戴文娜,粱好,趙丹丹,蘇超

(1.蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院 蕪湖市生命健康工程技術(shù)研究中心,安徽 蕪湖 241003;2.蕪湖市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所,安徽 蕪湖 241007)

桑葚又可稱(chēng)為桑果,在我國(guó)種植的桑葚種類(lèi)主要為黑桑、白桑、魯桑以及廣東桑等種類(lèi)[1]。桑葚的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富,其中不僅含有大量人體的必需氨基酸還存在大量的功能性成分,如黃酮、白藜蘆醇和花青素[2-3]。特別是花青素,其主要的生理作用為抗氧化、消炎以及保護(hù)視神經(jīng)[4]。花青素的提取方法有溶劑提取法、微波輔助提取法、超聲輔助提取法、酶輔助提取法以及低共熔溶劑提取法[5-7],而超聲輔助提取法因?yàn)榉椒ê?jiǎn)單、提取成本低且提取率高受到廣泛的應(yīng)用。因此,越來(lái)越多的研究者致力于該提取方法的工藝優(yōu)化。如陳俊樸[8]利用超聲輔助法提取紫大薯中的花青素,通過(guò)響應(yīng)面對(duì)條件進(jìn)行優(yōu)化后,最終花青素提取量達(dá)93.62 mg/100g;李玲[9]運(yùn)用超聲輔助法提取火龍果果皮中的花青素,提取量為159.14 mg/100g。本試驗(yàn)以桑葚果渣為原材料,運(yùn)用超聲輔助提取法,分別探究了料液比、超聲時(shí)間、乙醇濃度和超聲溫度4個(gè)因素對(duì)提取率的影響,通過(guò)響應(yīng)面分析優(yōu)化提取工藝,為提高桑葚果渣中花青素的提取率提供數(shù)據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

新鮮桑葚,購(gòu)買(mǎi)于京東平臺(tái);矢車(chē)菊3-O-葡萄糖苷,標(biāo)準(zhǔn)品;無(wú)水乙醇、碳酸氫二鈉、檸檬酸(分析純)購(gòu)買(mǎi)于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(GZX-9240A,上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司);超聲波清洗機(jī)(型號(hào):KQ3200DB,昆山市超聲儀器有限公司);電子分析天平(型號(hào):HZK-FA110S,華志電子科技有限公司);TD4臺(tái)式低速離心機(jī)(湖南凱達(dá)儀器有限公司);紫外分光光度計(jì)(型號(hào):UU759CRT,上海佑科儀器儀表有限公司)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 桑葚果渣預(yù)處理

取新鮮的桑葚在研缽內(nèi)進(jìn)行研磨,用紗布將汁水充分?jǐn)D出,隨后將桑葚置于50℃的烘箱中充分干燥,干燥結(jié)束后研磨成粉,過(guò)0.18 mm的篩網(wǎng),裝入密封袋,放在4℃冰箱中冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 提取工藝流程

桑葚果渣粉→加入乙醇→超聲波提取→離心(4000 r/min,15 min)→提取液稀釋(稀釋20倍)→樣品測(cè)定(最大吸收波長(zhǎng)520 nm[10])

2.3 桑葚果渣花青素的測(cè)定

2.3.1 矢車(chē)菊 3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 稱(chēng)取10 mg標(biāo)準(zhǔn)品,用緩沖液溶解并定容至50 mL容量瓶中,即獲得0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)矢車(chē)菊 3-O-葡萄糖苷母液。分別取 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL的標(biāo)準(zhǔn)矢車(chē)菊3-O-葡萄糖苷母液,加入10 mL緩沖液稀釋。用緩沖液作空白對(duì)照,用分光光度計(jì)在520 nm的波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度,以吸光度作為縱坐標(biāo),色素濃度作為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)?；ㄇ嗨卦跐舛葹?.02～0.1 mg/mL時(shí),回歸方程為y=15.809x+0.0086,R2=0.9992,線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.3.2 花青素得率的計(jì)算

式中: Y為花青素得率,% ;C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算得到的花青素質(zhì)量濃度,mg /mL;V為上清液體積,mL;N 為提取液稀釋倍數(shù);m為桑葚果渣質(zhì)量,g。

2.4 單因素試驗(yàn)

2.4.1 料液比對(duì)花青素提取率的影響 稱(chēng)取桑葚果渣1 g,分別加入5、10、15、20、25 mL濃度為60%的乙醇溶液,在60℃下超聲30 min。以4000 r/min 離心 15 min,取1 mL上清液用緩沖液定容至20 mL,在520 nm測(cè)定待測(cè)樣的吸光值。

2.4.2 超聲時(shí)間對(duì)花青素提取率的影響 稱(chēng)取桑葚果渣1 g,加入濃度為60%的乙醇溶液15 mL,在60℃下分別超聲10、20、30、40、50 min。其余步驟同2.5.1。

2.4.3 乙醇濃度對(duì)花青素提取率的影響 稱(chēng)取桑葚果渣1 g,分別加入濃度為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液15 mL,在60℃下分別超聲30 min。其余步驟同2.5.1。

2.4.4 超聲溫度對(duì)花青素提取率的影響 稱(chēng)取桑葚果渣1 g,加入濃度為60%的乙醇溶液15 mL,分別在40、50、60、70、80℃下超聲30 min。其余步驟同2.5.1。

2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果,設(shè)計(jì)了四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn),對(duì)花青素的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,試驗(yàn)因素水平表如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平表

2.6 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均平行測(cè)定3次,運(yùn)用Origin 8.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及作圖,運(yùn)用Design-Expert V.8.0.6處理和分析響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 料液比對(duì)桑葚果渣中花青素提取率的影響 由圖1可知,隨著料液比的不斷上升,花青素的提取率并不是一直增加,而是呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)料液比達(dá)到1∶15時(shí),花青素的提取率達(dá)到最大值0.507±0.013%。其原因主要為:當(dāng)乙醇用量逐漸增多時(shí),提高了桑葚果肉細(xì)胞壁里花青素的內(nèi)外濃度差,因此對(duì)花青素的溶出起到促進(jìn)的作用。當(dāng)花青素溶出量達(dá)到最大值時(shí),雖然乙醇用量仍然在增加,但是提取率并不會(huì)因此增加;并且因?yàn)槿軇┯昧吭龆?對(duì)花青素有一定稀釋作用,反而會(huì)出現(xiàn)花青素提取率下降的情況[11]。

圖1 料液比對(duì)花青素提取率的影響 圖2 超聲時(shí)間對(duì)花青素提取率的影響

3.2 超聲時(shí)間對(duì)桑葚果渣中花青素提取率的影響

如圖2所示,當(dāng)超聲時(shí)間在30 min內(nèi),隨著超聲時(shí)間的增加,花青素的提取效率也在提高,并且超聲時(shí)間為30 min時(shí),果渣中花青素的提取率達(dá)到最大值0.509±0.016%。但是,超聲時(shí)間繼續(xù)增加,花青素的提取率反而在下降。這是由于超聲波本身攜帶能量,超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)破壞花青素的結(jié)構(gòu),從而造成部分花青素分解。因此,桑葚果渣中花青素提取最適宜的超聲時(shí)長(zhǎng)為30 min。

3.3 乙醇濃度對(duì)桑葚果渣中花青素提取率的影響

如圖3所示,不同的乙醇濃度對(duì)花青素的提取率有較大的影響。當(dāng)乙醇濃度小于60%時(shí),提取率隨著濃度的增加而提高。雖然適量的水進(jìn)入桑葚細(xì)胞中可以促進(jìn)有效成分的提取,但是過(guò)多的自由水同樣會(huì)導(dǎo)致更多雜質(zhì)的溶解,這些雜質(zhì)會(huì)影響花青素的提取,這是低濃度乙醇環(huán)境下花青素提取率不高的主要原因。而當(dāng)乙醇濃度大于60%時(shí),提取率反而與濃度呈反比關(guān)系,這是由于過(guò)高的乙醇濃度會(huì)破壞花青素結(jié)構(gòu),降低了花青素的提取率。綜上所述,桑葚果渣中花青素提取最佳的乙醇濃度為60%,最大提取率可達(dá)0.537±0.013%。

圖3 乙醇濃度對(duì)花青素提取率的影響 圖4 超聲溫度對(duì)花青素提取率的影響

3.4 超聲溫度對(duì)桑葚果渣中花青素提取率的影響

如圖4所示,隨著超聲溫度逐漸上升,桑葚果渣中花青素提取率先增加后減少。當(dāng)超聲溫度為60℃時(shí),提取率最大為0.519±0.014%。溫度升高可以促進(jìn)花青素的溶解,但是溫度過(guò)高會(huì)破壞花青素的結(jié)構(gòu)造成提取率下降,因此提取的最適溫度為60℃。

4 響應(yīng)面結(jié)果分析

4.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

依據(jù)4個(gè)單因素結(jié)果,以料液比、超聲時(shí)間、乙醇濃度和超聲溫度為自變量,以花青素的提取率為響應(yīng)值進(jìn)行四水平三因素的響應(yīng)面試驗(yàn)。響應(yīng)面的試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果表

運(yùn)用Design-Expert對(duì)響應(yīng)面結(jié)果進(jìn)行分析,回歸方程的方差結(jié)果如表3所示,且回歸方程為:

Y(提取率)=0.55+6.417×10-3A+5.917×10-3B+0.04C-0.016D-8.5×10-3AB+0.021AC- 0.012AD-7.75×10-3BC-0.014BD+0.017CD-0.054A2-0.069B2-0.069C2-9.517×10-3D2

4.2 響應(yīng)面分析

響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖是可以更加形象地反映出各因素之間的交互作用對(duì)花青素提取率的影響,下面對(duì)通過(guò)回歸方差分析出的交互作用影響顯著的自變量進(jìn)行響應(yīng)面分析。圖5(a)和圖5(b)分別表示料液比與乙醇濃度的響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖,響應(yīng)面圖為一個(gè)開(kāi)口朝下且光滑的曲面,說(shuō)明在本次試驗(yàn)的提取條件下可以得出花青素提取率的最大值。等高線(xiàn)呈現(xiàn)橢圓形,表明料液比和乙醇濃度的交互作用較顯著。同時(shí),根據(jù)圖5(a)可以發(fā)現(xiàn),自變量C方向上的曲線(xiàn)坡度明顯要比自變量A方向上的更陡,這說(shuō)明乙醇濃度對(duì)提取率的影響要大于料液比對(duì)提取率的影響。

圖5 料液比與乙醇濃度的響應(yīng)面和等高線(xiàn)圖

圖6(a)和圖6(b)分別表示超聲溫度與乙醇濃度的響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖。由圖可知,當(dāng)超聲溫度和乙醇濃度不斷上升,花青素的提取率不斷提高,當(dāng)達(dá)到最大值后,雖然超聲溫度以及乙醇濃度仍然在增加,但是提取率在降低。圖6(b)的等高線(xiàn)呈橢圓性,說(shuō)明超聲溫度與乙醇濃度的交互作用是顯著的。此外,圖6(a)可以發(fā)現(xiàn),自變量C方向上的曲線(xiàn)坡度明顯要比自變量D方向上的更陡,這說(shuō)明乙醇濃度對(duì)提取率影響要大于超聲溫度對(duì)提取率影響,與4.1中的分析結(jié)果一致。

圖6 超聲溫度與乙醇濃度的響應(yīng)面和等高線(xiàn)圖

通過(guò)Box-Behnken試驗(yàn)得出的結(jié)果和回歸方程,可以得到超聲輔助提取桑葚果渣中花青素的最佳工藝條件為:料液比1∶15.93,超聲時(shí)間31.06 min,乙醇濃度62.09%,超聲溫度51.51℃,在該條件下預(yù)測(cè)的花青素提取率為0.563%?？紤]到實(shí)際實(shí)驗(yàn)的可操作性,將最佳的工藝條件修正為:料液比1∶15,超聲時(shí)間為30 min,乙醇濃度60%,超聲溫度50℃。在此提取條件下,通過(guò)3次重復(fù)試驗(yàn)得出最終花青素的提取率為0.542%,與預(yù)測(cè)值相接近,這表明此次優(yōu)化得出的花青素提取工藝條件是可行的。

5 結(jié)論

以桑葚果渣為提取原料、乙醇為提取劑,利用超聲輔助法提取原料中的花青素,分別探究了料液比、超聲時(shí)間、乙醇濃度和超聲溫度四個(gè)提取條件對(duì)提取率的影響,并且通過(guò)響應(yīng)面法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)實(shí)驗(yàn)和模型分析可以得出:4個(gè)提取條件對(duì)花青素提取率的影響大小順序?yàn)橐掖紳舛?超聲溫度>料液比>超聲時(shí)間;結(jié)合實(shí)際得出最佳提取工藝為料液比1∶15,超聲時(shí)間30 min,乙醇濃度60%,超聲溫度50℃,在該條件下花青素的實(shí)際提取率為0.542%,與預(yù)測(cè)值0.563%相接近,且與吳春燕等[12]在黑米花青素提取的研究結(jié)論基本一致,說(shuō)明此提取工藝具有可操作性。