張道亮,王希春,吳金節(jié),李 玉

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院,安徽 合肥 230036)

高非酯化脂肪酸(nonestes-terified fatty acid,NEFA)血癥是酮病的主要病理學(xué)特征之一,且高NEFA是引起肝脂毒性的主要原因,奶牛高NEFA血癥環(huán)境下肝細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體可能影響肝細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)和脂質(zhì)凋亡,從而導(dǎo)致發(fā)生肝脂毒性。ERS是指細(xì)胞在生長物質(zhì)攝入發(fā)生大幅度調(diào)整、糖基化作用、鈣離子代謝紊亂、活性氧、缺氧和微生物感染等內(nèi)源性和/或外源性影響因素的刺激下,細(xì)胞自我調(diào)節(jié)穩(wěn)態(tài)的功能被損害,蛋白質(zhì)處理與轉(zhuǎn)運(yùn)過程出現(xiàn)障礙,致使未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊在其腔室內(nèi)堆積,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)構(gòu)與功能受損,使細(xì)胞發(fā)動(dòng)應(yīng)激反應(yīng),以便內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能恢復(fù)并調(diào)節(jié)內(nèi)環(huán)境動(dòng)態(tài)平衡。泌乳早期奶牛主要的營養(yǎng)代謝紊亂性疾病,以出現(xiàn)NEFA血癥為臨床病理學(xué)特征,發(fā)生酮病的奶牛會(huì)表現(xiàn)出脂毒性肝損傷[1]。肝臟是奶牛酮病發(fā)生過程中的中心器官,同時(shí)也是NEFA產(chǎn)生的主要部位和肝脂毒性發(fā)生的主要器官。奶牛食欲下降,血糖濃度降低,脂肪代謝紊亂,高NEFA血癥導(dǎo)致酮體產(chǎn)生增多,促發(fā)奶牛罹患子宮內(nèi)膜炎、乳腺炎、創(chuàng)傷性網(wǎng)胃炎、真胃變位和免疫抑制,給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。外泌體作為細(xì)胞外囊泡之一,可從任意機(jī)體組織提取,在其外層脂質(zhì)層內(nèi)包裹有蛋白質(zhì)、脂類物質(zhì)、mRNA和miRNA以及其表面鑲嵌的信號(hào)受體等進(jìn)行遠(yuǎn)距離調(diào)控的細(xì)胞信使[3]。普遍認(rèn)為外泌體可作為機(jī)體物質(zhì)代謝與疾病狀態(tài)的標(biāo)志物,有研究表明,外泌體miRNA可用于治療代謝性疾病[4-5]。但是,外泌體是否參與奶牛酮病脂毒性的發(fā)生過程及其導(dǎo)致脂毒性的具體機(jī)制尚未明確。在過去的研究結(jié)果中,酮病奶牛血漿源和肝組織源外泌體可以向體外培養(yǎng)肝臟細(xì)胞傳遞內(nèi)源性信號(hào),從而對(duì)肝脂代謝產(chǎn)生影響,但作用機(jī)制還不是很明確,仍待進(jìn)一步探索研究。而使這些細(xì)胞發(fā)揮相應(yīng)效應(yīng)的有效機(jī)制之一是循環(huán)外泌體在細(xì)胞間的信息傳遞,以此種方式統(tǒng)籌調(diào)動(dòng)多種細(xì)胞功能,才使得內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)維持正常水平。因此,研究循環(huán)外泌體在細(xì)胞間信息傳遞的分子機(jī)制,對(duì)于全面了解、掌握各種肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制,以及尋找合適的治療靶點(diǎn)具有重要意義。本文就奶牛肝細(xì)胞源外泌體在奶牛肝脂毒性發(fā)生中的作用進(jìn)行了綜述。

1 高NEFA血癥引發(fā)的肝臟病理變化

NEFA能表現(xiàn)出極強(qiáng)的細(xì)胞毒性,對(duì)細(xì)胞的生物膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行破壞,使得細(xì)胞和細(xì)胞器受損;它還能增強(qiáng)某些細(xì)胞因子毒性,從而在許多疾病的病理變化中發(fā)揮重要作用。肝細(xì)胞受到高NEFA作用可致使肝細(xì)胞細(xì)胞器線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹和膜結(jié)構(gòu)通透性增加,進(jìn)而導(dǎo)致肝細(xì)胞出現(xiàn)病理性變化,如變性、壞死和炎性浸潤。肝脂毒性的加劇與肝脂代謝紊亂密切相關(guān)。當(dāng)能量負(fù)平衡時(shí),機(jī)體會(huì)進(jìn)行脂肪動(dòng)員,但產(chǎn)生過多的NEFA,從而使血中NEFA含量增加;當(dāng)肝臟攝取過多的NEFA,超出肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)NEFA的氧化能力,促使其合成甘油三脂(triglyceride,TAG)增加,并且轉(zhuǎn)運(yùn)載體轉(zhuǎn)運(yùn)能力不足,導(dǎo)致TAG在肝臟中蓄積,產(chǎn)生肝脂毒性效應(yīng)。

1.1 高NEFA血癥可引起肝臟ERS高濃度NEFA是誘發(fā)機(jī)體ERS的重要原因。ERS是細(xì)胞為應(yīng)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白過度沉積做出的生理和病理反應(yīng)。已有研究表明,肥胖情況下,未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)引起的肝臟生物化學(xué)變化和圍產(chǎn)期奶牛出現(xiàn)脂肪肝和酮病時(shí)的變化相似,因此ERS及其伴隨的UPR可能參與了奶牛酮病的形成[6]。酮病情況下的高NEFA血癥會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致奶牛肝臟發(fā)生代謝性應(yīng)激,ERS在其中起著關(guān)鍵作用。血液NEFA水平升高,超出肝臟β-氧化的能力后,NEFA就會(huì)轉(zhuǎn)化為TAG貯存在肝臟組織中。牛、羊等反芻動(dòng)物載脂蛋白B(apolipoprotein B,ApoB)的合成能力較非反芻動(dòng)物低,極低密度脂蛋白(very-low-density lipoprotein,VLDL)的合成轉(zhuǎn)化和分泌也不如后者,在肝臟中出現(xiàn)TAG過度積累,加劇脂代謝紊亂情況下的脂毒性,直接影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài),從而引起ERS[7]。越來越多的研究結(jié)果表明,泌乳早期高NEFA血癥奶牛肝臟發(fā)生ERS,過量的脂肪酸蓄積導(dǎo)致肝細(xì)胞的ERS[6,8]。雖然眾多的因素可引起ERS,但可以明確的是NEFA是泌乳早期奶牛肝臟發(fā)生ERS最有可能同時(shí)也是最重要的潛在因素。隨后的體外試驗(yàn)也證實(shí),犢牛肝細(xì)胞原代培養(yǎng)中ERS傳感器相關(guān)因子和相關(guān)酶的激活對(duì)NEFA劑量表現(xiàn)依賴性,進(jìn)一步表明脂肪酸可誘導(dǎo)奶牛肝臟ERS[9]。通過添加高脂飲食的方法,也可以誘導(dǎo)肝臟ERS,并且ERS的發(fā)生早于脂沉積,說明ERS參與肝脂毒性的形成[10]。

1.2 高NEFA血癥可引起肝臟脂質(zhì)凋亡肝細(xì)胞脂質(zhì)凋亡是肝脂毒性的另一病理學(xué)特征。眾所周知,ERS可以誘導(dǎo)細(xì)胞死亡和凋亡,ERS誘導(dǎo)的損傷過度而體內(nèi)平衡不能恢復(fù)后,UPR可以通過誘導(dǎo)凋亡而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[11]。高NEFA引起的脂質(zhì)蓄積會(huì)引起細(xì)胞功能紊亂和細(xì)胞死亡(脂質(zhì)凋亡)。最近的研究表明,酮病奶牛存在一定程度的肝臟凋亡,而且NEFA可以引起體外培養(yǎng)的奶牛肝細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)凋亡現(xiàn)象[12-13]。亦有報(bào)道稱,ERS介導(dǎo)脂毒性誘導(dǎo)的腎近端細(xì)胞和β細(xì)胞凋亡[14-15]。由此可見,高濃度的NEFA可以引起肝臟或肝細(xì)胞發(fā)生ERS和脂質(zhì)凋亡,ERS也可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

2 外泌體參與高NEFA血癥引起的肝臟病理變化

外泌體作為重要的媒介在細(xì)胞間發(fā)揮著相互作用,外泌體生物發(fā)生是蛋白質(zhì)質(zhì)量控制的一種機(jī)制,一經(jīng)釋放,外泌體就可以發(fā)揮各種各樣的作用,如重塑細(xì)胞外基質(zhì),在各種生理情況與病理狀態(tài)下發(fā)揮不可忽略的作用,其內(nèi)含的蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì),可作為細(xì)胞間信息傳遞的載體而表現(xiàn)生物學(xué)功能,并且在肝臟疾病的病理進(jìn)程可以檢測(cè)出相關(guān)表達(dá)[16-17]。由此可見,外泌體參與慢性肝病的發(fā)生和發(fā)展過程。但是,尚未有報(bào)道將高NEFA血癥環(huán)境下外泌體與肝臟脂毒性損傷聯(lián)系在一起,進(jìn)而研究高NEFA血癥環(huán)境下外泌體對(duì)奶牛肝脂毒性的加劇作用。關(guān)于外泌體是否能生長與分裂,以及在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境下,參與信號(hào)傳導(dǎo)的方式及靶向范圍和自主調(diào)節(jié)的生化反應(yīng)過程,仍有待確定。目前尚不清楚外泌體在未經(jīng)干預(yù)的生理水平是否在體內(nèi)發(fā)揮調(diào)節(jié)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)或病理過程發(fā)生的功能,該研究迫切需要建立可靠的動(dòng)物模型來探究揭示外泌體的生物來源及發(fā)生、運(yùn)輸與識(shí)別和細(xì)胞靶向與融合。

2.1 外泌體與外泌體miRNA研究進(jìn)展目前,奶牛外泌體的研究報(bào)道主要集中在奶牛血漿、腎細(xì)胞、乳汁和脂肪組織,并且以外泌體作為標(biāo)志物,分析其對(duì)奶牛機(jī)體代謝狀態(tài)和藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的影響[3-4,18]。但是外泌體存在于機(jī)體任意組織器官和體液中,比如實(shí)質(zhì)性器官肝臟、膀胱液亦或是腺體組織中都可以分離得到外泌體(圖1)。外泌體是粒徑為40～160 nm(平均在100 nm左右)的細(xì)胞外囊泡,通過在質(zhì)膜和內(nèi)涵體膜上出膜外排,可通過高階寡聚蛋白復(fù)合物的膜結(jié)合方式融合,富含核酸、脂質(zhì)和蛋白質(zhì),通過對(duì)來源組織細(xì)胞或其他靶細(xì)胞和組織進(jìn)行調(diào)控,表現(xiàn)生物學(xué)效應(yīng)[16,19]。外泌體miRNAs是沒有編碼功能的小片段RNA,只能通過與靶mRNA結(jié)合并擾亂其翻譯過程來影響目標(biāo)基因表達(dá)相應(yīng)蛋白。因此,近年來人們對(duì)外泌體尤其是miRNAs的作用產(chǎn)生了極大的研究興趣。目前,外泌體的研究主要集中在認(rèn)識(shí)其在細(xì)胞間通訊、內(nèi)臟器官穩(wěn)態(tài)以及疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制、診斷與治療方面。外泌體介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊可以影響腫瘤生長、細(xì)胞遷移、抗病毒感染和肝細(xì)胞再生,表明外泌體作為診斷或治療工具具有巨大的潛力[20]。

2.2 外泌體miRNA參與高NEFA血癥引起的肝脂毒性高NEFA血癥和外泌體的變化密切相關(guān)。不論是肝臟的上皮細(xì)胞(亦即肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞),還是自然殺傷性T細(xì)胞(the natural killer T cells,NKT)、肝星狀細(xì)胞、成人干細(xì)胞及肝竇內(nèi)皮細(xì)胞,均能釋放外泌體或被稱為外泌體的靶細(xì)胞[21]。而且POVERO等[22]通過對(duì)比非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver,NAFLD)模型小鼠與對(duì)照小鼠的循環(huán)血液及肝臟中外泌體水平,發(fā)現(xiàn)兩者之間具有顯著差異,并證明NAFLD動(dòng)物模型中肝臟是外泌體的主要來源器官。脂毒性導(dǎo)致肝細(xì)胞機(jī)能受損時(shí),肝細(xì)胞源外泌體釋放增加,并且肝臟的巨噬系統(tǒng)被廣泛激活[23]。以上研究均表明外泌體能密切參與到肝脂代謝過程。脂肪細(xì)胞衍生外泌體抵抗素呈遞率的降低可以降低肝臟脂肪變性,而對(duì)乙酰氨基酚引起小鼠肝損傷的肝細(xì)胞源外泌體會(huì)加劇受體肝細(xì)胞的脂毒性[24-25]?？梢娡饷隗w在肝臟脂毒性發(fā)生發(fā)展過程中起到細(xì)胞間通訊因子的作用。當(dāng)缺血再灌注引起的肝臟損傷用正常肝細(xì)胞源外泌體處理后可以得到修復(fù)和再生,說明對(duì)于一定程度上受損的受體細(xì)胞,外源性的外泌體可以對(duì)損傷進(jìn)行修復(fù)[23]。

另一方面,因微生物、對(duì)乙酰氨基酚和酒精等外源性因素和或其他內(nèi)源性因素對(duì)肝臟細(xì)胞造成的損傷,這種損傷情況下肝組織源外泌體對(duì)自身肝組織細(xì)胞或者其他受體肝細(xì)胞都能造成一定程度的異常,進(jìn)一步說明病理狀態(tài)下的肝組織源外泌體,能對(duì)受體細(xì)胞產(chǎn)生不良影響;如果是處理已經(jīng)遭到損傷的受體細(xì)胞會(huì)發(fā)現(xiàn)原本的損傷被加重[26-27]。在高脂肪高蛋白飼喂條件下,小鼠靜脈血中提取分離得到的外泌體注射到對(duì)照組小鼠體內(nèi),可引起未分化完全骨髓細(xì)胞沉積在肝臟中,同時(shí)出現(xiàn)全身性炎癥反應(yīng),導(dǎo)致如脂肪肝疾病、糖尿病和冠狀溝脂肪推積等肥胖相關(guān)的代謝紊亂[28]。在體外試驗(yàn)條件下,健康成人肝臟干細(xì)胞源外泌體能減緩肝細(xì)胞癌的擴(kuò)增和轉(zhuǎn)移,也能促使細(xì)胞增殖和抗凋亡,當(dāng)作用于70%肝切除模型鼠時(shí),其肝臟形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能作用得以快速恢復(fù)[29]。原代肝細(xì)胞和Huh7細(xì)胞(分化肝細(xì)胞癌細(xì)胞系)在高濃度脂質(zhì)試驗(yàn)條件下提取得到的外泌體對(duì)巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)有激活作用,進(jìn)而誘導(dǎo)產(chǎn)生非酒精性脂肪肝炎(NASH)。這些研究證實(shí)在病理狀態(tài)下的細(xì)胞所分泌的外泌體會(huì)含具有特殊作用蛋白和miRNA,并且分泌量會(huì)顯著提高,這種情況可能是很多病理變化的始作俑者。外泌體對(duì)體內(nèi)微環(huán)境的調(diào)控不僅能使癌細(xì)胞得以增殖或擴(kuò)散,還能促使細(xì)胞重建聯(lián)系和恢復(fù)活性以平衡體內(nèi)穩(wěn)態(tài)。間充質(zhì)干細(xì)胞合成分泌釋放的外泌體對(duì)肝細(xì)胞活性的提高有積極影響,并能促進(jìn)肝細(xì)胞分裂增殖[30]。因此,外泌體參與肝臟疾病和損傷的過程,可作為其診斷與治療的潛在手段之一。酒精性脂肪肝疾病發(fā)生過程中,循環(huán)外泌體的數(shù)量增加,肝細(xì)胞釋放的外泌體轉(zhuǎn)導(dǎo)miRNA信號(hào)進(jìn)入單個(gè)肝細(xì)胞,引起單個(gè)肝細(xì)胞的外泌體釋放增多[31]。

以上結(jié)果說明,外泌體在NAFLD和NASH中起著重要作用。高NEFA、高β-羥丁酸(BHB)奶牛和人類或者其他動(dòng)物的NAFLD和NASH同樣表現(xiàn)出肝炎和脂肪酸蓄積的病理變化[32]。由此可見,外泌體同樣能參與高NEFA血癥奶牛的肝臟脂代謝紊亂及其相關(guān)的過程。有研究表明,圍產(chǎn)期奶牛血漿外泌體對(duì)奶牛腎細(xì)胞、子宮肌層外膜上皮和基質(zhì)細(xì)胞具有一定的修復(fù)作用[33],但是,未見高NEFA血癥下的外泌體對(duì)受體細(xì)胞和組織毒性損傷的系統(tǒng)性報(bào)道。由此可見,外泌體參與維持機(jī)體內(nèi)的穩(wěn)態(tài),在疾病發(fā)生發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用。

2.3 肝細(xì)胞源外泌體miRNA能夠通過ERS介導(dǎo)的脂質(zhì)凋亡通路加劇高NEFA血癥引起的肝脂毒性外泌體、ERS和脂質(zhì)凋亡均參與了肝臟脂毒性損傷,但是其參與的具體機(jī)制尚未闡明(圖2)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)乙酰氨基酚急性肝損傷來源外泌體能引起受體肝細(xì)胞死亡或發(fā)生毒性反應(yīng),同時(shí)上調(diào)受體細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白p-JNK/JNK、Bax和cleaved caspase-3的表達(dá),表明外泌體通過凋亡途徑參與肝細(xì)胞的病理性損傷[25]。有研究表明,在體外細(xì)胞試驗(yàn)中,棕櫚酸(脂毒性信號(hào))處理肝細(xì)胞,可增加培養(yǎng)基中釋放的外泌體,說明外泌體參與了脂毒性的發(fā)生和發(fā)展過程[34-35]。NEFA引起的脂毒性,不僅可以引起氧化應(yīng)激,還可以作為ERS的誘導(dǎo)因子[36-37]。同時(shí)有研究表明,高濃度的游離脂肪酸(FA)可以引起肝細(xì)胞的ERS,進(jìn)而引起肝細(xì)胞的凋亡[38]。ERS主要與UPR密切相關(guān),正常情況下,與ERS關(guān)聯(lián)的葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)同內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中UPR的相關(guān)蛋白分子PERK、IRE1α和ATF6處于緊密結(jié)合狀態(tài);當(dāng)細(xì)胞受到刺激發(fā)生ERS后,UPR的主要介質(zhì)從ERS的GRP78上解離,從而使PERK、IRE1α和ATF6活化,對(duì)下游靶基因GRP78、剪切型的X盒結(jié)合蛋白1和活性轉(zhuǎn)錄因子4進(jìn)行調(diào)控[6,39]。有研究通過調(diào)節(jié)營養(yǎng)攝入引起鼠類肝脂毒性發(fā)生,結(jié)果表明UPR標(biāo)志物cAMP反應(yīng)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子p-eIF-2α和p-PERK表達(dá)量被上調(diào),進(jìn)一步證實(shí)ERS參與肝脂毒性的發(fā)生[40]。ERS本身是一把“雙刃劍”,長期或者過度的ERS會(huì)觸發(fā)凋亡,主要是活化CHOP和Caspase-12凋亡蛋白[41]。因此,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)變化可能和凋亡的發(fā)生有直接的關(guān)聯(lián)。由此可見,外泌體可通過影響ERS和凋亡參與肝脂毒性的發(fā)生,而高NEFA通過影響ERS介導(dǎo)的脂質(zhì)凋亡加劇肝脂毒性。綜上所述,外泌體通過ERS介導(dǎo)的脂質(zhì)凋亡可能是高NEFA血癥加劇肝脂毒性的主要原因。

3 小結(jié)

酮病的主要病理學(xué)特征之一是高NEFA血癥,高NEFA血癥可通過誘導(dǎo)ERS和脂質(zhì)凋亡,從而加劇其自身引起的肝脂毒性。在ERS和肝脂毒性的病理發(fā)生過程中酮病肝臟源外泌體發(fā)揮著重要作用。在不同作用條件下,大多數(shù)的組織細(xì)胞通過于組織間或外周循環(huán)系統(tǒng)中釋放含有外泌體的調(diào)節(jié)物質(zhì),對(duì)機(jī)體的變化起著遠(yuǎn)程調(diào)控的作用。高脂飲食條件下肝細(xì)胞源外泌體能加劇因肝脂毒和脂質(zhì)沉積異常,外泌體的miRNAs在細(xì)胞間傳遞著信號(hào),影響著受體對(duì)象脂質(zhì)合成氧化轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的表達(dá)和蛋白翻譯,這些為闡明ERS-脂質(zhì)凋亡通路提供理論依據(jù)。隨著目前研究手段得到相應(yīng)科技水平的支持,外泌體的研究已經(jīng)在很多領(lǐng)域開展,從其作為一種信號(hào)傳導(dǎo)分子及在很多疾病的早期診斷起重要作用,以及作為治療藥物的轉(zhuǎn)載工具等方面對(duì)其進(jìn)行了深入研究。當(dāng)然肝細(xì)胞源外泌體miRNAs在肝脂毒性的發(fā)生發(fā)展過程中起到的具體機(jī)制還不是很清楚,相信在研究ERS-脂質(zhì)凋亡信號(hào)通路在肝脂毒性加劇中起到的作用機(jī)制后能完善肝脂毒性發(fā)生的現(xiàn)象和為此繼發(fā)病理現(xiàn)象的原發(fā)疾病尋找治療靶點(diǎn)提供理論支持,如奶牛酮病。