覃衛(wèi)娟 吳曉寧 梁正義 周利艷 韋歡歡 謝麗

臨床微生物檢驗由于其知識體系涵蓋基礎(chǔ)、臨床及預(yù)防醫(yī)學(xué)等多學(xué)科范疇，涉及知識面廣，臨床實踐性強(qiáng)，是教學(xué)工作的重點與難點[1]。近年來多重耐藥菌的分離率不斷攀升[2-3]，是臨床抗感染治療的熱點和難點[4]，給臨床微生物檢驗工作和教學(xué)實習(xí)帶來新的挑戰(zhàn)與機(jī)遇，同時對臨床微生物工作人員和實習(xí)生提出了更高要求。以問題為基礎(chǔ)的教學(xué)法（problem-based learning，PBL）起源于加拿大高等教育[5]，屬于建構(gòu)主義學(xué)習(xí)理論的領(lǐng)域，是一種以學(xué)生為中心，以問題為基礎(chǔ)，教師引導(dǎo)的教學(xué)模式，通過臨床實際案例的學(xué)習(xí)，激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)的積極性和主動性，培養(yǎng)全面的臨床思維，增強(qiáng)臨床分析問題的能力。以案例為基礎(chǔ)的教學(xué)法（case-based learning，CBL）基于典型案例，首先由教師提出具有代表性的臨床案例，接著引導(dǎo)學(xué)員對案例進(jìn)行積極討論、分析，進(jìn)而讓學(xué)員對相關(guān)理論知識進(jìn)行掌握[6]。大量研究表明PBL 教學(xué)可以提高學(xué)生的學(xué)習(xí)積極性和主動性、知識的吸收理解能力、學(xué)習(xí)效率等[7-9]；而CBL 教學(xué)可以明顯提高臨床思維技能、創(chuàng)新能力、團(tuán)隊合作、師生互動等[10-12]。臨床微生物學(xué)檢驗知識比較繁瑣復(fù)雜，相關(guān)知識更新快，學(xué)校所學(xué)知識滯后于臨床應(yīng)用，為了激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)熱情，提高學(xué)習(xí)效果，將PBL 和CBL 教學(xué)法結(jié)合碧迪（Becton Dickinson，BD）Kiestra?WCA 全自動微生物流水線應(yīng)用于臨床微生物學(xué)檢驗實習(xí)教學(xué)中，同時培養(yǎng)學(xué)生的臨床思維能力和科研能力。

1 BD Kiestra? WCA 全自動微生物流水線工作原理與流程

臨床微生物檢驗結(jié)果直接影響臨床醫(yī)生的診斷和治療，BD 全自動微生物流水線可以為實習(xí)教學(xué)實踐提供更直觀的更深刻的體驗，吸引學(xué)生興趣，提高微生物實踐的記憶力。流水線使用滾動珠技術(shù)，比基于環(huán)的條紋多產(chǎn)生3～5 倍的分離菌落，消除了人工變異性和對亞培養(yǎng)的需要，這可能會縮短病原體鑒定和抗菌藥敏感實驗，同時能提供更高效、更準(zhǔn)確的檢測結(jié)果，改善實驗室工作流程，顯著縮短檢驗周轉(zhuǎn)時間（turn-around time，TAT）。BD Kiestra?WCA 微生物流水線由平板儲存與分選模塊、條碼打印模塊、接種劃線模塊、智能孵育箱模塊組成。接種劃線模塊配備有2 級生物安全柜，可保護(hù)帶教老師和學(xué)生的安全；臨床液體樣本，如血液、腦脊液、胸腹水、引流液、尿液、肺泡灌洗液，非液體標(biāo)本，如痰液、糞便、分泌物、拭子等均可接種劃線。接種后的平板通過軌道輸送到孵育箱進(jìn)行孵育，并按預(yù)設(shè)的時間節(jié)點進(jìn)行拍照，整個過程通過平板的條碼進(jìn)行追蹤和記錄。智能孵育箱配備了平板影像系統(tǒng)，可按照用戶自定義的時間點進(jìn)行多次拍照，可記錄平板上菌株的整個生長過程。根據(jù)光源和拍照模式的不同，可分別設(shè)置拍攝突出菌落和突出溶菌環(huán)的圖片并保存。智能孵箱模塊中的平板影像判讀系統(tǒng)：平板影像系統(tǒng)與傳統(tǒng)判讀最大的區(qū)別在于可以設(shè)定不同的精確的孵育時間，并進(jìn)行拍照影像保存，可實時觀察菌落的生長情況；拍照過程中平板亦不需要反復(fù)從孵箱拿進(jìn)拿出，通過閱板工作站的系統(tǒng)軟件，可將生長平板的高清圖片顯示在屏幕上供實驗人員判讀，減少了開蓋觀察平板的生物安全風(fēng)險，有報道微生物自動化流水線的應(yīng)用使實驗室生物安全管理及實驗室醫(yī)療廢物管理頻率減少10%～20%[13]。對于陽性標(biāo)本可直接在圖片上進(jìn)行標(biāo)記后續(xù)鑒定、分純、藥敏試驗、其他實驗操作等。對于陰性平板，在培養(yǎng)程序結(jié)束后，將被自動移出孵育箱并分類堆疊到指定卡位。對于待查閱平板，可實現(xiàn)從孵箱自動輸送到在線工作臺。平板影像系統(tǒng)可以永久保存菌落的圖像記錄，學(xué)生隨時查看各個歷史培養(yǎng)結(jié)果，利于隨時進(jìn)行教學(xué)。總之，BD Kiestra?WCA 全自動微生物流水線隨時可以進(jìn)行平板判讀，比較分析，更利于實習(xí)教學(xué)的展開。

2 臨床微生物檢驗實習(xí)模式

臨床微生物檢驗日常工作流程一般分為標(biāo)本接收、編號、標(biāo)本接種處理、涂片染色、閱片、血液培養(yǎng)、培養(yǎng)結(jié)果判讀、細(xì)菌的分離鑒定、抗菌藥物敏感試驗、結(jié)果報告、醫(yī)院感染監(jiān)測等多個崗位，其中的重點、難點就是培養(yǎng)結(jié)果判讀；同時臨床微生物實驗室日常工作量較大，學(xué)生實習(xí)周期有限，帶教老師如何在有限的時間里把理論知識、操作技巧及相關(guān)領(lǐng)域前沿進(jìn)展系統(tǒng)地講解給學(xué)生，讓學(xué)生領(lǐng)會掌握臨床微生物檢驗相關(guān)知識和技能，培養(yǎng)學(xué)生學(xué)習(xí)的自覺性、臨床思維和科研能力，是臨床微生物檢驗實習(xí)教學(xué)重點需要破解的難題。

3 將BD Kiestra? WCA 全自動微生物流水線融入臨床微生物檢驗教學(xué)實習(xí)

實習(xí)生在臨床微生物檢驗實習(xí)過程中會遇到各種各樣的細(xì)菌、真菌、支原體等，許多病原菌在教材上并沒有相關(guān)詳細(xì)知識點，特別是病原菌耐藥性快速增長以及未知病原體感染的問題。為了幫助學(xué)生在短暫的實習(xí)周內(nèi)掌握相關(guān)臨床微生物檢驗知識和技能，利用全自動微生物流水線平板影像系統(tǒng)拍照保存各種常見細(xì)菌、真菌、支原體以及各種常見病原菌少見表型、少見病原菌的生長過程，把拍照的生長過程圖片作為基本的教學(xué)素材；通過PBL 和CBL 教學(xué)法，有目的地引導(dǎo)學(xué)生把專業(yè)知識、臨床病癥以及文獻(xiàn)查閱相結(jié)合，激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)的興趣，通過對常見病原菌及少見菌進(jìn)行分析研究，從而培養(yǎng)學(xué)生的邏輯思維能力、科研思維以及臨床診斷思路分析的能力[14-15]，以達(dá)到高層次認(rèn)知學(xué)習(xí)目標(biāo)的目的。

3.1 各種常見病原菌的教學(xué)

臨床上引起感染的常見革蘭陰性桿菌有：大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、流感嗜血桿菌；革蘭陰性球菌有：卡他莫拉菌、淋病奈瑟菌；革蘭陽性球菌有：金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、屎腸球菌、無乳鏈球菌、肺炎鏈球菌等。多數(shù)情況下常見的病原菌在培養(yǎng)平板上的形態(tài)特征及生長特點和學(xué)生們在教材上認(rèn)識的一致，易于分辨及鑒定，但是在臨床工作中，經(jīng)常遇到同一種細(xì)菌會有各種各樣的表型，菌落特征甚至培養(yǎng)條件都與不一致。如同樣是大腸埃希菌在同一個平板上可以有3 種甚至更多的菌落形態(tài)，尤其是尿液標(biāo)本中最常遇到類似情況；如大腸埃希菌嗜二氧化碳型，生長需要CO2等[16]；這特殊情況在臨床微生物檢驗過程中易發(fā)生誤檢、漏檢等，給臨床工作帶來困難。利用全自動微生物流水線平板影像系統(tǒng)可以將各種病原菌常見表型和少見表型放在一起比較分析，如同時展示各種大腸埃希菌菌落形態(tài)：有β 溶血、無β 溶血，常規(guī)型、侏儒型菌落，粗糙干燥、光滑濕潤，黏液型、非黏液型等，讓學(xué)生加深理解，提高記憶，提高學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣。常見病原菌少見表型的鑒定及藥敏試驗，在教科書上甚至指南上沒有專門論述，所以需要大量的查閱文獻(xiàn)，并在實踐中總結(jié)經(jīng)驗。例如，嗜二氧化碳大腸埃希菌的鑒定和抗菌藥物敏感試驗[17]，通過PBL 與CBL 教學(xué)相結(jié)合鼓勵學(xué)生以病例為主線引導(dǎo)學(xué)生思考[18]：嗜二氧化碳的大腸埃希菌能否使用微生物全自動藥敏分析儀進(jìn)行藥敏試驗？嗜二氧化碳的大腸埃希菌產(chǎn)生的機(jī)制是什么？嗜二氧化碳的大腸埃希菌培養(yǎng)和藥敏有什么特殊要求？通過這些問題引導(dǎo)學(xué)生查閱資料，了解該菌特點。帶著問題出發(fā)，查閱文獻(xiàn)資料，學(xué)生的學(xué)習(xí)主動性會增強(qiáng)，同時又提高了學(xué)生的臨床思維和科研思維能力。

3.2 少見病原菌的教學(xué)

微生物檢驗工作中會時不時遇到各種少見病原菌，這些病原菌常常臨床診療的關(guān)鍵所在，如何把這些可遇不可求的少見病原菌教授給學(xué)生是微生物實習(xí)教學(xué)的難點，通過微生物流水線平板影像系統(tǒng)保存的圖片，可隨時給學(xué)生進(jìn)行展示學(xué)習(xí)，使少見病原菌變成“常見”，從而加深學(xué)生對少將病原菌的理解和認(rèn)識。使用CBL 和PBL 教學(xué)法，讓實習(xí)生對這些少見病原菌進(jìn)行案例分析，即可培養(yǎng)學(xué)生的臨床思維和科研能力。細(xì)菌、真菌會在血瓊脂平板上生長形成肉眼可見的菌落，而支原體營養(yǎng)要求高，一般檢測都是通過液體培養(yǎng)，教材上描述的人型支原體具有“油煎蛋”樣菌落，日常工作中極少能見到，但是人型支原體在血瓊脂平板上培養(yǎng)2～4 d 可見到細(xì)小透明的菌落生長[19]，通過全自動微生物流水線智能孵育箱中的平板影像系統(tǒng)，學(xué)生可看到支原體菌落特點和生長過程。如真菌培養(yǎng)，關(guān)于阿薩希毛孢子菌[20]的分類、培養(yǎng)特性、菌落特點、鏡下形態(tài)，在教學(xué)中可提出問題：（1）棉蘭染色在真菌鑒定中的意義？（2）阿薩希毛孢子菌鑒別要點有哪些、如何進(jìn)行鑒定?（3）阿薩希毛孢子菌感染如何治療？講課圍繞著標(biāo)本的采集、阿薩希毛孢子菌的檢驗、抗菌藥物敏感試驗，生物學(xué)特性、感染特點和治療過程等展開。同時講解各種感染類型，讓學(xué)生選擇一種感染類型如血流感染、尿路感染、皮膚軟組織感染等，查閱相關(guān)病歷和文獻(xiàn)，了解抗感染治療過程；通過這些學(xué)生就會理解臨床微生物檢驗的重要性，會對臨床微生物檢驗感興趣，增強(qiáng)職業(yè)責(zé)任感，從而培養(yǎng)學(xué)生的主動學(xué)習(xí)能力。學(xué)生通過對這種少見病原菌的學(xué)習(xí)，即掌握了阿薩希毛孢子菌的培養(yǎng)鑒別要點、生物安全意識和臨床意義，同時也培養(yǎng)了學(xué)生的臨床思維和科研思維能力，為今后參加臨床工作打下基礎(chǔ)。如關(guān)于膿腫分枝桿菌，指導(dǎo)學(xué)生針對全自動微生物流水線上保存有的膿腫分枝桿菌進(jìn)行案例分析，查閱文獻(xiàn)可知膿腫分枝桿菌是人類重要的致病菌，能夠引起人類多種感染，如皮膚軟組織膿腫[21]、肺膿腫[22]、毒血癥[23]等，同時制作幻燈片并進(jìn)行講解，從而加深學(xué)生對非結(jié)核分枝桿菌的理解，同時又培養(yǎng)學(xué)生的臨床思維和科研能力。

3.3 高致病性病原微生物的教學(xué)

在臨床微生物檢驗日常工作和實習(xí)帶教過程中，除了各種常見病原菌，還經(jīng)常遇到各種高致病性細(xì)菌、真菌等，如何把這些可遇不可求的病原菌展示給學(xué)生讓他們掌握，是每位微生物帶教老師心中迫切需要解決的難題。少見珍貴的病原菌更希望能保存菌落生長過程、形態(tài)特點等，鑒于生物安全，少見的高致病性病原菌如：馬爾尼菲藍(lán)狀菌、豬鏈球菌、布魯氏菌等無法保存病原菌菌落，觀察生長過程更無法實現(xiàn)，通過全自動微生物流水線智能孵育箱中的平板影像系統(tǒng)可以解決這些問題，平板在培養(yǎng)箱中孵育的同時即可拍照，不影響培養(yǎng)?？梢栽O(shè)置平板影像系統(tǒng)拍照時間，每2、4、6、12、24 h 等更多時長拍照平板上的菌落，實時記錄病原菌的生長過程，只要不結(jié)束平板在全自動微生物培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)，平板影像系統(tǒng)就可記錄，1 周甚至更長的培養(yǎng)過程都可記錄；如馬爾尼菲籃狀菌在沙氏培養(yǎng)基中24 h 一般肉眼無看不出產(chǎn)生酒紅色色素，一般72 h 后才能見到，有些甚至需要4～5 d 后才能產(chǎn)生酒紅色色素，這些特殊情況就微生物流水線平板影像系統(tǒng)就能記錄下來。通過平板影像系統(tǒng)記錄既可以保護(hù)教師和實習(xí)學(xué)生的安全，又不會錯過這些少見病原菌的生長過程。

3.4 紙片擴(kuò)散法抑菌圈測量的教學(xué)

紙片擴(kuò)散法抑菌圈測量是微生物檢驗實習(xí)中的重要內(nèi)容，不管如今的微生物自動化藥敏分析儀器有多么先進(jìn)，日常工作中的藥敏始終需要用紙片擴(kuò)散法來補(bǔ)充或復(fù)查才能發(fā)出滿足臨床需求，符合國家要求的藥敏報告。抑菌圈測量有很多注意事項，在實習(xí)過程中雖然教師都和學(xué)生說了，但是沒有實物展示給大家看，印象也就不深刻，有了微生物流水線就能解決這些問題。微生物流水線可以孵育并測量紙片擴(kuò)散法的抑菌圈，并把測量圖片保存下來，結(jié)合保存下來的圖片就可以和學(xué)生說明紙片測量抑菌圈中的特殊情況，如：紙片擴(kuò)散法中，抑菌圈內(nèi)有菌落應(yīng)檢查純度，純度高的情況下量取時不應(yīng)包括散在菌落；變形桿菌屬的遷徙生長應(yīng)忽略讀取生長抑制區(qū)域；出現(xiàn)雙圈若是細(xì)菌純應(yīng)量取內(nèi)圈；復(fù)方新諾明抑菌圈量取可以忽略20%的細(xì)菌生長[24]；這些特殊的紙片結(jié)果日常工作中不是每天都能遇到，通過流水線測量抑菌圈并保存圖片，學(xué)生可清晰地了解所謂的抑菌圈內(nèi)散在菌落、雙圈、變形桿菌屬生長抑制區(qū)域等是怎么回事。

臨床微生物室的工作多而繁雜，如何引導(dǎo)學(xué)生把基礎(chǔ)理論知識與實踐相結(jié)合，如何在實習(xí)中更有效地發(fā)揮基礎(chǔ)知識，在短時間內(nèi)內(nèi)掌握臨床微生物知識，是在教學(xué)設(shè)計過程中一直思考的問題。通過全自動微生物流水線把常見病原菌各種表型和各種少見病原菌進(jìn)行總結(jié)分析應(yīng)用于臨床微生物實習(xí)教學(xué)，具有較強(qiáng)的代表性、啟發(fā)性和可討論性，有助于學(xué)生理解。在實習(xí)帶教中，教師先講解各種常見病原菌、常見病原菌少見表型和各種少見病原菌的培養(yǎng)、鑒定、藥敏試驗、臨床意義；然后指導(dǎo)學(xué)生查閱文獻(xiàn)及資料進(jìn)行案例分析，結(jié)合患者臨床資料及文獻(xiàn)資料，探討常見及少見病原菌的流行病學(xué)特點、耐藥機(jī)制、致病機(jī)制、臨床意義等，并提出培養(yǎng)要求特點、鑒別要點及藥敏試驗方案，并制作成幻燈片。

4 教學(xué)效果

4.1 學(xué)習(xí)興趣提高，主動學(xué)習(xí)能力增強(qiáng)

在臨床微生物學(xué)檢驗實習(xí)過程中，通過全自動微生物流水線把常見病原菌表型以及各種少見病原菌融入教學(xué)中，指導(dǎo)學(xué)生進(jìn)行案例分析，能大幅度地提高學(xué)生學(xué)習(xí)臨床微生物知識的主動性和學(xué)習(xí)興趣。

4.2 基礎(chǔ)理論知識理解加深，記憶升華

臨床微生物檢驗實習(xí)是將在學(xué)校中學(xué)習(xí)到的理論知識轉(zhuǎn)變成實踐的過程，通過微生物流水線系統(tǒng)，聲圖并茂地對學(xué)生進(jìn)行講解、引導(dǎo)、提問，學(xué)生對理論基礎(chǔ)知識的理解更深刻，記憶更長久，實現(xiàn)了質(zhì)的升華。

4.3 臨床思維和科研思維能力提高

臨床微生物檢驗是和臨床聯(lián)系最緊密的專業(yè)，培養(yǎng)學(xué)生的臨床思維和科研思維能力具有重要的意義。把各種常見病原菌和少見進(jìn)病原菌引入教學(xué)可以同時培養(yǎng)學(xué)生實踐操作技能和臨床思維。少見病原菌和常見病原菌少見表型的培養(yǎng)鑒定、藥敏試驗和臨床意義在教科書上甚至指南上沒有專門論述，所以對少見表型菌株需要大量的查閱文獻(xiàn)進(jìn)行案例分析，并在實踐中總結(jié)經(jīng)驗，這個過程中學(xué)生的臨床思維和科研能力就會逐漸提高。

綜上所述，在整個教學(xué)過程中，將CBL 聯(lián)合PBL教學(xué)法結(jié)合全自動微生物流水線用于臨床微生物實習(xí)教學(xué)，可將臨床微生物檢驗、臨床診療等知識有效地結(jié)合起來，拓寬學(xué)生的知識面。少見病原菌和常見病原菌少見表型容易被漏檢或者誤檢，需要帶教老師有深厚的專業(yè)知識，不斷更新總結(jié)新知識，查閱文獻(xiàn)，對少見病原菌的培養(yǎng)特性、鑒定、臨床意義和抗菌藥物敏感試驗進(jìn)行熟悉掌握；需要帶教老師對臨床微生物檢驗知識具有較高的洞察力、理解能力及熱愛，從而激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)興趣。實習(xí)階段是學(xué)生們將理論知識轉(zhuǎn)化到臨床實踐的過渡階段，通過全自動微生物流水線把少見病原菌和常見病原菌少見表型融入臨床微生物檢驗實習(xí)教學(xué)中，能顯著提高學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣和學(xué)習(xí)主動性，并能培養(yǎng)學(xué)生的臨床思維和科研能力。常見病原菌和少見病原菌檢驗的臨床微生物檢驗教學(xué)還需要不斷地總結(jié)、實踐、探索，從而形成更完善、科學(xué)的臨床微生物檢驗實習(xí)教學(xué)模式。