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        四川爐霍縣牦牛源蜱種類的形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定

        2023-10-26 01:47:42洛絨鄧珠郝力力
        四川畜牧獸醫(yī) 2023年10期

        洛絨鄧珠,藍(lán) 嵐,向 陽,潘 瑤,郝力力

        (1.甘孜藏族自治州畜牧業(yè)科學(xué)研究所,四川 康定 626000;2.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,四川 成都 610041;3.四川省鹽亭縣高端人才服務(wù)中心,四川 鹽亭 621600)

        1 材料與方法

        1.1 樣本采集 2021年3月~2021年8月,分別在爐霍縣雅德鄉(xiāng)、斯木鄉(xiāng)、仁達(dá)鄉(xiāng)、旦都鄉(xiāng)、泥巴鄉(xiāng)和宜木鄉(xiāng)6個鄉(xiāng)的416頭牦牛體表采集蜱。在各鄉(xiāng)選3~4個村,各村選2~4個農(nóng)場,從每頭牦牛的體表采集5~6 只蜱。按照地點(diǎn)編號分別裝入采集管中,塞入潮濕脫脂棉,經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定后將蜱浸于75%乙醇溶液,置4 ℃冰箱中保存待用。

        1.2 主要試劑及儀器 試劑:組織基因組DNA提 取 試 劑 盒(EasyPure Genomic DNA Kit)、Trans 2K DNA Marker、1×TAE 溶液和瓊脂糖購自北京全式金公司,1.1×T3 Super PCR Mix購自北京擎科生物有限公司;引物合成與測序均由生工生物工程(成都)有限公司完成。儀器:德國徠卡體式顯微鏡(Leica S9D),多功能生物樣品均質(zhì)器(Bertin Precelly 24),賽默飛微量離心機(jī)(Pico 17),德國耶拿Biometra TRIO 三槽PCR 儀(Biometra TRIO 48),北京六一儀器廠電泳儀(DYY-6C),全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)(Tanon 5200 Multi)。

        1.3 蜱形態(tài)學(xué)鑒定 根據(jù)《中國畜禽寄生蟲形態(tài)分類圖譜》[1],在體視顯微鏡下觀察蜱形態(tài)特征并拍照保存。

        1.4 DNA提取 取出保存在75%乙醇溶液中的蜱,用無菌去離子水沖洗3 次。待干燥后沿蜱縱向中軸線切為兩半,分別裝入兩支1.5 mL EP 管中,一支置于-80 ℃冰箱凍存,一支加入500 μL無菌水用多功能生物樣品均質(zhì)器充分研磨。研磨程序如下:每管加入陶瓷珠(直徑0.5 mm 的20 珠和2 mm 的5 珠),5 500 g 研磨2 次,4 000 g 研磨1 次。取 研 磨 液200 μL,根 據(jù)EasyPure Genomic DNA Kit 試劑盒說明書提取蜱基因組DNA,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.5 PCR 檢測 參照Abdullah 等[2]報道的方法對蜱進(jìn)行分子鑒定,引物信息見表1。PCR 擴(kuò)增體系如下:模板1 μL,上游、下游引物各1 μL(10 μmol/L),2×Easy Taq PCR SuperMix 12.5 μL,ddH2O 9.5 μL,充分混勻。設(shè)陽性對照和陰性對照(去離子水)。蜱ITS2基因的擴(kuò)增程序為:94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性15 s,55 ℃退火35 s,72 ℃延伸55 s,共40 個循環(huán);72 ℃延伸8 min;16 ℃保溫。

        表1 PCR引物

        1.6 序列分析及統(tǒng)計分析 將全部陽性樣品送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序,使用DNAStar 軟件對所得全部序列進(jìn)行拼接分析,在NCBI網(wǎng)站中使用BLAST比對,再使用MEGA 6.0軟件以Neighbor-Joining 法(Bootstrap 值為1 000)構(gòu)建分子進(jìn)化樹,并用SPSS 20.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析(P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義)。

        2 結(jié)果

        2.1 樣本采集數(shù)量及形態(tài)學(xué)鑒定 經(jīng)初步鑒定,在爐霍縣的6 個采集點(diǎn)共鑒定出2 種蜱,即微小扇頭蜱與青海血蜱。其中,微小扇頭蜱791只,占96.5%,為優(yōu)勢種;青海血蜱29只,占3.5%。在仁達(dá)鄉(xiāng)、斯木鄉(xiāng)、宜木鄉(xiāng)、泥巴鄉(xiāng)這4 個采集點(diǎn)只采集到微小扇頭蜱;在旦都鄉(xiāng)和雅德鄉(xiāng)則采集到這兩種蜱。結(jié)果詳見表2。

        2.2 蜱的分子鑒定

        2.2.1 蜱ITS2 基因擴(kuò)增 以1.4 中提取的DNA為模板,采用常規(guī)PCR方法擴(kuò)增蜱的ITS2基因片段,結(jié)果顯示在1 600 bp左右處出現(xiàn)條帶,與預(yù)期片段大小相符(圖1)。

        圖1 蜱ITS2基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果(部分樣本)

        2.2.2ITS2 基因遺傳進(jìn)化分析 將測序所得的全部序列進(jìn)行拼接、比對后共得到19條不同的序列,其中5 條為青海血蜱(H.qinghaiensisLuhuo 1-4),其余14 條為微小扇頭蜱(R.microplusLuhuo 1-14)。選取經(jīng)BLAST比對后同源性最高的1~2條序列確定種,顯示為青海血蜱及微小扇頭蜱;在NCBI 中選取分離自不同地區(qū)的青海血蜱和微小扇頭蜱的ITS2基因序列,選取其他幾個種的血蜱和革蜱的ITS2基因序列作為參考序列,構(gòu)建分子進(jìn)化樹(如圖2和圖3所示)。本研究所得的5 條青海血蜱序列均與甘肅平?jīng)觯↗Q737119)、青海?。↗Q737115)H.qinghaiensis的親緣關(guān)系最近,并聚于一大支,相似性在97.4%~97.6%。

        圖2 ITS2基因構(gòu)建青海血蜱進(jìn)化樹

        圖3 ITS2基因構(gòu)建微小扇頭蜱進(jìn)化樹

        R.microplusLuhuo1-14 的相似性在97.6%以上,其差異在0.1%~2.3%。進(jìn)化分析顯示14 條序列均與微小扇頭蜱的親緣關(guān)系最近,聚于一支,相似性在99.2%~100%。其中,R.microplusLuhuo2 與貴州(JQ737125)分離到的微小扇頭蜱的親緣性最高,為100%;R.microplusLuhuo12 與湖南湘西(MK224585)分離到的微小扇頭蜱的同源性最低,為99.2%。

        3 討論

        形態(tài)學(xué)鑒定要求鑒定人員的專業(yè)能力較強(qiáng)、工作經(jīng)驗豐富,如蜱存在肢體不完整或外形極為相似的情況,則較難鑒定[3-4]。在寄生蟲的分子鑒定方法中,當(dāng)前最為常用的是RCR 和DNA 測序。自2003 年Hebert 等提出DNA 分類學(xué)可用于物種鑒定以來,DNA 條形碼技術(shù)得到了迅速發(fā)展,目前已被廣泛應(yīng)用于寄生蟲的鑒定[5-6]。

        本研究僅鑒定出2 種蜱,即微小扇頭蜱和青海血蜱,這可能與本次收集蜱的方法、宿主及收集蜱的地理位置有關(guān)。本研究中微小扇頭蜱的占比高達(dá)96.5%,為爐霍縣半農(nóng)牧地區(qū)的優(yōu)勢蜱種,可能是體表采集這種方式及微小扇頭蜱本身的生活史導(dǎo)致的,因為它是典型的一宿主蜱,幼蟲、若蟲、成蟲各階段均在一個宿主上生長發(fā)育,只有飽血后的成蟲才會離開宿主,并且它的主要生活環(huán)境也是以農(nóng)區(qū)為主。6個采樣點(diǎn)均屬于半農(nóng)牧地區(qū),地理位置均分布在鮮水河沿線兩岸,故農(nóng)牧民的放牧區(qū)域主要集中于沿河流域的草地、農(nóng)區(qū)等,此類地區(qū)均為蜱類適宜生存的地區(qū)。本研究中青海血蜱的占比較少,僅為3.5%,僅在雅德鄉(xiāng)、旦都鄉(xiāng)有檢出,這可能和采集方法、宿主有關(guān)系,因其為三宿主蜱,在幼蟲階段、若蟲階段、成蟲階段吸飽血后都會脫落,其生活史中九成時間都屬于非寄生階段。非寄生階段的蜱棲息于草原、森林等環(huán)境中。

        本研究樣本僅在牦牛的體表采集,今后可以采用其他方法如布旗法,或者擴(kuò)展被采集樣本的宿主種類,如犏牛、藏綿羊等,以進(jìn)一步了解爐霍縣分布的蜱種類。另外,不同種類的蜱賴以生存的環(huán)境條件有所差異,如海拔高度、季節(jié)時間、植被類型等。爐霍縣境內(nèi)平均海拔有3 860 m,而青海血蜱恰是在高山地區(qū)分布的高原特有種。

        4 結(jié)論

        截至目前,共檢測出2 種蜱,證明爐霍縣至少存在微小扇頭蜱和青海血蜱。共采集到成蜱820 只,其中青海血蜱29 只,占3.5%;微小扇頭蜱791只,占96.5%,為優(yōu)勢種。微小扇頭蜱為爐霍半農(nóng)牧地區(qū)的優(yōu)勢蜱種,在采樣的6 個半農(nóng)牧鄉(xiāng)均有分布。青海血蜱僅存在于雅德鄉(xiāng)和旦都鄉(xiāng)。

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