余清，蔡林雪，蘇曉明,3，吳少明，戴明*

（1.福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，福建 福州 350002；2.聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇〇醫(yī)院倉(cāng)山院區(qū)，福建 福州 350002；3.閩南科技學(xué)院 生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，福建 泉州 362332）

0 引言

B 族維生素是一類(lèi)水溶性小分子化合物，普遍以輔酶的身份參與大量分解代謝和合成代謝酶反應(yīng)，其在人體內(nèi)含量很少，卻對(duì)人體內(nèi)糖、脂肪和蛋白的代謝、確保機(jī)體細(xì)胞功能正常運(yùn)行起到至關(guān)重要作用。每一種B族維生素的充足供應(yīng)都是能量生產(chǎn)系統(tǒng)正常運(yùn)作的必要條件，任何一種的不足都將限制產(chǎn)生能量的速度，從而可能造成嚴(yán)重的代謝和健康后果[1]，如VB12缺乏會(huì)影響嬰兒體重、身高和頭圍，煙酸缺乏會(huì)導(dǎo)致包括先天性心臟病等在內(nèi)的多器官出生缺陷[2]。B族維生素大多不能在機(jī)體內(nèi)合成，必須通過(guò)食物或外界環(huán)境攝取和補(bǔ)充[3]。隨著食物飲食結(jié)構(gòu)的變化，人們從食物攝取的B族維生素日益減少，因此合成B族維生素常作為營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑使用。目前，人體常用的B族維生素有11種，分別是維生素B1（硫銨素，Thiamine）、維生素B2（核黃素，Riboflavin）、維生素B3（煙酸，Niacin；煙酰胺，nicotinamide）、維生素B5（泛酸，Pantothenic acid）、維生素B 6（吡哆醛，pyridoxal；吡哆醇，pyridoxine；吡哆胺，pyridoxamine），維生素B7（生物素，Biotin）、維生素B9（葉酸，F(xiàn)olic acid）、維生素B12（鈷胺素，cobalamins）[2,4]。

高效液相色譜法和微生物分析法是目前國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)文獻(xiàn)[5-11]對(duì)B族維生素主要采用的檢測(cè)方法，盡管利用高效液相色譜法進(jìn)行前處理時(shí)簡(jiǎn)單便捷，然而測(cè)試過(guò)程中由于B族維生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，分離時(shí)需要使用離子對(duì)試劑使性質(zhì)相近的目標(biāo)物保留時(shí)間和洗脫順序發(fā)生變化，這使該方法與多種維生素同時(shí)測(cè)定的實(shí)際需求有一定差距。此外微生物法則存在步驟繁瑣、實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、環(huán)境要求高、重復(fù)性較差等缺點(diǎn)。研究表明[12-15]，質(zhì)譜檢測(cè)器在測(cè)定維生素方面較于上述兩種方法具有更明顯的優(yōu)勢(shì)，可提供可靠、精確的相對(duì)分子質(zhì)量及結(jié)構(gòu)信息，具有分辨率高、靈敏度好、特異性好、重復(fù)性佳、定性定量更準(zhǔn)確等特點(diǎn)。本研究以奶粉基質(zhì)為對(duì)象，建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定奶粉中11種B族維生素的檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法具有操作簡(jiǎn)便、用樣量少、靈敏度高、重現(xiàn)性佳等特點(diǎn)，可有效滿(mǎn)足食品安全抽檢監(jiān)測(cè)的要求。

1 材料與方法

1.1 主要儀器、試劑與材料

1290 Infinity 超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)Agilent公司）；高速冷凍離心機(jī)（Aanti J-E，美國(guó)Beckman Coulter公司）；超純水純化系統(tǒng)（Milli-Q，美國(guó)Mffljpore公司）；分析天平（BT224S，德國(guó)賽多利斯公司）；超聲波振蕩器（DS-8510 DTH，上海生析）；渦旋混均器（XHB，江蘇康健）。

維生素B1（99%，LRAC2207）、吡哆胺二鹽酸鹽（99.5%，S2070100）標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自美國(guó)Sigma；鹽酸吡哆醛（≥99.0%，B1940050）、吡哆醇（≥99.0%，LRAB7025）標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自上海安譜公司；維生素B2（98.27%，G983985）、煙酸（99.9%，G137932）、煙酰胺（99.39%，G976982）、泛酸鈣（98.8%，N3670025）、生物素（99.0%，C10625000）、葉酸（99.5%，1-F-30C）、維生素B12（≥98.0%，MKCJ6408）標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer；甲酸、乙腈（色譜純，美國(guó)Merck公司）；試驗(yàn)用超純水由Milli-Q超純水系統(tǒng)制備，電導(dǎo)率≥18.2 MΩ·cm。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

準(zhǔn)確稱(chēng)取1 g市售奶粉樣品于100 mL的容量瓶中，加入約80 mL的0.3%甲酸水溶解樣品并搖勻，于25 ℃水浴超聲30 min，加入2 mL的20%乙酸鋅沉淀蛋白，冷卻至室溫后用0.3%甲酸水溶液定容至刻度并搖勻，經(jīng)濾紙過(guò)濾后于15000 r/min、20 ℃下離心5 min，過(guò)0.22 μm濾膜，待進(jìn)樣。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱(chēng)取適量的11種B族維生素標(biāo)準(zhǔn)品分別置于25 mL容量瓶中，加水定容，配制成濃度約為1 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，于4 ℃冰箱中冷存待用。準(zhǔn)確吸取冷存的適量混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分別置于5個(gè)25 mL容量瓶中，加水稀釋定容至，并搖勻，得到濃度分別為10、20、50、100、200 ng/mL的11種B族維生素混標(biāo)工作液。

1.2.3 儀器條件

⑴ 色譜條件

Waters UPLC HSS T3 柱（150 mm×2.1 mm，1.8μm）；柱溫：40 ℃；流動(dòng)相：A相為0.3 %甲酸水溶液，B相為乙腈，流速0.3 mL/min。流動(dòng)相梯度洗脫程序：0～1 min，1%B；1～4 min，1%B～30%B；4～5.5 min，30%B～95%B；5.5～6.5 min，95%B；6.50～6.51 min，95%B～1%B；6.51～8 min，1%B。進(jìn)樣量：2.0 μL。

⑵ 質(zhì)譜條件

離子源及離子化模式：電噴霧電離源、正離子模式、ESI+；質(zhì)譜掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）；毛細(xì)管電壓3.0 kV；干燥氣溫度160 ℃；干燥氣流速16 L/min；霧化氣壓力30 psi；鞘氣溫度350 ℃；鞘氣流速12L/min。11種B族維生素的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 11種B族維生素的質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜和色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將1.2.2配制的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用50%乙腈-水溶液稀釋?zhuān)⑷胭|(zhì)譜進(jìn)行采集分析，采用正離子模式掃描，根據(jù)各B族維生素化學(xué)結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及質(zhì)譜響應(yīng)以確定11種B族維生素目標(biāo)組分，及各組分相應(yīng)的母離子、子離子，并優(yōu)化碰撞能量CE、加速電壓、Fragmentor電壓等質(zhì)譜參數(shù)。11種B族維生素的質(zhì)譜參數(shù)詳見(jiàn)表1。

2.1.2 色譜條件的優(yōu)化

B 族維生素是一類(lèi)水溶性小分子化合物，我國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)內(nèi)、外文獻(xiàn)[7-13]已證實(shí)C18柱、C8柱、HSS T3柱均可用于該類(lèi)化合物的分離與檢測(cè)，因此本試驗(yàn)分別比較BEH C18、BEH C8、HSS T3三種不同類(lèi)型色譜柱的分離檢測(cè)效果。結(jié)果表明，在流動(dòng)相為0.1%甲酸水-乙腈體系下，采用HSS T3色譜柱時(shí)，各目標(biāo)物的色譜分離度及峰形效果最好，響應(yīng)值也最高，而B(niǎo)EH C18與BEH C8兩種色譜柱對(duì)目標(biāo)組分保留能力較差，詳見(jiàn)圖1。

圖1 B族維生素在3種不同色譜柱分離條件下的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

由于B族維生素目標(biāo)組分采用正離子模式，流動(dòng)相中可加入適量揮發(fā)性的甲酸使得目標(biāo)組分離子化，從而提高目標(biāo)物的離子化效率。本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)0.1%甲酸水-乙腈、0.2%甲酸水-乙腈、0.3%甲酸水-乙腈組成的流動(dòng)相體系進(jìn)行研究，結(jié)果表明（詳見(jiàn)圖2），隨著流動(dòng)相中甲酸濃度的增大，各目標(biāo)物的響應(yīng)也隨之增大，但甲酸濃度過(guò)高會(huì)影響色譜柱的壽命和樣品穩(wěn)定性。綜上所述，本試驗(yàn)選擇HSS T3色譜柱，0.3%甲酸水/乙腈作為流動(dòng)相分離待測(cè)組分。

圖2 B族維生素在3種不同流動(dòng)相體系下的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖

鑒于B族維生素易溶于水以及堿性條件下不穩(wěn)定的特性，本文分別比較了水、50%甲醇水、50%乙腈水、0.1%甲酸水溶液作為提取溶劑時(shí)對(duì)各目標(biāo)物的影響，每種溶劑平行實(shí)驗(yàn)3次，結(jié)果見(jiàn)表2。當(dāng)采用0.1%甲酸水溶液提取時(shí)效率最高，11種目標(biāo)物平均回收率介于75%～90%之間，而其余3種提取溶劑效果較差，尤其是VB1和吡哆胺的回收率均低于70%。

表2 B族維生素在不同提取溶劑下的平均回收率（n=3）

研究[14,15]發(fā)現(xiàn)適當(dāng)提高提取液的酸度可以提高各物質(zhì)的回收率。為篩選出最佳甲酸提取濃度，進(jìn)一步對(duì)提取溶劑進(jìn)行優(yōu)化，本文進(jìn)行進(jìn)一步的試驗(yàn)，選擇0.1%、0.2%、0.3%、0.4%甲酸水溶液四個(gè)濃度進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如圖3所示，11種目標(biāo)物的初始回收率隨著甲酸濃度的增大而增大，采用濃度0.3%甲酸水溶液時(shí)，各物質(zhì)平均回收率在91%～101%之間，明顯高于采用濃度為0.1%、0.2%甲酸水溶液時(shí)的回收率；而當(dāng)甲酸水溶液濃度為0.4%，吡哆胺、葉酸、生物素回收率略高于0.3%甲酸水的提取效果，其余目標(biāo)物的回收率與0.3%甲酸水溶液提取效果相當(dāng)，綜合考慮選擇0.3%甲酸水溶液為本試驗(yàn)的提取溶劑。

圖3 提取液中甲酸濃度對(duì)奶粉樣品中B族維生素回收率的影響

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

按1.2.2方法配制11種B族維生素混標(biāo)溶液并對(duì)其進(jìn)行分析，重復(fù)測(cè)定3次，以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，目標(biāo)組分定量離子的響應(yīng)峰面積平均值為縱坐標(biāo)，分別擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算得出11個(gè)B族維生素標(biāo)準(zhǔn)品的線(xiàn)性方程，詳見(jiàn)表3。結(jié)果表明，在10～200 ng/mL濃度范圍內(nèi)11種B族維生素標(biāo)準(zhǔn)品線(xiàn)性相關(guān)性良好，相關(guān)系數(shù)（r2）均大于0.994。分別以3倍信噪比（S/N= 3) 對(duì)應(yīng)濃度為方法檢出限（LOD）和10倍信噪比（S/N= 3) 對(duì)應(yīng)濃度為方法定量限（LOQ），最終計(jì)算得出方法檢出限為5～20 μg/kg，方法定量限為16.7～66.7μg/kg。

表3 11個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的線(xiàn)性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.4 加標(biāo)回收率

本研究以市售奶粉樣品作為研究對(duì)象，考察方法的回收率及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。在1.00、2.00、5.00 mg/kg 3個(gè)添加水平下（每個(gè)水平重復(fù)5次），按照1.2所述的方法進(jìn)行檢測(cè)。11種B族維生素的回收率在90.8%～103.8%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.6%～5.5%，詳見(jiàn)表4。

表4 11種B族維生素的加標(biāo)回收率及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(n=5)

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

本試驗(yàn)對(duì)市場(chǎng)上銷(xiāo)量較高的10種市售品牌奶粉，按照上述優(yōu)化后的方法對(duì)11種B族維生素的含量進(jìn)行測(cè)定，并與產(chǎn)品標(biāo)簽上的營(yíng)養(yǎng)成分表明示值進(jìn)行對(duì)比。奶粉樣品中B族維生素含量為標(biāo)簽明示值的91%～103%，再次驗(yàn)證了本方法的可行性。

3 結(jié)語(yǔ)

本文采用超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，實(shí)現(xiàn)了奶粉中11種水溶性維生素的同時(shí)、快速定量檢測(cè)。樣品經(jīng)0.3%甲酸水提取、20%乙酸鋅蛋白沉淀、Waters UPLC HSS T3 柱（150 mm×2.1 mm, 1.8μm）分離，電噴霧離子化，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式，外標(biāo)法定量，在8 min完成11種B族維生素的測(cè)定。本方法具有操作簡(jiǎn)便、用樣量少、分析時(shí)間短、靈敏度高、重現(xiàn)性佳等優(yōu)勢(shì)，適用于奶粉中B族維生素常規(guī)檢測(cè)。通過(guò)測(cè)定10種市售品牌奶粉，測(cè)定結(jié)果為標(biāo)簽明示值的91%～103%，再次驗(yàn)證了該方法的可行性，因此該法可用于嬰兒奶粉中11 種B族維生素的同時(shí)測(cè)定。