曹 冶,謝 晶,康潤(rùn)敏通信作者,于吉鋒,吳學(xué)婧

1.四川省畜牧科學(xué)研究院,四川 成都 610066 2.動(dòng)物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都 610066

0 引言

豬腹瀉病是養(yǎng)豬生產(chǎn)中常見(jiàn)的疾病,癥狀主要表現(xiàn)為腹瀉、嘔吐、食欲不振,嚴(yán)重的會(huì)出現(xiàn)脫水癥狀。豬腹瀉病不僅有較高的發(fā)病率,且死亡率高。生豬一旦發(fā)生嚴(yán)重的腹瀉,如果預(yù)防不當(dāng)、治療不及時(shí),會(huì)嚴(yán)重影響?zhàn)B殖效益。

生豬出現(xiàn)腹瀉疾病主要是生豬自身、病毒和細(xì)菌以及三者之間的混合感染引發(fā)。在生產(chǎn)實(shí)踐中,豬腹瀉病主要受以下幾種細(xì)菌的影響:大腸桿菌、豬霍亂沙門(mén)氏菌以及這2種細(xì)菌混合感染。目前主要采用疫苗來(lái)預(yù)防,已經(jīng)發(fā)病的豬通過(guò)抗生素來(lái)治療,但長(zhǎng)期使用抗生素會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重的副作用,且會(huì)讓病菌產(chǎn)生耐藥性,導(dǎo)致嚴(yán)重的后果[1-2]。因此,尋找新的藥物替代抗生素,防治豬腹瀉病成為廣大畜牧工作者關(guān)注的重點(diǎn)。

我國(guó)的中藥已有幾千年的歷史,其主要來(lái)源于天然藥材及其加工品,包括植物藥、動(dòng)物藥、礦物藥及部分化學(xué)、生物制品類(lèi)藥物,具有溫和、無(wú)副作用、不會(huì)對(duì)病菌產(chǎn)生耐藥性的特點(diǎn),用中藥來(lái)治療豬腹瀉病,是生豬飼養(yǎng)業(yè)發(fā)展的大方向和迫切需求[3]。目前中藥治療豬腹瀉病主要集中于傳統(tǒng)中藥的研究,而對(duì)于藏藥研究較少,因此,本研究采用余甘子等藏藥來(lái)探討中藥治療豬腹瀉病的作用,以期尋找到更加有效的辦法來(lái)防治豬腹瀉病,滿足生豬飼養(yǎng)業(yè)發(fā)展的迫切需求。

1 材料與方法

1.1 材料

中藥余甘子、訶子、螃蟹甲、多刺綠絨蒿購(gòu)自西南中草藥批發(fā)市場(chǎng)。參試細(xì)菌豬霍亂沙門(mén)氏菌、大腸桿菌(ETEC)為四川某豬場(chǎng)分離純化而得。

1.2 中藥制備方法

1.3 藥物最低抑菌濃度(MIC)

1.3.1 藥物貯存液制備

根據(jù)提取藥物溶解性等特點(diǎn)確定其濃度,并在4 ℃環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 培養(yǎng)基

豬霍亂沙門(mén)氏菌、大腸桿菌(ETEC)使用水解酪蛋白(MH)肉湯,pH為7.2～7.4。

1.3.3 接種物的制備

用接種環(huán)挑活化的形態(tài)相似待檢菌落3～5個(gè),接種于4～5 mL的水解酪蛋白(MH)肉湯中,35 ℃孵育2～6 h。增菌后的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液用生理鹽水或MH肉湯校正濃度至0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn),含(1～2)×108CFU/mL。用MH肉湯將上述菌懸液進(jìn)行1：100稀釋后備用。在15 min內(nèi)接種完配制好的接種物,并取1份接種物在非選擇性瓊脂平板上傳代培養(yǎng),以檢查接種物純度。

1.3.4 稀釋抗菌藥物的制備及菌液接種

取無(wú)菌試管(13 mm×100 mm)9支,排成一排,除第1管加入1.5 mL MH肉湯外,其余每管加入MH肉湯1 mL,在第1管加入抗菌藥物原液0.5 mL混勻,然后吸取1 mL至第2管,混勻后再吸取1 mL至第3管,如此連續(xù)倍比稀釋至第8管,并從第8管中吸取1 mL棄去,第9管為不含藥物的生長(zhǎng)對(duì)照。然后在每管內(nèi)加入上述制備好的接種物各1 mL,使每管最終菌液濃度約為5×105CFU/mL。

1.3.5 孵育

將接種好的稀釋管塞好塞子,置35 ℃普通空氣孵箱中孵育20 h;嗜血桿菌和鏈球菌在普通空氣孵箱中孵育24 h。

1.3.6 最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定

在讀取和報(bào)告所測(cè)試菌株的最低抑菌濃度前,檢查生長(zhǎng)對(duì)照管的細(xì)菌生長(zhǎng)情況是否良好,同時(shí)還要檢查接種物的傳代培養(yǎng)情況以確定其是否污染,質(zhì)控菌株的最低抑菌濃度值是否處于質(zhì)控范圍。以肉眼觀察,藥物最低濃度管無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)者,即為受試菌的最低抑菌濃度[4-5]。

1.4 其他藥物與余甘子相互作用效果評(píng)價(jià)

采用分?jǐn)?shù)抑菌濃度指數(shù)[6-7](fractional inhibitory concentration index,FICI)表示,即聯(lián)合用藥時(shí)該藥物的分?jǐn)?shù)MIC值除以單獨(dú)用藥時(shí)藥物MIC值的商,表示為:FICI=聯(lián)合時(shí)分?jǐn)?shù)MIC/單獨(dú)時(shí)MIC。

FICI<1為協(xié)同作用,FICI = 1為相加作用,1 2為拮抗作用。

2 結(jié)果

2.1 中藥制備

取余甘子、訶子粉末各100 g,用濾紙包好后,放入索氏抽提器中,加入中性去離子水索氏提取4～6 h,提取物用蒸發(fā)皿蒸干水分,分別得到深棕色的余甘子水提取物10.5 g、訶子水提取物10 g。余甘子水提取收率為10.5%,訶子水提取收率為10%。

稱取螃蟹甲、多刺綠絨蒿粉末各100 g,用濾紙包好后,放入索氏抽提器中,加入無(wú)水乙醇索氏提取6 h,提取物用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸干溶劑,得到深棕色的螃蟹甲醇提取物11 g、暗綠色的多刺綠絨蒿醇提取物10 g,螃蟹甲醇提取物收率為11%,多刺綠絨蒿醇提取物收率為10%。

2.2 最低抑菌濃度

根據(jù)余甘子水提取物的溶解性等特點(diǎn),將余甘子水提取物用水稀釋至30.331 g/L,作為本次參試的藥物貯存液。

選用豬腹瀉病常見(jiàn)細(xì)菌豬霍亂沙門(mén)氏菌、大腸桿菌(ETEC)以及二者1：1的混合菌作為余甘子的抑菌試驗(yàn)待試菌,進(jìn)行最低抑菌濃度試驗(yàn)。結(jié)果顯示:余甘子對(duì)它們有強(qiáng)烈的抑菌能力,對(duì)豬霍亂沙門(mén)氏菌,大腸桿菌(ETEC)以及二者1：1的混合菌的最低抑菌濃度均為1.516 5 mg/mL,具體如表1所示。

表1 參試藥物對(duì)豬腹瀉病常見(jiàn)細(xì)菌的最低抑菌濃度 單位:mg/mL

2.3 其他中藥對(duì)余甘子抑菌能力的協(xié)同作用

為了驗(yàn)證其他中藥對(duì)余甘子抑菌能力的協(xié)同作用,根據(jù)它們的溶解性等特點(diǎn),將訶子水提取物用水稀釋至60.645 g/L,螃蟹甲醇提取物用5%吐溫80水溶液稀釋至52.391 g/L,多刺綠絨蒿醇提取物用5%吐溫80水溶液稀釋至57.411 g/L。將這些溶液作為本次參試的藥物貯存液。選用豬腹瀉病常見(jiàn)細(xì)菌豬霍亂沙門(mén)氏菌、大腸桿菌(ETEC)以及二者1：1的混合菌作為余甘子和其他協(xié)同中藥的抑菌試驗(yàn)待試菌,進(jìn)行最低抑菌濃度試驗(yàn)。

結(jié)果顯示:當(dāng)余甘子/訶子/多刺綠絨蒿按1：3：1混合時(shí),對(duì)豬霍亂沙門(mén)氏菌的最低抑菌濃度為0.060 7/0.363 9/0.103 3 mg/mL;對(duì)大腸桿菌(ETEC)的最低抑菌濃度為0.242 6/1.455 5/0.413 3 mg/mL;對(duì)二者1：1的混合菌的最低抑菌濃度為0.121 3/0.727 7/0.206 7 mg/mL。

當(dāng)余甘子/訶子/螃蟹甲按1：3：1混合時(shí),對(duì)豬霍亂沙門(mén)氏菌的最低抑菌濃度為0.242 6/1.455 5/0.471 5 mg/mL;對(duì)大腸桿菌(ETEC)的最低抑菌濃度為0.242 6/1.455 5/0.471 5 mg/mL;對(duì)二者1：1的混合菌的最低抑菌濃度為0.121 3/0.727 7/0.235 8 mg/mL。

當(dāng)余甘子/訶子/螃蟹甲按1：2：1混合時(shí),對(duì)豬霍亂沙門(mén)氏菌的最低抑菌濃度為0.189 6/0.758 1/0.322 9 mg/mL;對(duì)大腸桿菌(ETEC)的最低抑菌濃度為0.379 1/1.516 1/0.645 8 mg/mL;對(duì)二者1：1的混合菌的最低抑菌濃度為0.379 1/1.516 1/0.645 8 mg/mL。

當(dāng)余甘子/訶子按1：2混合時(shí),對(duì)豬霍亂沙門(mén)氏菌的最低抑菌濃度為0.337 0/1.347 7 mg/mL;對(duì)大腸桿菌(ETEC)的最低抑菌濃度為0.674 0/2.695 3 mg/mL;對(duì)二者1：1的混合菌的最低抑菌濃度為0.337 0/1.347 7 mg/mL。

當(dāng)余甘子/訶子按1：1混合時(shí),對(duì)豬霍亂沙門(mén)氏菌的最低抑菌濃度為0.758 3/1.516 1 mg/mL;對(duì)大腸桿菌(ETEC)的最低抑菌濃度為1.516 5/3.032 2 mg/mL;對(duì)二者1：1的混合菌的最低抑菌濃度為3.033 1/6.064 5 mg/mL。

當(dāng)余甘子/多刺綠絨蒿按2：1混合時(shí),對(duì)豬霍亂沙門(mén)氏菌的最低抑菌濃度為1.348 0/1.148 1 mg/mL;對(duì)大腸桿菌(ETEC)的最低抑菌濃度為1.348 0/1.148 1 mg/mL;對(duì)二者1：1的混合菌的最低抑菌濃度為2.696 1/2.296 3 mg/mL。

當(dāng)余甘子/多刺綠絨蒿按1：1混合時(shí),對(duì)豬霍亂沙門(mén)氏菌的最低抑菌濃度為6.066 2/10.333 3 mg/mL;對(duì)大腸桿菌(ETEC)的最低抑菌濃度為3.033 1/5.166 7 mg/mL。具體如表1所示。

為考察這些藥物對(duì)余甘子的相互作用,將這些數(shù)據(jù)進(jìn)行抑菌分?jǐn)?shù)濃度指數(shù)計(jì)算(見(jiàn)表2),結(jié)果發(fā)現(xiàn):當(dāng)余甘子/訶子/多刺綠絨蒿和余甘子/訶子/螃蟹甲按1：3：1混合時(shí),余甘子的分?jǐn)?shù)抑菌濃度指數(shù)均小于1,說(shuō)明這種組合的藥物對(duì)余甘子抑制豬腹瀉病原菌有協(xié)同作用。

表2 其他中藥與余甘子對(duì)豬腹瀉病常見(jiàn)細(xì)菌的抑菌指數(shù)

當(dāng)余甘子/訶子/多刺綠絨蒿按1：2：1混合時(shí),余甘子對(duì)豬霍亂沙門(mén)氏菌的分?jǐn)?shù)抑菌濃度指數(shù)小于1,對(duì)大腸桿菌(ETEC)和二者1：1混合菌的分?jǐn)?shù)抑菌濃度指數(shù)等于1,說(shuō)明這種組合的藥物對(duì)余甘子抑制豬霍亂沙門(mén)氏菌有協(xié)同作用,對(duì)余甘子抑制大腸桿菌(ETEC)和二者1：1混合菌有相加作用。

當(dāng)余甘子/訶子按1：2混合時(shí),余甘子對(duì)豬霍亂沙門(mén)氏菌以及二者1：1混合菌的分?jǐn)?shù)抑菌濃度指數(shù)小于1,對(duì)大腸桿菌(ETEC)的分?jǐn)?shù)抑菌濃度指數(shù)大于1且小于2,說(shuō)明此濃度組合下,訶子對(duì)余甘子抑制豬霍亂沙門(mén)氏菌以及二者1：1混合菌有協(xié)同作用,對(duì)余甘子抑制大腸桿菌(ETEC)無(wú)作用。

當(dāng)余甘子/訶子按1：1混合時(shí),余甘子對(duì)豬霍亂沙門(mén)氏菌的分?jǐn)?shù)抑菌濃度指數(shù)等于1,對(duì)大腸桿菌(ETEC)和二者1：1混合菌的分?jǐn)?shù)抑菌濃度指數(shù)大于1。說(shuō)明該濃度組合下,訶子對(duì)余甘子抑制豬霍亂沙門(mén)氏菌有相加作用,對(duì)余甘子抑制大腸桿菌(ETEC)無(wú)作用,對(duì)二者1：1混合菌會(huì)產(chǎn)生拮抗作用。

當(dāng)余甘子/多刺綠絨蒿按2：1和1：1混合時(shí),余甘子對(duì)參試菌的分?jǐn)?shù)抑菌濃度指數(shù)均大于1,特別是余甘子/多刺綠絨蒿按2：1混合時(shí)對(duì)1：1混合菌以及余甘子/多刺綠絨蒿按1：1混合對(duì)豬霍亂沙門(mén)氏菌和大腸桿菌(ETEC)的分?jǐn)?shù)抑菌濃度指數(shù)均大于2。說(shuō)明多刺綠絨蒿單獨(dú)對(duì)余甘子抑制豬腹瀉病常見(jiàn)細(xì)菌無(wú)作用甚至是拮抗作用。

綜上所述,訶子、螃蟹甲、多刺綠絨蒿與余甘子的多種藥物組合也有較強(qiáng)的抑菌作用,大部分能協(xié)同余甘子抑制豬腹瀉病常見(jiàn)細(xì)菌。這些發(fā)現(xiàn)對(duì)中藥防治豬腹瀉病打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

3 討論

余甘子為大戟科葉下珠屬植物余甘子(PhyllanthusemblicaL.)的干燥成熟果實(shí),具有清熱涼血、消食健胃和生津止咳的功效。現(xiàn)有研究證實(shí)70%乙醇提取物有較強(qiáng)的抑菌作用,抑菌活性強(qiáng)弱為:嗜熱脂肪芽孢桿菌>變形桿菌>金黃色葡萄球菌>大腸桿菌>枯草芽抱桿菌[8-9]。本次研究發(fā)現(xiàn),其水提取物同樣有較強(qiáng)的抑菌作用,其殺滅豬霍亂沙門(mén)氏菌、大腸桿菌(ETEC)以及二者1：1混合菌的活性相當(dāng)。

訶子具有廣泛的抗微生物活性,對(duì)常見(jiàn)的人體致病菌均有抑制作用,對(duì)革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌都有高度敏感性[10-11]。螃蟹甲為唇形科糙蘇屬植物螃蟹甲(PhlomisyounghusbandiiMukerjee)的干燥塊根,螃蟹甲干燥塊根水、乙醇提取物對(duì)耐亞胺培南銅綠假單胞菌具有明顯抗菌作用[12],其他未見(jiàn)報(bào)道。多刺綠絨蒿(MeconopsishorridulaHook.f.etThoms.)是罌粟科高山植物之一,主要分布在喜馬拉雅山脈地區(qū),具有接骨、活血化瘀、止痛的作用,為治頭創(chuàng)傷最有療效的藥物,藏醫(yī)多用于治療頭傷、骨折、跌打損傷等[13-14],但對(duì)細(xì)菌的抑制能力未見(jiàn)報(bào)道。本次研究發(fā)現(xiàn),余甘子的水提取物,螃蟹甲、多刺綠絨蒿乙醇提取物對(duì)豬腹瀉病常見(jiàn)細(xì)菌有較強(qiáng)的抑制作用。

4 結(jié)論

余甘子與螃蟹甲、多刺綠絨蒿、訶子多種藥物組合也有較強(qiáng)的抑菌作用,大多數(shù)能協(xié)同余甘子抑制豬腹瀉病病常見(jiàn)細(xì)菌。而不同的濃度組合,導(dǎo)致的藥物相互作用差距較大。余甘子/訶子/多刺綠絨蒿(1：3：1)和余甘子/訶子/多刺綠絨蒿(1：2：1),前者后兩種藥物能協(xié)同促進(jìn)余甘子抑菌,而后者后2種藥物對(duì)余甘子抑制大腸桿菌(ETEC)和二者1：1混合菌有相加作用。余甘子/訶子(1：2)和余甘子/訶子(1：1),前者訶子對(duì)余甘子抑制豬霍亂沙門(mén)氏菌和1：1混合菌有協(xié)同作用,而后者訶子僅對(duì)余甘子抑制豬霍亂沙門(mén)氏菌有相加作用。這可能是由于這些藥物均對(duì)這些細(xì)菌有較強(qiáng)的抑制作用,而訶子/多刺綠絨蒿中的某些成分可能有助于提升余甘子的抑菌作用,其促進(jìn)作用與藥物濃度有相關(guān)關(guān)系。