武寒 徐磊 王苗苗 崔忠澤 吳淑華

濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，濱州 256600

胃癌是第5 種常見(jiàn)的惡性腫瘤，也是世界癌癥病死率的第3 大原因［1］。2018 年，世界范圍內(nèi)有1 033 701 例新病例和782 685例死亡與胃癌相關(guān)，其中多數(shù)在診斷時(shí)已處于局部晚期階段［2-3］。晚期胃癌的預(yù)后之所以較差，通常是因?yàn)樵缙谠\斷生物標(biāo)志物的不足和缺少有效的治療［4］。因此，胃癌的預(yù)防和控制已經(jīng)成為緊急的公共衛(wèi)生問(wèn)題，迫切需要研究其發(fā)生發(fā)展的潛在機(jī)制，找出新的治療和診斷靶點(diǎn)，最終提高患者的生存率。加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析法（weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）于2005年提出，并在官方網(wǎng)站上提供R數(shù)據(jù)包，可用于構(gòu)建加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，檢測(cè)基因模塊，將基因模塊與臨床特征相關(guān)聯(lián)，來(lái)鑒定模塊內(nèi)中心基因［5-7］。2023年1月至4月，在本研究中，筆者利用WGCNA 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)、蛋白互作網(wǎng)絡(luò)和生存預(yù)后，最終篩選出5 個(gè)預(yù)后相關(guān)基因，為進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志及胃癌診斷和治療的潛在靶點(diǎn)提供的理論依據(jù)。

資料與方法

1.數(shù)據(jù)的獲取與差異表達(dá)基因的確定

基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)GSE65801（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？acc=GSE65801）可從公開(kāi)的基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene Expression Omnibus，GEO）中搜索并下載。GSE65801 是基于GPL14550 平臺(tái)的表達(dá)譜，共包含64 個(gè)樣本，其中32 個(gè)為組織黏膜樣本，32 個(gè)為組織腫瘤樣本。應(yīng)用R 軟件鑒定差異表達(dá)基因（differently expressed genes，DEGs），并以|log2 FC|≥2.0 和矯正后P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.WGCNA

使用“WGCNA”R 包構(gòu)建胃癌和正常樣本中所有基因的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。首先對(duì)RNASeq 數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，降低異常值，軟閾值（β）由函數(shù)pickSoftThreshold 確定，并將最佳的powers 值保存在sft$powerEstimate，使構(gòu)建出的網(wǎng)絡(luò)更符合無(wú)尺度網(wǎng)絡(luò)標(biāo)準(zhǔn)。利用該加權(quán)相關(guān)系數(shù)，將相關(guān)矩陣變換為鄰接矩陣，進(jìn)而變換為拓?fù)渲丿B矩陣（topological overlap matrix，TOM）［8-9］。根據(jù)之前選定的軟閾值，將全部基因劃分為不同模塊，其中每個(gè)模塊至少包含50 個(gè)基因，并應(yīng)用動(dòng)態(tài)樹(shù)剪切法將相關(guān)性小于0.25 的模塊合并，將所有基因劃分為數(shù)個(gè)模塊。隨機(jī)選擇400個(gè)基因作為TOM 熱圖確定每個(gè)模塊中遺傳因子表示的相對(duì)獨(dú)立性和模塊之間的高度獨(dú)立性。最后，使用WGCNA 算法計(jì)算由每個(gè)模塊的基因和樣本組成的模塊特征基因（ME）的皮爾森相關(guān)系數(shù)和P值，選擇相關(guān)系數(shù)最高的模塊進(jìn)行后續(xù)分析。

3.基因本體論分析（gene ontology，GO）［10］、京都基因和基因組百科全書(shū)富集分析（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）［11］

通過(guò)構(gòu)建維恩圖（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）篩選最顯著共表達(dá)模塊的DEGs。使用R 包“org.Hs.eg.db”將基因名轉(zhuǎn)化為entrezlID，并使用R 包“clusterProfiler”“org.Hs.eg.db”“enrichplot”和“ggplot2”包進(jìn)行GO、KEGG。KEGG 是一個(gè)從高通量實(shí)驗(yàn)技術(shù)生成的大規(guī)模分子數(shù)據(jù)中了解高級(jí)功能和生物系統(tǒng)的數(shù)據(jù)庫(kù)資源，而GO是一個(gè)主要的生物信息學(xué)工具，用于注釋和分析基因的生物過(guò)程（BPs）、分子功能（MFs）和細(xì)胞成分（CCs），結(jié)果以前10位BPs、MFs、CCs和KEGG為基礎(chǔ)進(jìn)行可視化分析。

4.蛋白質(zhì)相互作用（PPI）分析及篩選預(yù)后相關(guān)基因

利用STRING 在線數(shù)據(jù)庫(kù)（Version 11.0，http：//string-db.org）在線將之前獲得的基因構(gòu)建成PPI 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)（minimum required interaction score＞0.4），然后輸出PPI網(wǎng)絡(luò)。 使用Cytoscape 軟件（Version 3.8.2，http：//www.cytoscape.org/）打開(kāi)在STRING 構(gòu)建的PPI 網(wǎng)絡(luò)，使用“MCODE”包篩選出PPI 網(wǎng)絡(luò)中的重要模塊，以其中最重要模塊的基因作為研究對(duì)象。在線分析網(wǎng)站GEPIA［12］（http：//gepia. cancer-pku. cn/）對(duì)最重要模塊中的基因采用Kaplan-Meier法進(jìn)行總生存（OS）和無(wú)病生存（DFS）分析，并以log-rank 法檢驗(yàn)。從結(jié)果中篩選出P＜0.05 的基因，這些差異表達(dá)的基因被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，篩選出兩種生存均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因作為預(yù)后相關(guān)基因。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用R 軟件（v.3.6.3）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.胃癌組織和正常組織的DEGs

在GSE65801 數(shù)據(jù)集中獲取到一個(gè)包含2 222 個(gè)DEGs的基因集（GSE65801_DIFF）。與正常組織相比，其中1 140 個(gè)基因在癌組織中表達(dá)下調(diào)，1 082 個(gè)基因表達(dá)上調(diào)（圖1）。

圖1 胃癌和正常組織的差異表達(dá)基因。A：熱圖；B：火山圖

2.對(duì)GSE65801數(shù)據(jù)集進(jìn)行WGCNA的結(jié)果

從GSE65801數(shù)據(jù)集中獲得核酸探針的矩陣，利用平臺(tái)文件GPL14550將探針名轉(zhuǎn)換為基因名，并對(duì)其基因表達(dá)量作標(biāo)準(zhǔn)化處理，最終得到的基因表達(dá)譜矩陣用于共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。本研究將所有樣本均納入WGCNA。為了更符合無(wú)尺度特征，選取11 作為β 值構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)（圖2A）。將剪切高度設(shè)置為0.25，合并模塊，根據(jù)TOM 矩陣檢測(cè)GSE65801，共發(fā)現(xiàn)12 個(gè)基因模塊（圖2B），隨機(jī)選取400 個(gè)基因繪制TOM 熱圖，確定每個(gè)模塊以及每個(gè)模塊中基因獨(dú)立存在（圖2C）。從模塊和性狀的熱圖中可發(fā)現(xiàn)，淡青色（lightcyan）模塊與GSE65801 中胃癌的相關(guān)性最高（圖2D）。計(jì)算淡青色模塊中基因MM 和GS 相關(guān)系數(shù)（cor=0.66，P=3.8e-115）以驗(yàn)證結(jié)果的可信度（圖2E）。因此，選用GEO_lightcyan模塊進(jìn)行后續(xù)研究。

3.GO與KEGG富集分析

通過(guò)構(gòu)建Venn 圖（GEO_DIFF 和GEO_lightcyan）得到375個(gè)基因作為最顯著模塊的差異基因，這些基因作為關(guān)鍵基因進(jìn)行后續(xù)分析（圖3A）。使用R 軟件富集分析結(jié)果顯示，這些基因主要富集到糖胺聚糖代謝、血管發(fā)育、上皮細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)因子刺激的反應(yīng)、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞粘附等功能，以及PI3K-Akt、MAPK、Ras 等關(guān)鍵信號(hào)通路（圖3B、C）。

4.關(guān)鍵基因篩選

構(gòu)建了375 個(gè)關(guān)鍵基因的PPI 網(wǎng)絡(luò)。使用Cytoscape 軟件得到最重要模塊有41 個(gè)基因（圖4）。通過(guò)預(yù)后分析，獲得了5 個(gè)預(yù)后相關(guān)基因：VCAN、SERPINE1、HGF、IGFBP7、FSTL3（圖5）。

圖4 對(duì)淡青色模塊基因進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用分析（橙色區(qū)域?yàn)樽钪匾δ苣K，綠色為其他基因）

圖5 GEPIA篩選預(yù)后相關(guān)基因。A、B、C、D、E：預(yù)后相關(guān)基因總生存分析；F、H、I、J：預(yù)后相關(guān)基因無(wú)病生存分析

討論

胃癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤。近年來(lái)，雖然已有胃癌病因?qū)W的相關(guān)研究，但其發(fā)展的確切機(jī)制仍有待探索。本研究通過(guò)在GSE65801 數(shù)據(jù)集中進(jìn)行WGCNA，獲得了12 個(gè)共表達(dá)模塊。選取出其中差異最顯著的共表達(dá)模塊進(jìn)一步篩選差異基因，最終得到375個(gè)關(guān)鍵基因。

通過(guò)富集分析，筆者發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵基因主要富集到糖胺聚糖代謝、血管發(fā)育、上皮細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)因子刺激的反應(yīng)、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞粘附等功能上，除此以外，還富集在PI3K-Akt、MAPK、Ras 等關(guān)鍵信號(hào)通路上。已有研究表明，在胃癌中，糖胺聚糖可通過(guò)多種途徑影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，從而影響患者預(yù)后［13］。血管發(fā)育是腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的必要條件之一［14］，而細(xì)胞的增殖與生長(zhǎng)是促進(jìn)腫瘤進(jìn)展不可或缺的因素［15］，二者可相互作用影響胃癌的進(jìn)展。眾多學(xué)者也已證明，PI3K-Akt［16-17］、MAPK［18-19］、Ras［20］等信號(hào)通路對(duì)研究胃癌發(fā)生機(jī)制具有重要意義。除此之外，筆者還發(fā)現(xiàn)這些基因亦富集到許多新的功能與通路上，這可能為進(jìn)一步探究胃癌發(fā)生發(fā)展規(guī)律、探索胃癌治療方法、改善患者生存提供新思路。

本研究將關(guān)鍵基因進(jìn)行PPI分析，并將最重要模塊中的基因進(jìn)行預(yù)后分析，最終鑒定出5 個(gè)預(yù)后相關(guān)基因：VCAN、SERPINE1、HGF、IGFBP7、FSTL3。通過(guò)在線網(wǎng)站GeneCsrds（https：//www.genecards.org/）檢索可知，VCAN 又被稱為Versican，可能參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化；SERPINE1作為尿激酶型纖溶酶原激活物抑制劑之一，可參與細(xì)胞粘附和擴(kuò)散的調(diào)節(jié)；HGF 可調(diào)節(jié)多種組織類型中的細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性和形態(tài)的發(fā)生；IGFBP7 是胰島素超家族的生長(zhǎng)促進(jìn)肽成員，可與胰島素結(jié)合對(duì)細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控；FSTL3是編碼卵泡抑素模塊蛋白家族的一種分泌糖蛋白。

Li 等［21］研究發(fā)現(xiàn)，VCAN 是影響胃癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。有研究表明，VCAN 的表達(dá)在胃癌中顯著增高，并與腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展密切相關(guān)［22］。在本研究中，VCAN 被富集到粘多醣代謝過(guò)程上，提示其可通過(guò)調(diào)節(jié)癌細(xì)胞生長(zhǎng)分化促進(jìn)胃癌進(jìn)展。Xu 等［23］研究證實(shí)，SERPINE1 可通過(guò)調(diào)節(jié)葡萄糖代謝來(lái)促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，分泌型SERPINE1 表達(dá)增加，可誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶1（MMP1）的表達(dá)并使結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)提高［24］。本研究發(fā)現(xiàn)，SERPINE1 被富集到血管生成相關(guān)通路上，這與Teng 等［25］研究結(jié)果一致，該研究發(fā)現(xiàn)SERPINE1 表達(dá)上調(diào)和激活VEGFR-2 信號(hào)通路最終促進(jìn)腫瘤血管生成，影響胃癌進(jìn)展。Gao 等［26］研究發(fā)現(xiàn)，HGF 表達(dá)可能與胃癌中血管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。Ding 等［27］進(jìn)一步證實(shí)，腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的HGF可通過(guò)PI3K/AKT和ERK1/2信號(hào)促進(jìn)胃癌血管化。本研究結(jié)果顯示，HGF被富集到血管發(fā)生、間充質(zhì)細(xì)胞分化等重要功能以及PI3K-Akt 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路等通路上，說(shuō)明HGF對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、信號(hào)傳導(dǎo)等過(guò)程具有重要意義。最新研究發(fā)現(xiàn)，IGFBP7 可作為膀胱癌的治療靶點(diǎn)［28］。IGFBP7 與肝細(xì)胞癌［29］、急性淋巴細(xì)胞白血病［30］、胃癌［31］等疾病均密切相關(guān)。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞分泌的IGFBP7 通過(guò)FGF2/FGFR1/PI3K/AKT 軸增強(qiáng)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)，從而促進(jìn)胃癌的發(fā)生［32］。本研究結(jié)果顯示，IGFBP7 被富集到細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)的功能上，表明調(diào)控IGFBP7有望成為胃癌調(diào)控的重要靶點(diǎn)。FSTL3在胃癌組織中高表達(dá)，并與總體無(wú)病生存期相關(guān)［33］。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)STL3 被富集到跨膜受體蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶信號(hào)通路、細(xì)胞粘附的正調(diào)控、調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)因子刺激的反應(yīng)等功能上，說(shuō)明其可通過(guò)多種途徑影響胃癌的發(fā)生。

綜上所述，本研究對(duì)GSE65801 數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中重要的功能模塊，并在胃癌關(guān)鍵功能模塊中篩選出5 個(gè)可作為胃癌預(yù)后生物標(biāo)志物或潛在治療靶點(diǎn)的預(yù)后相關(guān)基因：VCAN、SERPINE1、HGF、IGFBP7、FSTL3。這些基因及其所富集到的通路及功能可能為臨床研究提供新方向。然而，本文只是從生信水平進(jìn)行了初步分析，由于樣本量的限制、數(shù)據(jù)集來(lái)源存在一定的局限性，仍需擴(kuò)大樣本量分析并從多層面開(kāi)展分子機(jī)制、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等更深入的探究，進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明武寒：醞釀和設(shè)計(jì)試驗(yàn)，實(shí)施研究，采集數(shù)據(jù)，分析/解釋數(shù)據(jù)，起草文章，對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱，統(tǒng)計(jì)分析；徐磊：醞釀和設(shè)計(jì)試驗(yàn)，實(shí)施研究，分析/解釋數(shù)據(jù)，起草文章，對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱，統(tǒng)計(jì)分析；王苗苗：醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，實(shí)施研究，采集數(shù)據(jù)，對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱，統(tǒng)計(jì)分析；崔忠澤：醞釀和設(shè)計(jì)試驗(yàn)，實(shí)施研究，分析/解釋數(shù)據(jù)，對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱，統(tǒng)計(jì)分析；吳淑華：醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，分析/解釋數(shù)據(jù)，對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱，統(tǒng)計(jì)分析獲取研究經(jīng)費(fèi)，行政、技術(shù)或材料支持，指導(dǎo)，支持性貢獻(xiàn)