于杰 姚剛 韓曉華 趙嵐

1煙臺市煙臺山醫(yī)院心血管內(nèi)科，煙臺 264000；2煙臺市煙臺山醫(yī)院外科重癥監(jiān)護病房，煙臺 264000；3青島大學基礎醫(yī)學院生理教研室，青島 266075

血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）是腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）的重要組成部分，存在于人體血管平滑肌、腎上腺皮質(zhì)球狀帶細胞、心臟、腎臟及腦器官中，過度激活的RAS 可升高血管組織局部AngⅡ水平，誘導血管平滑肌細胞（VSMC）增殖、遷移、細胞外基質(zhì)代謝紊亂，加速血管重構的形成、發(fā)展而升高血壓，抑制VSMC增殖是防治高血壓的重要環(huán)節(jié)［1-3］。鈣激活氯通道參與多種細胞生理功能，如心肌細胞靜息電位和動作電位形成、上皮細胞分泌、血管收縮、平滑肌收縮等，其中鈣激活氯通道蛋白1（ANO1）主要存在于血管，在胸主動脈、腦動脈、腸系膜動脈、門靜脈等均有分布［4-6］。ANO1 參與血管重構有較多報道，Lechartier 等［7］研究發(fā)現(xiàn)，ANO1 在肺動脈血管平滑肌高表達，通過促進VSMC 增殖、遷移參與肺動脈高壓的形成、發(fā)展；也有研究結果顯示，自發(fā)性高血壓大鼠ANO1蛋白表達顯著增加，應用ANO1抑制劑下調(diào)ANO1 蛋白表達后可舒張血管、降低血壓［8］。但ANO1與高血壓血管重構及ANO1抑制劑是否參與AngⅡ誘導的VSMC 增殖報道較少。鑒于此，本研究于2019 年7 月至2022 年6 月通過觀察ANO1 抑制劑干預后對AngⅡ誘導正常大鼠胸主動脈VSMC增殖的影響，以期為ANO1抑制劑的臨床應用及深入研發(fā)提供理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

材料與方法

1.材料

1.1.細胞株 大鼠胸主動脈平滑肌細胞A7r5 細胞株，購于美國ATCC公司。

1.2.主要試劑與儀器 AngⅡ、ANO1 抑制劑（A01）、β-actin 抗體購于美國ApexBio 公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購于美國Gibco 公司；一抗：EPK、AKT、CDK4、Cyclin D1，二抗：辣根過氧化物酶標記物購于美國Cell Signalin Technology 公司；磷酸緩沖液、多聚甲醛購于天津永大化學試劑開發(fā)中心；Hoechst 染色液、熒光淬滅劑購于上海碧云天生物技術有限公司，PMSE細胞裂解液購于北京康為世紀生物科技有限公司。CO2培養(yǎng)箱、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板、細胞計數(shù)板購于美國Thermo Electron Corporation 公司，無菌工作臺、倒置顯微鏡、ZT-Ⅱ型多頭細胞樣本收集器購于德國Carl Zeiss 公司，電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、顯影儀購于美國Bio Rad公司。

2.方法

2.1.細胞培養(yǎng) 大鼠胸主動脈平滑肌細胞A7r5 細胞株接種于含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，靜置使細胞充分貼壁，待細胞鋪滿瓶底90%時使用胰蛋白酶消化細胞使其成為單細胞懸液，以1∶3 的比例進行傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細胞進行后續(xù)試驗。

2.2.Hoechst 33342 熒光染色觀察ANO1 抑制劑干預后AngⅡ誘導的VSMC 形態(tài)學變化 取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的VSMC，在細胞培養(yǎng)瓶中調(diào)整胞懸液使?jié)舛葹?×105個/ml，于96 孔細胞培養(yǎng)板中接種，每組均設置6 個復孔，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h。分別加入10 nmol/L、100 nmol/L、500 nmol/L 濃度的A01，依次記為低劑量組、中劑量組、高劑量組，另取一組為對照組（等量生理鹽水干預），均在37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h，終止培養(yǎng)。棄去上清液后依次進行磷酸緩沖液洗滌、4%多聚甲醛固定、磷酸緩沖液再次洗滌、Hoechst 染色液染色，而后于每孔加入適量熒光淬滅劑并在熒光顯微鏡下觀察。細胞凋亡率=凋亡細胞數(shù)量/總細胞數(shù)量×100%。

2.3.蛋白免疫印跡法檢測ANO1抑制劑干預后AngⅡ誘導的VSMC 細胞凋亡相關蛋白的表達水平 分組及藥物干預同2.2，采用磷酸緩沖液洗滌不同濃度A01 作用后的大鼠胸主動脈平滑肌細胞，加入PMSE細胞裂解液并提取各組總蛋白，依次上樣、電泳、洗膜后加入1∶1 000 稀釋的兔抗人EPK、AKT、CDK4、Cyclin D1（一抗）孵育，4 ℃搖床并過夜；采用磷酸緩沖液漂洗3 次后加入辣根過氧化物酶標記的二抗稀釋液（1∶500），并進行ECL 化學發(fā)光，根據(jù)信號實際情況調(diào)整曝光時間，顯影、定影后掃描膠片，與對應的β-actin條帶光密度比值為EPK、AKT、CDK4、Cyclin D1 蛋白相對表達水平，重復3次，取平均值。

3.統(tǒng)計學分析

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05 提示差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1.ANO1抑制劑干預后AngⅡ誘導的VSMC形態(tài)學變化

Hoechst 33342 熒光染色結果顯示，隨著ANO1 抑制劑濃度增加，呈亮藍色的細胞愈來愈多（染色質(zhì)凝聚、出現(xiàn)凋亡小體），即細胞凋亡數(shù)量越多。低劑量組、中劑量組、高劑量組凋亡率分別為（17.60±1.36）%、（36.30±3.50）%、（61.25±6.33）%，均高于對照組凋亡率（4.32±0.51）%，組間差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），即AngⅡ誘導的VSMC增殖后凋亡與ANO1抑制劑濃度之間存在劑量依賴性。見圖1。

圖1 ANO1抑制劑干預后AngⅡ誘導的VSMC形態(tài)學變化。A為對照組，B為低劑量組，C為中劑量組，D為高劑量組

2.ANO1 抑制劑干預后AngⅡ誘導的VSMC 凋亡相關蛋白表達水平

蛋白免疫印跡法檢測ANO1 抑制劑干預后AngⅡ誘導的VSMC細胞凋亡相關蛋白結果顯示，不同組間EPK、AKT、CDK4、Cyclin D1蛋白相對表達量主效應差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與對照組比較，低劑量組、中劑量組、高劑量組EPK、AKT、CDK4、Cyclin D1 蛋白相對表達量均降低，且呈劑量依賴性，各組間差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。見表1、圖2。

表1 ANO1抑制劑干預后AngⅡ誘導的VSMC細胞凋亡相關蛋白表達水平（）

注：ANO1 為鈣激活氯通道蛋白1，AngⅡ為血管緊張素Ⅱ，VSMC 為血管平滑肌，A01 為ANO1 抑制劑。低劑量組、中劑量組、高劑量組分別加入10 nmol/L、100 nmol/L、500 nmol/L濃度的A01干預，對照組加入等量生理鹽水干預。與對照組比較，aP＜0.05；與低劑量組比較，bP＜0.05；與中劑量組比較，cP＜0.05

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討論

AngⅡ是血管重構過程中重要的血管活性物質(zhì)，可激活EPK、AKT、MAPK 等多條信號通路，促進DNA、VSMC 蛋白合成及細胞遷移［9-10］。VSMC 異常增殖、遷移誘發(fā)的血管重構是高血壓發(fā)病機制之一，而VSMC 又分為收縮型、合成型，其中收縮型VSMC 主要調(diào)節(jié)血管張力，血管活性物質(zhì)、炎癥因子、血流壓力和剪切力改變均可促進VSMC 由收縮型轉(zhuǎn)化為合成型，繼而分泌大量細胞外基質(zhì)，促進血管重構形成、發(fā)展［11-13］。本研究采用正常大鼠VSMC，探討了ANO1 抑制劑干預后對AngⅡ誘導的VSMC 增殖作用的影響，結果顯示：低劑量組、中劑量組、高劑量組凋亡率均高于對照組，即AngⅡ誘導的VSMC 增殖后凋亡與ANO1 抑制劑濃度之間存在劑量依賴性，提示ANO1 抑制劑可顯著抑制AngⅡ誘導的VSMC增殖作用。

既往研究報道，ANO1胞內(nèi)存在多個蛋白激酶磷酸化位點、胞外存在多個糖基化位點，不僅在細胞膜上發(fā)揮離子通道作用，還在細胞核膜或細胞器膜上同樣具有離子通道功能，與細胞增殖密切相關，也可調(diào)節(jié)相關因子分泌［14-16］。本研究結果：ANO1 抑制劑可顯著抑制AngⅡ誘導的VSMC 增殖作用，證實了ANO1 不僅參與血管舒張、收縮功能，還可能與各種血壓升高、血管重構密切相關。也有學者在低氧誘導的大鼠肺動脈高壓模型研究中發(fā)現(xiàn)，ANO1在肺動脈平滑肌細胞中高表達，且證實ANO1 是通過收縮血管、促進血管重構并參與肺動脈高壓的形成［17］。臨床可以ANO1 為作用靶點，進一步研究ANO1 抑制劑在血管重構誘發(fā)的不同疾病中的應用效果。激活EPK是細胞應對氧化應激時產(chǎn)生的保護反應；AKT是一種重要的抗凋亡因子，參與平滑肌細胞凋亡。本研究通過蛋白免疫印跡法檢測ANO1 抑制劑干預后AngⅡ誘導的VSMC細胞凋亡相關蛋白結果顯示，與對照組比較，低劑量組、中劑量組、高劑量組EPK、AKT 蛋白相對表達量均降低，且呈劑量依賴性，即ANO1 抑制劑干預后降低EPK、AKT 蛋白相對表達量意味著ANO1 抑制劑抑制AngⅡ誘導的VSMC增殖過程中，可能有EPK/AKT信號通路的參與。既往研究已發(fā)現(xiàn)ANO1 抑制劑可上調(diào)細胞周期負性調(diào)節(jié)蛋白，如p21、p27［18-19］。本研究進一步觀察ANO1 抑制劑對細胞周期正性調(diào)節(jié)蛋白的影響，其中CDK4是細胞周期G 期重要的調(diào)控因子，特異性結合Cyclin D1 后形成的復合物可使Rb蛋白蘇氨酸/絲氨酸殘基磷酸化，刺激E2F基因轉(zhuǎn)錄，參與細胞增殖、遷移［20-21］，ANO1 抑制劑拮抗CDK4、Cyclin D1 蛋白表達意味著ANO1 抑制劑可能是通過抑制細胞周期進程而抑制VSMC增殖。

綜上所述，ANO1 抑制劑可顯著抑制AngⅡ誘導的VSMC 增殖作用，其機制可能與抑制EPK/AKT 信號通路及細胞周期進程有關。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明于杰：論文撰寫，直接參與，工作支持；姚剛：直接參與；韓曉華、趙嵐：工作支持