初期有機物含量較高,可以促進還原反應(yīng)的進行,U(Ⅵ)被還原為U(Ⅳ)。而反應(yīng)后期有機物被大量消耗,電子供體供應(yīng)不足,難以維持溶液中的還原氛圍,導(dǎo)致反應(yīng)體系的U(Ⅳ)含量下降。

        圖7 吸附U(Ⅵ)后土著菌中U 4f的XPS譜Fig.7 XPS spectrum of U 4f in indigenous bacteria after adsorption of U(Ⅵ)

        2.4 土著菌群群落結(jié)構(gòu)

        篩選后土著菌群的群落結(jié)構(gòu)如圖8所示。由圖8可見,篩選后的土著菌群有5個菌屬,依次為unclassified_f_Enterobacteriaceae(53.15%)、lysinibacillus(42.05%)、dysgonomonas(2.79%)、citrobacter(1.13%)、petrimonas(0.88%)。前文的表征和實驗結(jié)果已證明篩選后的菌群對GP的降解和鈾的固定化有顯著效果。unclassified_f_Enterobacteriaceae的豐度占比達到50%以上,起到了重要作用。其表面的化學(xué)基團(如氨基、羧基、磷基等)能吸附U(Ⅵ),能釋放磷酸酶降解有機磷酸鹽礦化U(Ⅵ),還能將U(Ⅵ)吞入細(xì)胞體內(nèi)[15],也具有還原U(Ⅵ)的能力[26-27]。lysinibacillus在切爾諾貝利核電站受放射性影響的土壤以及印度班杜胡朗露天鈾礦的鈾礦石和周圍土壤中也有發(fā)現(xiàn)[28]。lysinibacillus細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)成分,如羥基、羰基、羧基、酰胺、咪唑、磷酸鹽、磷酸二酯基團和副晶表面層(S-層)蛋白在生物吸附中起著重要作用,金屬還會在胞內(nèi)形成積累[29-30]。petrimonas的產(chǎn)物半胱氨酸可以作為電子載體加速電子轉(zhuǎn)移,可能與系統(tǒng)中的周圍細(xì)菌協(xié)同工作來發(fā)揮其還原作用[31-32]。citrobacter對鈾具有較高的耐受性并能在修復(fù)過程中增殖[33],也具有磷酸酶可以釋放磷酸鹽并轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的H2(UO2)2(PO4)2·8H2O[34]。dysgonomonas曾在堿性鈾尾礦庫中發(fā)現(xiàn)[35],具有較強的還原重金屬的能力[36-37]。

        圖8 篩選后的土著菌群微生物菌屬及占比Fig.8 Genus and proportion of indigenous bacteria after screening

        3 結(jié)論

        本文通過添加甘油磷酸鈉,對土著菌群在鈾污染地表水修復(fù)過程中的協(xié)同機制進行研究,得到如下結(jié)論。

        1) 甘油磷酸鈉作為碳源和磷源,激活了土著菌群對U(Ⅵ)進行固定,使溶液中U(Ⅵ)的去除率高達98%以上,且時間越長產(chǎn)物穩(wěn)定性越好。

        2) 該固鈾過程分為兩階段:第1階段是快速吸附階段;第2階段是多機制固鈾階段。鈾的礦化產(chǎn)物為變鉀鈾云母K(UO2)(PO4)·3H2O 和UO2。

        對鈾污染源篩選后的土著菌群對原生微生物環(huán)境干擾較小,在實地鈾修復(fù)方面具有潛在應(yīng)用價值。

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