丁萬寶 張培先 郭 歡 盧久琴 鄧 磊 石 嵐 戴 輝 鮑 新 趙艷芳

（昆明市延安醫(yī)院腫瘤科，云南 昆明 650000）

卵巢癌嚴(yán)重威脅婦女生命和健康[1]。由于卵巢癌早期缺少癥狀，約70%的患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于晚期，5年生存率僅為30%[2]。絕大多數(shù)卵巢癌患者在化療后會(huì)復(fù)發(fā)并發(fā)展成多藥耐藥[3]，卵巢癌產(chǎn)生耐藥機(jī)制的原理、預(yù)防耐藥和對(duì)抗耐藥是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。多藥耐藥是指腫瘤和某種化療藥物長時(shí)間接觸之后對(duì)其產(chǎn)生耐藥性，且同時(shí)交叉耐受其他結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同的化療藥物[4-5]。目前報(bào)道的引起腫瘤耐藥有多種原因，其中較為典型的是各種凋亡蛋白或凋亡抑制蛋白參與化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡以及耐藥的發(fā)生[6]。另外，代謝改變，已知鉑類敏感性與內(nèi)源性葉酸缺乏有關(guān)[7]。

腫瘤細(xì)胞耐藥性的形成大多由多藥耐藥相關(guān)基因的差異表達(dá)所致[8]。耐藥相關(guān)基因包括細(xì)胞周期相關(guān)基因、多藥耐藥相關(guān)基因、原癌基因及抑癌基因等[9]，其中抑癌基因是一類存在于正常細(xì)胞中，與原癌基因共同調(diào)控細(xì)胞生長和分化的基因，其功能丟失會(huì)引起細(xì)胞失控分裂和生長，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[10]。抑癌基因表達(dá)異常是由遺傳物質(zhì)和表觀遺傳修飾異常所致[11-12]。表觀遺傳修飾包括DNA甲基化、組蛋白修飾及miRNA等[13]。DNA甲基化是目前研究最多的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制之一，而由CpG島的DNA超甲基化所致的抑癌基因的沉默更是目前表觀遺傳領(lǐng)域研究的重要內(nèi)容[14]。另外，miRNA通過和靶基因之間一對(duì)多和多對(duì)一的調(diào)控關(guān)系，廣泛參與調(diào)節(jié)機(jī)體生長發(fā)育、生理功能等生命活動(dòng)過程，尤其是惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[15]。DNA甲基化和miRNA之間還存在雙向調(diào)控作用，這在很多腫瘤研究包括卵巢癌的研究中已得到證實(shí)[16-17]。

本研究通過篩選GEO 公共數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)集（GSE176218 Public on May 16,2022；GSE198077 Public on Apr 20,2022），比較耐藥細(xì)胞和非耐藥細(xì)胞的基因表達(dá)譜篩選在耐藥細(xì)胞中的抑癌基因，然后通過CpG島及甲基化位點(diǎn)分析，miRNA預(yù)測(cè)和GeneMANIA互作網(wǎng)絡(luò)分析軟件等對(duì)抑癌基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，探索抑癌基因表觀遺傳修飾和卵巢癌多藥耐藥機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 差異基因篩選 基因芯片獲?。喊凑諛颖緮?shù)量超過20例、設(shè)置對(duì)照組和人卵巢組織標(biāo)本條件在NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫中隨機(jī)篩選出2套卵巢癌數(shù)據(jù)集（GSE176218 Public on May 16，2022；GSE198077 Public on Apr 20，2022）（GSE176218，GSE198077）。從GPL570平臺(tái)選擇GSE79973、GSE54129，從GPL6947平臺(tái)選擇CSE29998數(shù)據(jù)集。其中GSE176218中有21例癌組織和111例正常組織，GSE198077中有50例癌組織和49例正常組織。系統(tǒng)檢索GEO（Gene Expression Omnibus）（GSE176218，GSE198077）數(shù)據(jù)庫，通過比較藥物敏感和耐藥樣本基因表達(dá)差異對(duì)卵巢癌耐藥相關(guān)基因芯片表達(dá)數(shù)據(jù)集進(jìn)行檢索。利用BH法分析差異基因表達(dá)，在GEO2R工具中開展多重假設(shè)檢驗(yàn)方法。

1.2 抑癌基因CpG島、甲基化位點(diǎn)及miRNA結(jié)合位點(diǎn)的生物信息學(xué)分析 通過在線CpG島及甲基化位點(diǎn)分析軟件CpGPlot和CpG Island Searcher對(duì)抑癌基因進(jìn)行DNA甲基化預(yù)測(cè)。通過在線miRNA預(yù)測(cè)軟件miRWalk和HOCTar對(duì)抑癌基因進(jìn)行基因的靶miRNA預(yù)測(cè)，其同時(shí)包含了miRanda、miRDB等5個(gè)預(yù)測(cè)軟件?！?”表示軟件預(yù)測(cè)到了抑癌基因的靶miRNA，“0”表示沒有預(yù)測(cè)到。針對(duì)每個(gè)抑癌基因，本研究僅選取得分最高的兩個(gè)miRNA進(jìn)行相關(guān)研究。通過GeneMANIA基因/蛋白網(wǎng)絡(luò)分析軟件對(duì)抑癌基因進(jìn)行互作分析。

1.3 Kaplan-Meier數(shù)據(jù)庫的使用 采用Kaplan-Meier Plotter在線分析抑癌基因表達(dá)水平與卵巢癌預(yù)后的關(guān)系，以抑癌基因表達(dá)水平的中位數(shù)作為分組依據(jù)，分為高、低表達(dá)兩組，然后分別選擇卵巢癌的總生存期進(jìn)行分析。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 人卵巢癌SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)液中，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中長期傳代培養(yǎng)。采用慢病毒shRNA技術(shù)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)hsa-miR-635 shRNA和hsa-miR-106b shRNA或?qū)φ誷hRNA的慢病毒，感染SKOV3細(xì)胞構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞株。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）miRNA逆轉(zhuǎn)錄采用miRcute miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒。PCR反應(yīng)采用miRcute miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒。具體操作按試劑盒說明進(jìn)行。

1.6 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè) 向人卵巢癌SKOV3細(xì)胞轉(zhuǎn)染或不含靶基因3'-UTR序列的pLUC載體，篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。然后將化學(xué)合成的miR-635和miR-106分子的mimics分別共轉(zhuǎn)染至上述穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。細(xì)胞共轉(zhuǎn)染48 h，按說明書，分別測(cè)定螢火蟲熒光素酶RLU值。

1.7 細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn) 將SKOV3細(xì)胞接種于96孔板，用不同濃度的藥物或抑制劑處理后調(diào)整細(xì)胞密度至每孔5 000，將20 μL MTT溶液加入其中，孵育時(shí)間為4 h。對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行終止，將培養(yǎng)液上清去掉，之后將150 μL的DMSO加入到每孔中，對(duì)其進(jìn)行振蕩，結(jié)晶融解之后在490 nm波長處對(duì)細(xì)胞吸光度進(jìn)行檢測(cè)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異基因篩選 利用公共平臺(tái)數(shù)據(jù)庫GEO，下載卵巢癌細(xì)胞系SKOV3耐藥的相關(guān)數(shù)據(jù)（GSE176218，GSE198077），通過比較藥物敏感和耐藥樣本的基因表達(dá)差異，篩選出2 450個(gè)表達(dá)差異基因，其中VHL和RNASET2基因表達(dá)差異最顯著（表1，圖1 A～B），且生存分析顯示VHL和RNASET2高表達(dá)患者預(yù)后較好（圖1 C～D）。將VHL和RNASET2基因作為候選基因，進(jìn)行后續(xù)的功能研究。

圖1 差異基因篩選

表1 RNASET2和VHL基因芯片數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)及qPCR分析結(jié)果

2.2 VHL與RNASET2基因DNA甲基化程度和甲基化位點(diǎn)分析 通過甲基化位點(diǎn)分析軟件CpG Island Searcher對(duì)VHL進(jìn)行DNA甲基化預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)VHL與RNASET2均具有CpG島和甲基化位點(diǎn)，推測(cè)VHL基因表達(dá)可能受DNA甲基化調(diào)控（圖2 A）。利用甲基化抑制劑處理卵巢癌SKOV3/DDP耐藥細(xì)胞，然后利用qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)甲基化抑制劑處理后VHL和RNASET2表達(dá)顯著升高（圖2 B～C）。

圖2 VHL和RNASET2基因DNA甲基化程度和甲基化位點(diǎn)分析

2.3 miRNA靶向抑癌基因的驗(yàn)證 利用shRNA技術(shù)在SKOV3/DDP細(xì)胞中分別敲低hsa-miR-635和hsa-miR-106b，結(jié)果顯示sh-hsa-miR-635和sh-hsa-miR-106b穩(wěn)轉(zhuǎn)效率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3 A～B），然后檢測(cè)RNASET2和VHL基因表達(dá)，結(jié)果顯示RNASET2和VHL基因表達(dá)顯著升高（P＜0.05）（表2，圖3 C～D）。雙熒光素酶檢測(cè)結(jié)果顯示，hsa-miR-635與RNASET2以及hsa-miR-106b與VHL間均存在靶向關(guān)系（圖3 E～F）。

圖3 miRNA靶向抑癌基因的驗(yàn)證

表2 在線軟件miRWalk和HOCTar預(yù)測(cè)抑癌基因的靶miRNA

2.4 DNA甲基化及miRNA修飾協(xié)同調(diào)控卵巢癌細(xì)胞耐藥性 在卵巢癌SKOV3/DDP耐藥細(xì)胞系中敲低miR-106、miR-635、mi635+5-Aza-CdR，觀察上述細(xì)胞系在化療藥物順鉑不同濃度作用下的細(xì)胞活力，結(jié)果顯示敲低miR-106和miR-635都顯著升高了細(xì)胞系對(duì)順鉑的敏感性，添加甲基化抑制劑后，敏感性進(jìn)一步增加（圖4）。

圖4 MTT檢測(cè)各組細(xì)胞在化療藥物順鉑不同濃度作用下的細(xì)胞活力

2.5 DNA甲基化及miRNA修飾協(xié)同通過PI3K/AKT分子機(jī)制調(diào)控卵巢癌細(xì)胞耐藥性 有研究表明，miR-106可以調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路[18]，通過RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，敲低miR-106與miR-635和添加甲基化抑制劑后通過降低PI3K/AKT表達(dá)增加細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性（圖5 A～D）。

圖5 RT-PCR檢測(cè)PI3K/AKT水平上的表達(dá)變化

3 討論

腫瘤多藥耐藥較為復(fù)雜，其中和多種生物學(xué)事件都有著很大關(guān)系，但均和差異表達(dá)存在密切關(guān)聯(lián)[19]。本研究通過文獻(xiàn)檢索及功能富集等生物信息學(xué)分析，從卵巢癌耐藥細(xì)胞系中篩選出2個(gè)與多藥耐藥相關(guān)的抑癌基因RNASET2和VHL。RNASET2被認(rèn)為是第二類抑癌基因，并被證實(shí)通過參與調(diào)節(jié)微環(huán)境、腫瘤轉(zhuǎn)移及細(xì)胞生長等來參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。VHL是公認(rèn)的抑癌基因，并被證實(shí)在多種腫瘤如腎癌、結(jié)腸癌及卵巢癌等多種實(shí)體癌的發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[20]，并通過參與=調(diào)控腫瘤生長和細(xì)胞死亡等方式參與腎癌細(xì)胞耐藥的發(fā)生和發(fā)展[21]。

DNA甲基化和miRNA修飾是抑癌基因沉默表達(dá)的重要修飾方式，被證明和多藥耐藥的形成有關(guān)[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，VHL、RNASET2均具有CpG島和（或）甲基化位點(diǎn)，可能受DNA甲基化調(diào)控。DNA甲基化和miRNA修飾之間存在協(xié)同調(diào)控作用[23]。本研究通過Biogrid數(shù)據(jù)庫查找基因水平和蛋白水平上的相互作用關(guān)系，并未發(fā)現(xiàn)RNASET2和VHL的相互作用關(guān)系，但它們分別與多個(gè)基因互作，且這些基因之間存在直接或間接的互作關(guān)系，在一定程度上可以說明RNASET2和VHL可能在功能上緊密相關(guān)[24]。

雖然抑癌基因的DNA甲基化和miRNA調(diào)控與卵巢癌多藥耐藥的相關(guān)研究取得了一定的進(jìn)展，但由DNA甲基化和miRNA協(xié)同調(diào)控下的抑癌基因沉默與卵巢癌多藥耐藥相關(guān)的研究還鮮有報(bào)道。本研究結(jié)果表明，RNASET2和VHL基因沉默表達(dá)的DNA甲基化與miRNA的協(xié)同調(diào)控機(jī)制，在DNA甲基化抑制劑和miRNA抑制劑作用下，抑癌基因重新表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞多藥耐藥的影響，DNA甲基化和miRNA協(xié)同調(diào)控下的抑癌基因通過影響PI3K/AKT信號(hào)通路影響卵巢癌多藥耐藥。本研究研究結(jié)果可對(duì)卵巢癌多藥耐藥問題進(jìn)行更加深入研究和解決這一問題提供一定的參考和依據(jù)，對(duì)卵巢癌多藥耐藥的靶點(diǎn)治療和靶藥物的篩選提供理論指導(dǎo)，對(duì)臨床診斷和預(yù)后有一定的指導(dǎo)意義。