丁 園，王鳴華，華修德

（南京農業(yè)大學植物保護學院，南京 210095）

全球范圍內，因病蟲草等有害生物危害造成的作物產量損失為10%～41%[1]。農藥作為一項重要的農業(yè)投入品，可以保護作物免受有害植物、昆蟲、細菌、真菌和嚙齒動物的侵害，提升糧食產量。聯(lián)合國糧農組織的統(tǒng)計顯示[2]，2020年，全球農藥使用量約為270萬t，盡管近年來達到了平穩(wěn)期，但目前世界人口仍在穩(wěn)步增加，且全球變暖，極端天氣頻發(fā)，使得農作物遭受病蟲草等有害生物侵害的風險增加，因此未來農業(yè)生產仍然對農藥有著巨大的需求。

農藥的不合理使用會導致農作物有農藥殘留超標風險，不僅嚴重威脅人類健康，對生態(tài)及環(huán)境安全也產生危害。隨著人們生活水平的普遍提升，“舌尖上的安全”受到了越來越多的關注。農藥殘留快速檢測通常具有操作簡單，成本低和高通量等特點，作為儀器檢測的補充手段，能有效提升農藥殘留超標“早發(fā)現(xiàn)”的能力，筑牢餐桌前的最后一道防線。面對檢測需求的增加和檢測場景的多樣化，農藥殘留快速檢測逐漸與微流控、3D打印、納米科技、智能化機械及計算機等技術融合，使得農藥檢測向小型化、數(shù)字化、自動化、多功能化和系統(tǒng)化方向發(fā)展[3]。本文總結了近年來農藥殘留快速檢測的智能化研究進展，包括檢測平臺、檢測方法以及檢測結果的讀取及數(shù)據分析的智能化，對促進農藥的合理使用，保護人們的身體健康與環(huán)境安全具有重要意義。

1 檢測平臺的智能化

1.1 微流控生物傳感器

微流控生物傳感器是將信號轉導元件都集成在一張芯片上的分析裝置或系統(tǒng)，通常由流體控制、目標識別、信號輸出三部分組成，能夠完成試劑裝載、反應、分離到信號輸出的整個分析過程，具有微型化和自動化的顯著特點[4-5]。微流控芯片的制作材料通常是硅、玻璃、聚合物、纖維素紙或以上材料組合，制備方法包括微機械切割、光刻和3D打印等[6]。需要根據具體用途及其承載的反應物選擇制作材料及制備方法，其中聚合物基和紙基芯片因其較低的制備成本，是近年來最受歡迎的制作材料[7]。根據流體的驅動方式，可以將其分為被動型和主動型。被動型是由毛細作用驅動液體流動，主動型包括壓力驅動、離心力驅動、電能驅動、光能驅動、聲波驅動和磁力驅動等[8]。微流控生物傳感器具有樣品和試劑消耗少，反應效率高，生物相容性好，靈敏度高和操作簡單等優(yōu)勢，可以開發(fā)熒光/發(fā)光、表面等離子共振、表面增強型拉曼光譜（Surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）、光電子集成、數(shù)字光學等類型的檢測設備[9]，已經被廣泛用于環(huán)境污染物[5]、病原菌[10]、DNA[11]、細胞[12]和腫瘤[13]等的檢測。

微流控生物傳感器也越來越多地被用于農藥殘留快速檢測，根據其制備材料和方式，可以將其分為兩類：芯片類型和紙基類型[5]。芯片類型的微流控裝置可以對復雜的樣品進行精確、多線程分析，對溫度、壓力和有機溶劑有較好的適應性，但其制備方式較為復雜，成本較高。Tahirbegi等[14]開發(fā)了一種可以現(xiàn)場檢測水中除草劑濃度的玻璃基微流控裝置。其原理是內吸性除草劑（敵草隆、莠去津和西瑪津）可以阻礙裝置腔室中藻類細胞在光反應中的線性電子傳遞，從而提高細胞的內在熒光強度。同時由于除草劑對藻類細胞的代謝和光合作用的影響，會導致氧氣濃度和pH值的差異，因此除了熒光檢測外，該裝置同時內置了氧氣和pH的光學傳感器，可以對農藥濃度進行平行和互補的分析，該裝置可在數(shù)分鐘內完成樣品檢測，對3種除草劑的檢測限可達到納摩爾級別，還可以重復使用。Uka等[15]建立了一種可檢測水中草甘膦的玻璃基微流控芯片，該芯片包括由7個金電極和1個鉑電極組成的微電極陣列以及1個內體積為1 μL的微流體流動池，使得被泵入的樣品能夠沿電極陣列流動，該裝置對草甘膦的最低檢測限為188±39 nmol/L。

相較于芯片類型的裝置，紙基類型的微流控裝置制備簡單，環(huán)境友好，液體可以通過毛細作用驅動，無需施加外力[16]。Tong等[17]將可檢測有機磷農藥的連級反應整合到一個4層的紙基微流控裝置中（圖1）。其檢測原理是丁基膽堿酯酶（BChE）可以將乙酰膽堿（ATCh）水解為硫代膽堿，進而將MnO2納米片還原為Mn2＋，有機磷農藥能夠抑制BChE的活性，從而抑制MnO2納米片的還原，殘留的MnO2納米片將鄰苯二胺氧化為具有黃色熒光的2,3-二氨基吩嗪，淬滅碳點的紅色熒光。該裝置的第一層用于裝載樣品和BChE，第二層加入ATCh，第三層依次加入碳點和MnO2納米片，第四層用于裝載鄰苯二胺。該裝置具有響應準確，操作方便，無背景信號的優(yōu)勢，對敵敵畏的最低檢測限為1 μg/L。

圖1 四層紙基微流控裝置[17]

Li等[18]研發(fā)了一種檢測甲基對硫磷的電化學紙基微流控裝置（圖2），首先合成Fe3O4納米酶負載的碳量子點和對苯二甲酸銀金屬有機骨架的復合材料（Fe3O4/C-dots@Ag-MOFs），在Fe3O4/C-dots@Ag-MOFs的表面合成甲基對硫磷的分子印跡聚合物（MIP），隨后利用蠟在色譜紙表面形成親水的通道和反應區(qū)，將微鉑絲電極、微銀/氯化銀電極、微金絲電極組成的一個三電極系統(tǒng)固定在反應區(qū)，在反應區(qū)滴入MIP/Fe3O4/C-dots@Ag-MOFs并干燥。在檢測時，樣品溶液會通過親水通道進入反應區(qū)，在-0.53 V產生還原電流響應，同時該信號可進一步被Fe3O4/C-dots@Ag-MOFs增強，該裝置對甲基對硫磷檢測有較好的靈敏度、特異性和準確性。

圖2 基于電化學紙基微流控裝置的甲基對硫磷檢測[18]

1.2 可穿戴式檢測設備

近年來，可穿戴式的檢測設備在醫(yī)療健康領域得到廣泛的關注與應用，它能夠對細胞間質液、汗液、尿液和淚液中的生理生化指標、藥物等進行非侵入式、實時和連續(xù)的監(jiān)測，從而提供個性化醫(yī)療建議[19]。同時，可穿戴式檢測也符合“智慧農業(yè)”的管理理念，使用可穿戴式傳感器對農業(yè)生產過程中的指標進行連續(xù)監(jiān)測已成為一種趨勢，比如微氣候、農藥濃度、植物生長狀態(tài)、病蟲侵害、土壤性質和照明度等。它可以提供有關植物健康的有用信息，明確植物生長需求，從而對生產程序進行精準的調整，而且由于上述參數(shù)可能在一個溫室（或田地）中的每個地點都不同，因此在溫室（或田地）中的不同地點配備可穿戴設備可以了解作物整體情況[20]。

目前，可穿戴式檢測已被用于農藥殘留檢測，已報道的設備均基于電化學傳感器，可將其分為“植物穿戴”型和檢測人員的“手指穿戴”型。Zhao等[21]研制了一種檢測作物表面有機磷農藥殘留的植物可穿戴設備（圖3A）。該設備是基于激光誘導石墨烯的柔性三電極體系，其可伸縮延展的特性能夠適用于作物的不規(guī)則表面；并將有機磷水解酶固定在電極表面，用于甲基對硫磷的特異性識別，為增強分析性能，電極上又被進一步修飾了納米金。檢測時，在傳感區(qū)域上覆蓋明膠半固態(tài)電解質，將上述處理好的傳感器粘貼在目標表面，利用手持式電化學工作站檢測電化學行為，使用方波伏安法進行農藥濃度的分析。Paschoalin等[22]使用低成本、環(huán)境友好型的聚乳酸纖維墊作為材料開發(fā)了一款檢測多菌靈和敵草快的植物可穿戴設備（圖3B）。以蘋果和卷心菜作為檢測對象，在其表面滴加1 mL磷酸緩沖液后，將可穿戴設備覆蓋在上面，記錄差分脈沖伏安（多菌靈）和方波伏安（敵草快）數(shù)據進行農藥濃度的分析。研究人員同時比較了聚乳酸纖維和聚酯纖維作為制備材料的分析性能，結果表明以聚乳酸纖維為材料的設備具有更高的靈敏度。

圖3 基于植物可穿戴設備的有機磷（A）[21]、多菌靈和敵草快（B）的電化學檢測裝置[22]

Mishra等[23]研制了一種檢測有機磷農藥的手指穿戴設備（圖4A）。該設備被置于紫色丁腈手套表面，包括作為“感應手指”的食指和作為“采集手指”的拇指?！案袘种浮卑ㄓ∷⒃谑痔妆砻娴娜龑訌椥杂湍?，底層是由Ag/AgCl顆粒和Ecoflex彈性材料組成的銀覆蓋層，可以承受高度的應變和拉伸，該層既可作為參比電極，也作為蛇形連接器將手套與手持式微型恒電位儀連接；第二層是彈性苯乙烯-異戊二烯共聚物的碳素油墨，作為工作電極和輔助電極，其中工作電極上修飾了有機磷水解酶，用于有機磷農藥的識別；第三層是透明可拉伸的絕緣體，用于覆蓋下層蛇形連接器，并展示出傳感區(qū)和觸點墊?！安杉种浮鄙嫌梢粋€直徑1 cm的可拉伸碳素油墨圓形墊組成，能夠承受住在不同表面上滑動采樣時的機械應力。在檢測時，用拇指輕輕摩擦物品表面，將殘留的農藥收集在碳片上，在食指上滴入4滴半固態(tài)凝膠電解質后，與拇指接觸形成一個完整的電路，利用方波伏安法檢測農藥濃度。Raymundo-Pereira等[24]研制了一種能夠特異性檢測多菌靈、敵草隆、百草枯和殺螟硫磷的手指穿戴型檢測設備（圖4B）。4種農藥分別由位于手套表面食指、中指和無名指上的3個傳感器進行檢測：多菌靈由食指上包被碳球殼的碳電極作為工作電極進行檢測，其會在差分脈沖伏安圖的0.57 V處產生可用于定量分析的氧化峰；敵草隆的檢測由中指上包被Printex碳納米球的碳電極實現(xiàn)，其會在差分脈沖伏安圖的0.79 V處產生可用于定量分析的氧化峰；百草枯和殺螟硫磷的檢測均由無名指上硫酸預處理的碳電極實現(xiàn)，在方波伏安圖上，百草枯和殺螟硫磷能夠分別在-0.68 V和-0.15 V處產生可用于定量分析的氧化峰。利用鱷魚夾將電極與恒電位儀上的柔性電纜連接，檢測時，在物體表面滴上pH 7.0 0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液后，直接用手套觸碰物體表面即可。

圖4 基于指尖穿戴設備的有機磷（A）[23]、多菌靈、敵草隆、百草枯和殺螟硫磷（B）的電化學檢測裝置[24]

1.3 全自動ELISA工作站

酶聯(lián)免疫吸附分析（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）已經被廣泛應用于農藥殘留快速檢測。它的基本策略是將抗體或抗原包被在微孔中與待測物進行特異性結合，在經過孵育、洗滌后，通過酶促反應產生的有色生成物的量，計算待測物的含量[25]。ELISA的分析步驟包括數(shù)輪的“加樣-孵育-洗板”程序，通常需要數(shù)小時才能完成一次分析，期間實驗人員必須留在實驗臺周圍，并在需要進行下一步操作時中斷其他任務，對于需要進行高通量分析的實驗室，則需要更多的操作人員來完成。另一方面，ELISA分析中孵育時間以及加樣、洗滌的操作對于檢測結果的可重復性和準確性十分重要，因此檢測結果可能因操作人員的不同而存在差異。

針對以上問題，將ELISA程序自動化的優(yōu)勢顯而易見，它能減少實驗人員，擺脫重復性的任務，且能提高檢測的通量、可重復性和準確性。ELISA高度模塊化的程序使得它十分適合于開發(fā)全自動化系統(tǒng)，很多儀器公司都推出了全自動ELISA工作站。表1總結了目前市場上主流的ELISA工作站，通常包括移液、孵育、洗板和讀數(shù)4個模塊，能夠完成樣品稀釋、加樣、孵育、洗板、讀數(shù)和數(shù)據分析等ELISA的所有操作程序，有些系列中還有配置了光電倍增管或熒光檢測器的型號，用于化學發(fā)光酶免疫分析（如Gold Standard Diagnostics 公司的The BOLT 和ThunderBolt的CL型號）或熒光免疫分析（如樂普醫(yī)療的ADC FIA系列）?？梢愿鶕刻煲幚淼臉悠窋?shù)量來選擇工作站類型，低通量系統(tǒng)的工作站通常只能處理單個微孔板，但價格合理，儀器占地面積小，維護相對容易，中通量系統(tǒng)能夠同時處理2～3個微孔板，高通量系統(tǒng)可以同時處理4個或更多，中、高通量系統(tǒng)適用于那些每天需要進行多個微孔板或高通量分析的實驗室、檢測機構和醫(yī)院。

表1 ELISA 全自動工作站

2 檢測方法的智能化

分子邏輯門是一項十分有前景的智能傳感技術[26]，它模擬了計算機的二進制運算，將生物分子作為輸入，從而產生不同的輸出信號。使用二進制代碼來定義輸入和輸出的狀態(tài)：輸入的無和有分別定義為0和1，而高于或低于某個閾值的輸出信號則分別定義為1和0。根據真值表的排列，不同的輸入組合會產生不同的輸出。目前，應用于農藥檢測的邏輯門報道較少，僅Yan等[27]建立基于CRISPR-Cas12a檢測啶蟲脒（Acetamiprid，ACE）和莠去津（Atrazine，ATR）的分子邏輯門。如圖5A所示，農藥和適配體的特異性結合觸發(fā)了兩個發(fā)夾DNA探針之間的自組裝，并通過DNA回路中循環(huán)支點介導的鏈位移，形成含有PAM序列的dsDNA產物，該產物可以在crRNA的幫助下被CRISPR-Cas12a識別，隨后兩端修飾FAM和BHQ的ssDNA被Cas12a切割，從而產生高強度熒光信號用于農藥的檢測。基于上述原理，通過改變DNA探針的序列，研究人員設計了以ACE和ATR為輸入的信號的“OR”（圖5B）、“AND”（圖5C）、“XOR”（圖5D）和“INHIBIT”（圖5E）4個邏輯門，分別表示（1）至少存在一種農藥的輸入（0，1；1，0；1，1）；（2）存在兩種農藥輸入（1，1）；（3）有且只有一種輸入（0，1；1，0）；（4）僅有ACE輸入（1，0），以上4種情況產生高于閾值的輸出信號。分子邏輯門具有多通道計算能力，可以用于構建邏輯檢測平臺，通過邏輯計算和真值表實現(xiàn)對不同目標的智能分析，這種智能決策的特性使得分子邏輯門可用于環(huán)境、食品和臨床樣品中各種污染物的同時篩選檢測。

圖5 啶蟲脒和莠去津檢測原理示意圖（A）及分子邏輯門“OR”（B）、“AND”（C）、“XOR”（D）和“INHIBIT”（E）[27]

3 檢測結果讀取和數(shù)據分析智能化

3.1 智能手機檢測

近20年來，智能手機在人群中普及率逐年提高，且功能日益強大。高清攝像頭的配備以及處理器能力的提升使得智能手機能夠在檢測中作為一個便攜、智能的圖像采集和數(shù)據處理設備。其原理通常是將待測物質或其反應產生的光信號、電信號或顏色特征以圖片的形式進行采集，將所采集到的圖片經過專門的圖片處理軟件或者通過智能手機上安裝的APP程序，實現(xiàn)信號的量化，最終讀出數(shù)據結果[28]。

由于更加輕巧、便攜且操作者無需專門培訓就能熟練掌握的優(yōu)勢，智能手機已經與各種農藥殘留快速檢測技術聯(lián)用，將其按照信號種類可分為：（1）比色法檢測[29-31]。如Ruan等[32]建立了一種以Au@PtPd為示蹤物的競爭測流免疫層析（LFIA），用于檢測莠去津的代謝產物二氨基氯三嗪，除了像常規(guī)LFIA一樣，根據Au@PtPd在檢測線處累計顏色的深淺來判斷分析物的濃度外，Au@PtPd還具有類過氧化物酶活性，檢測線還可以被剪下加入TMB顯色液中進行催化顯色反應。研究人員利用3D打印技術制備了一個便攜、低成本的智能手機雙功能光學平臺，可以對上述的兩種信號進行定量檢測。該裝置包括（圖6A）：①放置光源的外殼；②8孔板條適配器和試紙條適配器；③光學暗盒；④鏡子，組裝后的裝置的尺寸為96 mm×90 mm×41 mm，成本不到5美元。將反應后的試紙或者8孔板條放到對應的適配器中，用智能手機拍照后導入Colorimeter軟件分析信號強度，智能手機的分析結果與商業(yè)讀條儀/酶標儀的分析結果之間也表現(xiàn)出較好的一致性。（2）熒光檢測[33-35]。如Fahimi-Kashani等[36]建立了一種檢測甲基對硫磷的比率熒光探針，探針由溴化十六烷基三甲銨（Cetyltrime-thyl ammonium bromide，CTAB）覆蓋的碲化鎘（Cadmium telluride，CdTe）量子點和作為參比信號的藍色碳點組成，甲基對硫磷能夠通過CTAB介導的電子轉移淬滅CdTe量子點的熒光，隨著甲基對硫磷濃度的增加，體系的顏色經歷“橘-粉-紫-藍”的變化。使用智能手機捕獲96孔熒光微孔板中的檢測圖像（圖6B），用圖像的色調值進行定量分析，色調值與甲基對硫磷濃度呈負相關，質量濃度為0.1～7 μg/mL，最低檢測線為0.06 μg/mL，顯著提升了視覺檢測的靈敏度。（3）發(fā)光檢測[37-39]。Ding等[40]建立氯噻啉生物發(fā)光試紙條，將納米熒光素酶與氯噻啉的模擬表位多肽融合表達作為雙功能檢測試劑，通過T線處納米熒光素酶的發(fā)光強度對氯噻啉濃度進行定量分析。研究人員利用3D打印技術制備了適用于智能手機的檢測配件（圖6C），包括一個放置試紙條的暗盒以及一個將暗盒與智能手機連接的適配器，在檢測結束后，使用智能手機的攝像頭通過光學窗口拍攝檢測圖片進行灰度值分析。

圖6 3D 打印制備的雙功能光學智能手機檢測設備（A）[32]、智能手機捕獲的熒光檢測圖像（B）[36]及3D 打印制備的生物發(fā)光試紙的智能手機檢測配件（C）[40]

3.2 智能化SERS光譜分析

表面增強型拉曼光譜（Surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）是一種新興超靈敏檢測技術，同時具有操作簡單，檢測時間短等優(yōu)勢，它能夠根據分析物的振動頻率和強度特征，描繪分析物特有的“光譜指紋”[41-42]。對于在檢測中獲得的原始光譜，需要在保留能夠區(qū)分其他物質信息的基礎上，提取待測物的光譜特征。在農藥殘留檢測中，通常利用待測農藥拉曼峰的強度（或面積）與農藥濃度之間的線性關系進行定量分析[43]。但實際檢測時，檢測體系中不同組分的光譜信號可能會相互重疊，給定量分析的準確性和穩(wěn)定性帶來挑戰(zhàn)。機器學習技術可以顯著提高定量分析的準確性，目前，主流的光譜分析方法包括偏最小二乘法、支持向量回歸、人工神經網絡等。機器學習能夠從化學混合物復雜且龐大的SERS光譜數(shù)據集中提取大量的信息，用于訓練識別SERS光譜中的特征峰，并給其一個能夠與被測物相對應的標簽[44]。目前，很多SERS傳感器均使用了機器學習法[45-47]。如Sanaeifar等[48]同時使用電子鼻和共聚焦拉曼定量檢測茶葉中的毒死蜱，對單個數(shù)據集和融合數(shù)據集建立人工神經網絡模型，并將兩種技術的信號與標準檢測方法得到的農藥濃度進行相關性分析。此外，卷積神經網絡是一種分析多維數(shù)據的深度學習方法。Zhu等[49]將一維卷積神經網絡的深度學習方法與SERS相結合用于檢測茶葉中的農藥殘留，并將該方法與常用的4種鑒定方法比較，該方法表現(xiàn)出了更好的準確性、穩(wěn)定性和靈敏度。由于深度學習需要大量的樣本訓練和測試來保證其準確性和泛化性能，目前只有少數(shù)研究使用深度學習算法。

3 總結

隨著計算機、3D打印、人工智能和納米科學等技術的興起和發(fā)展，農藥殘留檢測技術也逐漸與之融合，多種技術的集成使檢測進一步高通量化、小型化和便攜化，滿足“智慧農業(yè)”對農藥殘留快速檢測的需求。但總體上看，目前農藥殘留檢測的智能化尚處于初期階段，檢測與智能技術的深度融合仍在探索中。未來的農藥殘留檢測會進一步結合人工智能、云計算、納米科技等技術，用新技術優(yōu)化檢測設備和裝置，為海量復雜檢測數(shù)據的分析提供支持，其發(fā)展必將是多學科、多領域研究的結合，繼續(xù)向智能化、自動化、便攜化、數(shù)字化方向發(fā)展。