柳訓(xùn)才,趙婷,陳茂深,范群艷,鄧奉紅,郭寶忠,鐘芳*
(1.廈門市燕之屋絲濃食品有限公司 燕窩研究院,福建 廈門 361100;2.江南大學(xué) 食品學(xué)院,江蘇 無錫 214122;3.北大醫(yī)學(xué)-燕之屋燕窩營(yíng)養(yǎng)與健康協(xié)同創(chuàng)新聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室,福建 廈門 361100)
燕窩,又名可食用燕窩(Edible bird's nest or Swiftlet's nest),是指特定的金絲燕(雨燕目Apodiformes雨燕科Apodidiae)的頜下腺分泌物與燕羽、草等混合構(gòu)建的可食用生物制品[1,2]。其中,侏金絲燕屬(C o l l o c a l i a)、金絲燕屬(Aerodramus)和雨燕屬(Apus)中的十多種燕類可筑造燕窩[3]。燕窩在亞洲,特別是中國被廣泛食用,被視為滋補(bǔ)佳品。中醫(yī)典籍曾描述燕窩具有“益氣化痰、滋腎養(yǎng)肺、補(bǔ)脾和胃、調(diào)補(bǔ)虛勞”的功效[4,5]。其次,現(xiàn)代科學(xué)研究表明,燕窩在美白、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、增強(qiáng)智力和記憶力、改善神經(jīng)退行性疾病和抗氧化等多個(gè)領(lǐng)域都被發(fā)現(xiàn)具有獨(dú)特的功效[1-2, 6-9]。這些記載和研究都證實(shí)了燕窩的滋補(bǔ)價(jià)值。此外,由于燕窩的珍稀特點(diǎn),燕窩從古至今都被賦予了很高的地位,被視為是對(duì)品質(zhì)的追求和對(duì)生活的高標(biāo)準(zhǔn)要求,特別是燕窩常出現(xiàn)在中國古代的詩文、典籍和皇家食譜中[4,10]。
隨著燕窩產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,消費(fèi)者愈發(fā)傾向于消費(fèi)即食燕窩產(chǎn)品。即食燕窩產(chǎn)品屬于一種方便食品,可以即開即食。其中,燕窩挑揀、燉煮、包裝等工序均由工廠在標(biāo)準(zhǔn)流程下完成,給予了消費(fèi)者方便的同時(shí),使得即食燕窩產(chǎn)品品質(zhì)得到有效控制。現(xiàn)在,消費(fèi)者對(duì)即食燕窩產(chǎn)品的期望除了滿足安全、美味以外,還要滿足其對(duì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的需求。燕窩中的主要營(yíng)養(yǎng)成分是蛋白質(zhì)與唾液酸,且燕窩原料中的唾液酸大部分以與蛋白結(jié)合的形態(tài)存在,已有研究證明不同形態(tài)的唾液酸在機(jī)體吸收利用方面存在差異[11,12]。特別是熱處理可能通過影響蛋白變性程度進(jìn)而影響燕窩中唾液酸糖蛋白的消化情況,以及最終消化產(chǎn)物中蛋白質(zhì)與唾液酸的溶出情況。
因此,燉煮是對(duì)燕窩營(yíng)養(yǎng)價(jià)值產(chǎn)生影響的重要因素,特別是在標(biāo)準(zhǔn)流程的即食燕窩生產(chǎn)過程中,然而燉煮工藝中的熱處理強(qiáng)度對(duì)燕窩主要功效成分消化特性的影響還未被科學(xué)研究。基于此,本研究對(duì)100、110、115、120 ℃分別燉煮處理30 min后的燕窩進(jìn)行體外模擬消化,旨在明確燕窩熱處理工藝(強(qiáng)度)對(duì)燕窩蛋白質(zhì)、唾液酸模擬消化特性的影響,以優(yōu)化燕窩的科學(xué)燉煮工藝,進(jìn)一步提升燕窩的利用效率和應(yīng)用價(jià)值。
紫外可見分光光度計(jì):UV-2802,上海尤尼柯儀器有限公司;電子天平:梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;集熱式恒溫加熱磁力攪拌器:DF-101S,鞏義市俞華儀器有限公司;電熱鼓風(fēng)干燥箱:DHG-9003,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;數(shù)顯溫控消化爐:KDN-08C,上海新嘉電子有限公司;凱氏定氮儀:KDN-103F,上海纖檢有限公司;高效液相色譜儀:Waters 2695(帶2475熒光檢測(cè)器,2998紫外檢測(cè)器),沃特世科技有限公司;化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng):ChemiDoc XRS+,美國伯樂公司;全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀:M2,美國分子儀器公司;高速離心機(jī):5430,德國艾本德公司。
燕窩:廈門市燕之屋絲濃食品有限公司;N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac,純度≥98%)、0.25%胰蛋白酶溶液、磷酸鹽緩沖液、胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗:上海創(chuàng)賽科技有限公司;胃蛋白酶、胰酶:Sigma-Aldrich有限公司;乙腈、甲醇為色譜純;高碘酸、鄰苯二胺鹽酸鹽、磷酸、四氫呋喃、氫氧化鈉等試劑均為分析純:中國國藥集團(tuán)上?;瘜W(xué)試劑公司。
根據(jù)Infogest Ⅱ體外消化模型稍作修改[13],構(gòu)建燕窩模擬胃腸道消化模型,本消化模型包括模擬胃消化和模擬腸消化2個(gè)階段。
在胃消化階段,將不同溫度熱處理的燕窩與提前配制好的8.0 mL模擬胃液(含6.9 mmol/L氯化鉀,0.9 mmol/L磷酸二氫鉀,25 mmol/L碳酸氫鈉,47.2 mmol/L氯化鈉,0.1 mmol/L氯化鎂,0.5 mmol/L碳酸銨,0.15 mmol/L氯化鈣和4000 U/mL胃蛋白酶)于50 mL離心管內(nèi)混合,用鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至2.0±0.2,而后補(bǔ)水使體系的體積達(dá)到20.0 mL,內(nèi)置轉(zhuǎn)子,于37 ℃恒溫加熱磁力攪拌器內(nèi)隔水浴反應(yīng),分析0、30、60、90、120 min的消化情況。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均為獨(dú)立的消化離心管,0 min時(shí)刻離心管加入預(yù)先滅活的胃蛋白酶,每隔30 min依次在相應(yīng)時(shí)間的離心管中用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至8.0滅酶,于4500 r/min離心10 min,分離上清液并于-20℃儲(chǔ)藏。
模擬胃消化結(jié)束后,進(jìn)入模擬小腸消化階段。向其中加入提前配制好的16.0 mL模擬腸液(含6.8 mmol/L氯化鉀,0.8 mmol/L磷酸二氫鉀,85 mmol/L碳酸氫鈉,38.4 mmol/L氯化鈉,0.33 mmol/L氯化鎂,10 mmol/L氯化鈣,2 mg/mL胰酶,2 mg/mL膽鹽),用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0±0.2,補(bǔ)水使體系的體積達(dá)到40.0 mL,內(nèi)置轉(zhuǎn)子,于37 ℃恒溫加熱磁力攪拌器內(nèi)隔水浴反應(yīng),將相應(yīng)時(shí)間的離心管置于沸水中加熱滅酶,于4500 r/min離心10 min,分離上清液并于-20℃儲(chǔ)藏。
燕窩蛋白質(zhì)含量測(cè)定參照GB 5009.5—2016凱氏定氮法,蛋白質(zhì)折算系數(shù)6.25。燕窩蛋白質(zhì)消化率的計(jì)算如式⑴所示:
通過SDS-PAGE凝膠電泳對(duì)燕窩蛋白質(zhì)分子質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定。取燕窩消化上清液和等體積的2×上樣緩沖液混合,100 ℃加熱3 min變性處理,10000 r/min離心3 min。電泳條件為:10%分離膠,5%濃縮膠,濃縮電壓80 V,分離電壓120 V,上樣量15 μL。電泳結(jié)束后,將凝膠置于質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為0.1%考馬斯亮藍(lán)R-250染色液(甲醇∶乙酸∶蒸餾水為=9∶2∶9,v/v/v)中染色過夜,后續(xù)將染色后的凝膠置于脫色液(甲醇∶乙酸∶蒸餾水=1∶1∶8,v/v/v)中,至脫色完全,拍照分析結(jié)果。
燕窩消化產(chǎn)物和原料的氨基酸態(tài)氮的測(cè)定參照中性甲醛滴定法。水解度(degree of hydrolysis,DH)計(jì)算如式⑵所示:
參考GB 31645—2018膠原蛋白肽的測(cè)定,測(cè)定燕碎消化產(chǎn)物中的多肽相對(duì)分子質(zhì)量分布。
色譜條件:色譜柱:TSKgel G2000 SWXL(7.8 mm×300 mm,5 μm);柱溫:30℃;流動(dòng)相:乙腈∶水∶三氟乙酸=40∶60∶0.05(v/v/v)。
檢測(cè)器:紫外檢測(cè)器;檢測(cè)波長(zhǎng):220 nm;流速:0.5 mL/min;進(jìn)樣體積:10 μL。
唾液酸的存在形式包括游離態(tài)的唾液酸、與低聚糖結(jié)合的唾液酸、與脂類結(jié)合的唾液酸和與蛋白質(zhì)結(jié)合的唾液酸,燕窩中的唾液酸主要結(jié)合在唾液酸糖蛋白糖鏈中的非還原末端。采用下述方法測(cè)定燕窩及其消化產(chǎn)物中不同形態(tài)唾液酸含量。
⑴ 總唾液酸含量及總唾液酸消化率測(cè)定
酸水解:取燕窩或其消化物粉末約50 mg,加入40.0 mL體積分?jǐn)?shù)為1%磷酸溶液于沸水浴中水解20 min,取出后冷卻,于5000 r/min離心10 min得上清液,待衍生。
唾液酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制:配制1.0 mg/mL唾液酸標(biāo)準(zhǔn)品母液,稀釋成不同濃度使用液,待衍生。
衍生條件:配制20 mg/mL的鄰苯二胺鹽酸鹽溶液,與1.0 mL樣品溶液等體積混合,于80 ℃避光水浴40 min,冷卻后過0.45 μm濾膜,待測(cè)??偼僖核嵯视?jì)算如式⑶所示:
⑵ 游離態(tài)唾液酸含量測(cè)定
衍生條件:取1.0 mL待測(cè)樣品,加入20 mg/mL的鄰苯二胺鹽酸鹽溶液1.0 mL,于50 ℃避光水浴2.5 h,改變溫度至4 ℃繼續(xù)衍生48 h,過0.45 μm濾膜,待測(cè)。游離態(tài)唾液酸消化率計(jì)算如式⑷所示:
⑶ 聚糖態(tài)唾液酸含量測(cè)定
取1.0 mL待測(cè)樣品,加入等體積的Sevage試劑(氯仿∶正丁醇=4∶1,v/v),多次萃取,直至無沉淀產(chǎn)生,以去除與蛋白質(zhì)結(jié)合的唾液酸。取萃取的水相層,加入等體積體積分?jǐn)?shù)為2%磷酸溶液,沸水浴水解20 min,測(cè)定除去唾液酸糖蛋白后的消化液中的總唾液酸含量,聚糖態(tài)唾液酸消化率計(jì)算如式⑸所示:
⑷ 蛋白態(tài)唾液酸含量測(cè)定
取1.0 mL待測(cè)樣品,加入等體積體積分?jǐn)?shù)為2%磷酸溶液,沸水浴水解20 min,測(cè)定溶液中總唾液酸含量,蛋白態(tài)唾液酸消化率計(jì)算如式⑹所示:
數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS 23進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,對(duì)各組之間的差異采用單因素方差分析(oneway-ANOVA),兩兩比較進(jìn)行Tukey's檢驗(yàn),假設(shè)檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05。數(shù)據(jù)結(jié)果采用Origin Pro 8.0進(jìn)行作圖。
燕窩中的主要營(yíng)養(yǎng)成分唾液酸糖蛋白是一種黏蛋白,吸水后溶脹但不易溶于水[14]。經(jīng)120 ℃處理的燕窩消化0 min時(shí)蛋白質(zhì)溶出率僅有32.47%,經(jīng)高溫?zé)崽幚?0 min后的燕窩絲仍能保持應(yīng)有的均勻絮狀結(jié)構(gòu),表明燕窩具有耐燉煮的加工特性。
消化過程包括120 min前的胃消化階段和120 min后的腸消化階段。由表1可知,燕窩蛋白質(zhì)的消化主要發(fā)生在胃階段,0~120 min間燕窩蛋白質(zhì)的消化率提高了16.88%~24.13%。消化120 min時(shí),相較于100 ℃熱處理的燕窩蛋白質(zhì)消化率(36.24%),115 ℃熱處理后的燕窩蛋白質(zhì)消化率顯著提高了30.05%,120 ℃熱處理后的燕窩蛋白質(zhì)消化率顯著提高了36.17%。如表1所示,消化時(shí)間為240 min時(shí),115 ℃熱處理的燕窩蛋白質(zhì)消化率為62.71%,較100 ℃熱處理的燕窩蛋白質(zhì)消化率顯著提高了29.94%(1.30倍);115 ℃及120 ℃熱處理的燕窩蛋白質(zhì)消化率相近,無顯著差異(P>0.05)。結(jié)果表明,在研究的溫度范圍內(nèi),熱處理溫度提高更有利于蛋白質(zhì)熱變性,燕窩蛋白質(zhì)消化率隨之提升,在115 ℃及以上時(shí)達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)。
表1 不同熱處理對(duì)燕窩消化過程中蛋白質(zhì)的消化率(n=3, X±SD%)
進(jìn)一步利用SDS-PAGE凝膠電泳分析燕窩蛋白質(zhì)消化過程中的分子質(zhì)量變化。由圖1可知,消化初始階段(0 min),燕窩蛋白質(zhì)存在較多條帶堆積于濃縮膠頂部(分子質(zhì)量>250 ku),表明燕窩在消化初始階段(0 min)存在較多分子質(zhì)量>250 ku的蛋白質(zhì)。在消化0~120 min時(shí),電泳條帶明顯下移,分布于10~250 ku范圍內(nèi),說明這些燕窩大分子質(zhì)量蛋白質(zhì)主要在120 min前的胃消化階段被消化、降解。消化120 min后,進(jìn)入腸消化階段時(shí),100~250 ku處的條帶幾乎消失,隨著消化時(shí)間的增加,條帶進(jìn)一步下移,此時(shí)燕窩蛋白質(zhì)幾乎完全被消化,轉(zhuǎn)化為分子質(zhì)量較低的肽或氨基酸,分子質(zhì)量進(jìn)一步降低。同時(shí),這也導(dǎo)致部分消化物分子質(zhì)量過低,10%的分離膠無法將其分離,故無法在SDS-PAGE凝膠電泳圖中顯示。這與冼小敏的研究結(jié)果類似[15]。
圖1 消化過程中燕窩蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分布
對(duì)比不同熱處理強(qiáng)度的電泳圖(0 min),120 ℃熱處理的燕窩蛋白質(zhì)電泳圖條帶整體相對(duì)100 ℃熱處理的燕窩蛋白質(zhì)電泳圖條帶顏色更深,這表明120 ℃熱處理促進(jìn)更多燕窩蛋白質(zhì)溶出。同時(shí),在胃消化階段結(jié)束時(shí)(120 min),100 ℃熱處理的燕窩蛋白質(zhì)條帶主要分布在10 ku與45 ku附近;隨著熱處理溫度的升高,110 ℃及以上熱處理的燕窩在20~25 ku處也逐漸出現(xiàn)蛋白質(zhì)條帶,表明提高熱處理溫度在促進(jìn)燕窩蛋白質(zhì)消化溶出的同時(shí),也促進(jìn)了燕窩大分子蛋白質(zhì)解聚成小分子,即促進(jìn)燕窩的消化。
胃消化階段大分子質(zhì)量燕窩蛋白質(zhì)的降解效率更高,可能歸因于胃蛋白酶的作用。胃蛋白酶屬于肽鏈內(nèi)切酶,對(duì)肽鍵的專一性較差,其可以將大分子燕窩蛋白質(zhì)降解為多肽,但很難產(chǎn)生氨基酸[16]。而更高溫度的熱處理提高燕窩蛋白質(zhì)消化率,可能是因?yàn)闊崽幚砀淖兞说鞍踪|(zhì)的空間結(jié)構(gòu),有利于胃蛋白酶與蛋白質(zhì)結(jié)合,提高了酶反應(yīng)效率。而更高強(qiáng)度的熱處理對(duì)燕窩蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的破壞程度更大,這進(jìn)一步提高了燕窩蛋白質(zhì)的消化率。
相比于完整的大分子蛋白質(zhì),多肽更容易被人體吸收利用[17]。分析燕窩蛋白質(zhì)消化后水溶性蛋白質(zhì)中多肽的相對(duì)分子質(zhì)量分布,進(jìn)一步評(píng)價(jià)燕窩蛋白質(zhì)的生物可及性,結(jié)果如表2所示。燕窩蛋白質(zhì)消化產(chǎn)物按照相對(duì)分子質(zhì)量劃分為低聚肽(<1 ku),中等分子質(zhì)量肽段(1~5 ku)和大分子肽段(5~10 ku)和蛋白質(zhì)(>10 ku)。燕窩蛋白質(zhì)經(jīng)消化120 min后,多肽相對(duì)含量分布趨于穩(wěn)定,低聚肽和蛋白質(zhì)的相對(duì)百分比略有增加,中等分子質(zhì)量肽和大分子肽段相對(duì)百分比減少,與消化率和SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果一致,表明大部分燕窩蛋白質(zhì)在胃消化階段被消化。燕窩蛋白質(zhì)經(jīng)消化240 min后的多肽主要以<1 ku的低聚肽為主,這同樣與SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果一致。
表2 消化過程中燕窩多肽相對(duì)分子質(zhì)量構(gòu)成百分比變化(n=1,X%)
值得注意的是,相比于100 ℃熱處理的燕窩,110 ℃及以上溫度熱處理的燕窩在胃消化階段(120 min)出現(xiàn)更多的相對(duì)分子質(zhì)量<1 ku的低聚肽,與SDSPAGE電泳結(jié)果一致,表明提高熱處理溫度有利于胃蛋白酶水解燕窩蛋白質(zhì),促進(jìn)了燕窩中大分子蛋白質(zhì)解聚成小分子蛋白質(zhì),即促進(jìn)燕窩消化。
燕窩原料中約含9%~11%的唾液酸,其極少以游離態(tài)的形態(tài)存在。與蛋白質(zhì)結(jié)合的唾液酸在燕窩制品的熱加工過程中穩(wěn)定性高,并不會(huì)發(fā)生唾液酸鏈的斷裂[19]。然而,上述研究表明熱處理會(huì)顯著提升燕窩中的蛋白質(zhì)消化性,因此進(jìn)一步評(píng)估了經(jīng)過不同溫度熱處理的燕窩中唾液酸的消化情況,消化過程中唾液酸存在形態(tài)構(gòu)成分布如圖2所示。結(jié)果表明,在體外消化的過程中,唾液酸不斷被釋放,而唾液酸的溶出主要集中在胃階段,在腸階段游離態(tài)唾液酸含量保持穩(wěn)定,但是會(huì)發(fā)生部分蛋白態(tài)唾液酸轉(zhuǎn)變?yōu)榫厶菓B(tài)唾液酸的變化。
圖2 熱處理對(duì)消化過程中不同形態(tài)唾液酸含量占比的影響
首先,在本實(shí)驗(yàn)中測(cè)定了經(jīng)不同溫度熱處理燕窩的總唾液酸含量。結(jié)果表明,所有經(jīng)過熱處理的燕窩樣品總唾液酸含量無顯著性差異(P>0.05),范圍為2167~2238 mg/kg,即未見熱處理對(duì)燕窩總唾液酸含量的影響。隨后,計(jì)算了不同溫度熱處理燕窩不同形態(tài)唾液酸含量占比,結(jié)果如圖2所示,隨著熱處理溫度的升高,在240 min的消化終點(diǎn)時(shí)燕窩中被消化后溶出的唾液酸占比逐漸升高。特別是經(jīng)過100 ℃熱處理的燕窩在240 min的消化終點(diǎn)時(shí)共有46.22%的總唾液酸被消化后溶出,經(jīng)過115 ℃熱處理的燕窩在240 min的消化終點(diǎn)時(shí)共有86.28%的唾液酸被消化后溶出,為100 ℃熱處理燕窩的187%(1.87倍);115 ℃、120 ℃處理后的燕窩唾液酸總消化率均顯著大于100 ℃熱處理的燕窩的唾液酸消化率(P<0.05),但二者之間并無顯著差異(P>0.05)。高溫?zé)崽幚泶龠M(jìn)燕窩在消化過程中總唾液酸溶出的同時(shí),也促進(jìn)了游離態(tài)、聚糖態(tài)唾液酸的溶出,經(jīng)100 ℃熱處理的燕窩在240 min體外消化后,僅產(chǎn)生11.67%的游離態(tài)唾液酸與10.83%的聚糖態(tài)唾液酸;而經(jīng)120 ℃熱處理后,這2種形態(tài)唾液酸的含量顯著增大到26.58%與49.45%(P<0.05)。上述結(jié)果表明,提高熱處理溫度可促進(jìn)燕窩唾液酸的消化溶出。
綜上,高溫?zé)崽幚韺?duì)燕窩唾液酸消化的促進(jìn)作用,可能歸因于熱處理促進(jìn)大分子質(zhì)量的唾液酸糖蛋白的消化,使其轉(zhuǎn)變成分子質(zhì)量更小的游離態(tài)或聚糖態(tài)唾液酸。游離態(tài)唾液酸在體內(nèi)可被直接吸收,而聚糖肽唾液酸形式可能有利于避免單體唾液酸的熱分解,同時(shí)唾液酸連接糖鏈后分子質(zhì)量增大,延緩了唾液酸的排出[20]。在母乳中,占比67.6%及以上的唾液酸是以聚糖態(tài)唾液酸形式存在[21]。基于此,115 ℃及以上溫度熱處理的燕窩經(jīng)過消化后接近50%的唾液酸以聚糖態(tài)唾液酸形式存在,更為接近母乳中唾液酸的聚糖態(tài)唾液酸含量占比。
燉煮對(duì)燕窩的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值有較大影響,本研究對(duì)100、110、115、120 ℃分別燉煮處理30 min后的燕窩進(jìn)行體外模擬消化,明確了燕窩熱處理工藝(強(qiáng)度)對(duì)燕窩蛋白質(zhì)、唾液酸消化特性的影響。結(jié)果表明,熱處理溫度的提高更有利于燕窩蛋白質(zhì)的熱變性,高溫?zé)踔竽茱@著提升燕窩的體外消化率,115 ℃燉煮燕窩的蛋白質(zhì)、唾液酸消化率分別為100 ℃燉煮燕窩的1.30倍、1.87倍;115 ℃及120 ℃燉煮燕窩消化率相近。同時(shí),熱處理溫度的提高使消化后的唾液酸形態(tài)分布發(fā)生改變,更多地以游離態(tài)和聚糖態(tài)唾液酸形式存在,更接近于母乳唾液酸存在形態(tài)。綜上,本研究所得結(jié)果可為即食燕窩燉煮工藝的優(yōu)化提供指導(dǎo),有助于燕窩的利用效率和應(yīng)用價(jià)值的進(jìn)一步提升。