楊丹嬌，張 敏，吳建平，藍 嵐*，潘 瑤，劉怡雯，陳朝喜，葉忠明

（1.甘孜藏族自治州畜牧業(yè)科學(xué)研究所，四川 康定 626000；2.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041）

在川西北高原牧區(qū)，廣大牧民和獸醫(yī)人員結(jié)合藏獸醫(yī)藥用植物資源優(yōu)勢總結(jié)和驗證了一些藏獸醫(yī)驗方和偏方，在防治畜禽細(xì)菌傳染病等方面具有積極作用［1-2］?；诖耍P者將61種常用藏獸醫(yī)藥用植物水提物與臨床常用的抗菌藥物聯(lián)用，研究其對藏豬源致病性大腸桿菌的體外抑菌活性，以期為創(chuàng)制綠色中藏獸藥提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 藏獸醫(yī)藥用植物和菌株的來源 61 種藏獸醫(yī)藥用植物（包括26個科55個屬）采自甘孜藏族自治州不同地區(qū)，由西南民族大學(xué)獸醫(yī)藥理學(xué)與毒理學(xué)實驗室陳朝喜副教授鑒定，藥物標(biāo)本編號后保存于該實驗室。藥物敏感性試驗使用的質(zhì)控菌株ATCC25922也由該實驗室保存。

1.2 抗菌藥物、培養(yǎng)基和化學(xué)試劑 四環(huán)素（TET）、鏈霉素（STR）、氟苯尼考（FLR）、恩諾沙星（ENR）、氨芐西林（AMP）5 種抗菌藥物購自上海源葉生物科技有限公司；胰蛋白胨大豆（TSB）肉湯、麥康凱瓊脂購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司，MH 肉湯、MH 瓊脂購自青島海博生物技術(shù)有限公司；二甲基亞砜（DMSO）等主要化學(xué)試劑均為分析純級別。

1.3 61 種藏獸醫(yī)藥用植物水提物的制備 采集61種藏獸醫(yī)藥用植物置于通風(fēng)處自然風(fēng)干，粉碎后過60 目藥典篩，分別取一定重量的粉末按1∶10的比例加入滅菌水浸泡30 min后煎煮1 h，雙層紗布過濾后將濾液濃縮、冷凍干燥，－20 ℃保存。臨用前，準(zhǔn)確稱取凍干粉，用滅菌水或DMSO溶解后制成1 g/mL的母液，－4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 致病性大腸桿菌SCP-ExP-coli2017-4307株的分離與鑒定 大腸桿菌SCP-ExP-coli2017-4307 株分離自稻城縣某藏豬原種場的腹瀉糞便樣本。首先利用麥康凱培養(yǎng)基和伊紅美蘭培養(yǎng)基交叉?zhèn)鞔蟪醪借b定，然后采用PCR 擴增16S rDNA 進行分子生物學(xué)鑒定，通過腸桿菌科細(xì)菌生化編碼鑒定管（15e）進行生化鑒定，確定為大腸桿菌后將純化菌株用30%甘油于低溫下保存。

1.5 藥物敏感性試驗 參照文獻［3］方法略作改動：在96孔板的第1～12列加入100 μL MH肉湯，然后在第1 列加入已配制好的水提物母液100 μL作倍比稀釋，最后1列作為空白對照，每藥兩次重復(fù)。挑取生長良好的中等大小菌落于MH肉湯中恒溫靜置培養(yǎng)12～16 h，調(diào)整到0.5 麥?zhǔn)蠞岫龋合♂尯蠹尤?00 μL 菌液至96 孔板1～11 列。37℃恒溫培養(yǎng)12～16h，觀察并記錄結(jié)果。采用同樣方法測定ATCC25922 和SCP-ExP-coli2017-4307株對四環(huán)素、鏈霉素、氟苯尼考、恩諾沙星和氨芐西林的最小抑菌濃度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）。

1.6 聯(lián)合藥敏試驗 采用棋盤法進行聯(lián)合藥敏試驗［4-5］，以部分抑菌濃度（Fractional Inhibitory Concentration，F(xiàn)IC）評價61 種藏獸醫(yī)藥用植物水提物與抗菌藥物聯(lián)用對SCP-ExP-coli2017-4307 株的抑制作用。當(dāng)FIC≤0.5 時表示協(xié)同作用；0.5＜FIC≤1 時表示相加作用；1＜FIC≤2 時表示無關(guān)作用；FIC＞2時表示拮抗作用。

2 結(jié)果

2.1 61 種藏獸醫(yī)藥用植物水提物對SCP-ExPcoli2017-4307 株的抗菌效果評價 61 種藏獸醫(yī)藥用植物水提物對SCP-ExP-coli2017-4307 株的MIC值分布見圖1和表1。

表1 61種藏獸醫(yī)藥用植物和5種抗菌藥物對SCP-ExP-coli 2017-4307株的MIC值

圖1 61種藏獸醫(yī)藥用植物水提物對SCP-ExP-coli 2017-4307株的MIC值分布

川西獐牙菜、大托葉云實、牛尾蒿、烏奴龍膽、角茴香、角蒿、沙棘、乳白香青、秦艽、唐古特烏頭、喜馬拉雅紫茉莉、藏茴香12 種藥用植物對SCPExP-coli2017-4307株的MIC值為15.625 mg/mL；山苦荬、止瀉木、水柏枝、川西小黃菊、甘青青蘭、甘青瑞香、紅花綠絨蒿、異葉青蘭、芫荽、垂頭菊、兔耳草、草木犀、砂生槐子、點地梅、珠芽蓼、烈香杜鵑、臭蒿、高山繡線菊、高原毛莨、唐古特鐵線蓮、藏紫草、匙葉翼首草22 種藥用植物對SCPExP-coli2017-4307 株的MIC 值為31.25 mg/mL；白苞筋骨草、肉果草、黃帚橐吾、瑞香狼毒、褐毛橐吾、螃蟹甲6 種藏獸醫(yī)藥用植物的MIC 值為62.5 mg/mL；大籽蒿、山礬、灰枝紫菀、花錨、白花刺參、草玉梅、夏至草、鐮形棘豆、濕生扁蕾、錫金報春、褐毛風(fēng)毛菊、藏黨參12種藥用植物對SCPExP-coli2017-4307株的MIC值為125 mg/mL；手參、高原蚤綴、纖毛婆婆鈉、紫花黃華4 種藥用植物對SCP-ExP-coli2017-4307 株的MIC 值為250 mg/mL；白花油麻藤、假耬斗菜、綿參、斑唇馬先蒿、臘腸果5 種藥用植物對SCP-ExP-coli2017-4307株的MIC值≥500 mg/mL。

2.2 61 種藏獸醫(yī)藥用植物水提物和抗菌藥物聯(lián)用的效果評價 61種藏獸醫(yī)藥用植物水提物與5種抗菌藥物聯(lián)用對SCP-ExP-coli2017-4307 株的FIC 值見表2。由表2 可知，61 種藥用植物與5種不同種類抗菌藥物聯(lián)用未表現(xiàn)出協(xié)同作用；61 種藥用植物與氟苯尼考、恩諾沙星聯(lián)用均表現(xiàn)出無關(guān)或拮抗作用；垂頭菊、臭蒿、藏紫草與四環(huán)素聯(lián)用表現(xiàn)出相加作用，其余58 種藥用植物表現(xiàn)出無關(guān)或拮抗作用；大籽蒿、川西小黃菊、手參、紅花綠絨蒿、芫荽、花錨、垂頭菊、豬牙蓼、臭蒿、高山繡線菊、唐古特鐵線蓮、紫花黃華、褐毛風(fēng)毛菊、藏紫草、錫金報春15 種藥用植物與鏈霉素聯(lián)用表現(xiàn)出相加作用，其余46種藥用植物表現(xiàn)出無關(guān)或拮抗作用；止瀉木、川西小黃菊、手參、白苞筋骨草、垂頭菊、豬牙蓼、高山繡線菊、唐古特鐵線蓮、紫花黃華、藏紫草、錫金報春11 種藥用植物與氨芐西林聯(lián)用表現(xiàn)出相加作用，其余50 種藥用植物表現(xiàn)出無關(guān)或拮抗作用。

表2 61種藏獸醫(yī)藥用植物和5種抗菌藥物聯(lián)用對SCP-ExP-coli 2017-4307株的FIC值

3 結(jié)論

本研究對采自折多山至康定機場沿線路段的61 種代表性藏獸醫(yī)藥用植物水提物進行抗菌活性評價，結(jié)果顯示55.74%（34/61）的藥用植物對致病性大腸桿菌SCP-ExP-coli2017-4307株表現(xiàn)出較強的體外抗菌活性（MIC≤31.25 mg/mL）。其中，大托葉云實、川西獐牙菜、牛尾蒿、烏奴龍膽、角茴香、角蒿、沙棘、乳白香青、秦艽、唐古特烏頭、喜馬拉雅紫茉莉、藏茴香12 種藥用植物的MIC 值為15.625 mg/mL，提示這些藥用植物在一定程度上可以作為替代抗菌藥物的候選目標(biāo)。

此外，本研究還初步探討和比較了61種藏獸醫(yī)藥用植物與5種常用抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用的藥效學(xué)差異。結(jié)果表明，白苞筋骨草、垂頭菊、臭蒿、川西小黃菊、大籽蒿、手參、紅花綠絨蒿、芫荽、花錨、高山繡線菊、唐古特鐵線蓮、紫花黃華、褐毛風(fēng)毛菊、錫金報春、止瀉木、川西小黃菊、藏紫草、豬牙蓼18種藏獸醫(yī)藥用植物水提物與四環(huán)素、鏈霉素、氨芐西林聯(lián)合應(yīng)用對致病性大腸桿菌SCPExP-coli2017-4307 株表現(xiàn)出相加作用，其中以垂頭菊和藏紫草的相加作用最為廣泛。在后續(xù)研究中，可以重點關(guān)注垂頭菊和藏紫草的資源分布，并對其不同提取部位進行抗菌活性物質(zhì)分析和抗菌機制探討。