陶琳，王克強，王玫，梁軍，劉振興

（1.濟南市第二婦幼保健院1a:藥劑科，1b:器械科，山東濟南 271199；2.山東第一醫(yī)科大學附屬人民醫(yī)院2a:藥劑科，2b:創(chuàng)傷骨科，山東濟南 271199）

骨質(zhì)疏松癥是最常見的骨系統(tǒng)疾病之一，與骨折風險增加有關(guān)，并給患者帶來許多并發(fā)癥。隨著年齡的增長，這種疾病的患病率越來越高，已成為老年人的嚴重問題［1］。目前針對骨質(zhì)疏松的治療藥物主要為雙膦酸鹽類藥物、雌激素、維生素D 及鈣劑等，以抑制破骨細胞活性，減少骨破壞，并促進骨形成［2］。但其副作用也隨之突顯，特別是雙膦酸鹽類藥物引起的骨痛、頜骨壞死、腎損害等［3］。中醫(yī)藥正逐步成為治療骨質(zhì)疏松癥的主要方向［4］。

補腎益精是中醫(yī)學中防治骨質(zhì)疏松癥的一個重要原則［5］，右歸丸出自明代張景岳《景岳全書》新方八陣方，近年來在骨質(zhì)疏松的防治方面獲得深入研究［6，7］，可改善骨代謝及臨床癥狀，通過調(diào)節(jié)TGFβ 及AMPK/mTOR 等轉(zhuǎn)導通路，改善骨密度及骨代謝情況［8，9］。但右歸丸為溫補腎陽之方，性偏燥熱。本院在右歸丸的基礎(chǔ)上，結(jié)合現(xiàn)代人脾虛濕盛的體質(zhì)體征，添加參苓白術(shù)散中黨參、白術(shù)、薏苡仁等健脾利濕，炙龜板、紫河車、阿膠等益精填髓，取得良好臨床療效。本研究通過摘除卵巢大鼠建立骨質(zhì)疏松癥模型，探究補腎健脾、益精填髓方抗骨疏治療對大鼠骨代謝指標、骨密度及生物力學參數(shù)的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

48 只清潔級Wistar 大鼠，雌性，體重（200±50）g，4～5 個月齡，未曾交配。購自江蘇省試驗動物研究中心，許可證號SCXK（蘇）2016-00012。按照隨機分組方法，48 只大鼠分為假手術(shù)組、模型組、補益組和右歸組，每組12 只。

1.2 藥物制備

補腎健脾益精填髓灌味劑（補益）：按大鼠每百克體重1 g 藥量計算。熟地0.252 g、山藥0.126 g、菟絲子0.126 g、山茱萸0.090 g、枸杞0.090 g、杜仲0.126 g、當歸0.090 g、肉桂0.126 g、制附子0.126 g、紫河車0.126 g、阿膠0.126 g、黨參0.200 g、白術(shù)0.126 g、薏苡仁0.126 g、砂仁0.090 g（上述藥物均為顆粒劑，購于山東第一醫(yī)科大學附屬人民醫(yī)院藥房）；炙龜板0.128 g、鹿角膠0.126 g（山東第一醫(yī)科大學附屬人民醫(yī)院藥房）打碎、烊化，混合上述顆粒劑，加20 ml 水既得。

右歸丸灌味劑（右歸）：按大鼠每百克體重1 g藥量計算。熟地0.252 g、山藥0.126 g、菟絲子0.126 g、山茱萸0.090 g、枸杞0.090 g、杜仲0.126 g、當歸0.090 g、肉桂0.126 g、制附子0.126 g（上述藥物均為顆粒劑，購于山東第一醫(yī)科大學附屬人民醫(yī)院藥房）；鹿角膠0.126 g（山東第一醫(yī)科大學附屬人民醫(yī)院藥房）打碎、烊化，混合上述顆粒劑，加20 ml 水既得。

1.3 手術(shù)處理

腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，消毒無菌下在腹部雙側(cè)切開皮膚，假手術(shù)組動物不切除兩側(cè)卵巢，僅將卵巢周圍的脂肪切除；其他動物切除雙側(cè)卵巢。

1.4 藥物干預

術(shù)后2 周所有動物每日上午灌胃1 次，連續(xù)灌胃12 周。補益組和右歸組按每只大鼠每日用藥量為成人用藥量的6.3 倍計算，大鼠胃容量為0.875 ml/100 g。假手術(shù)組、模型組以等量的0.9% 氯化鈉溶液灌胃。

1.5 檢測指標

1.5.1 尿液標志物檢測

最后1 次灌胃干預后，每只大鼠單獨關(guān)入收集籠內(nèi)，收集前24 h 尿液。檢測尿鈣（Ca）、尿磷（P）濃度，并用尿Cr 校正尿液濃縮或稀釋對結(jié)果的影響。

1.5.2 血液標志物檢測

連續(xù)灌胃12 周后，靜脈麻醉狀態(tài)下剖腹，抽取主動脈取血，3 000 r/min 離心15 min，取上清血漿，-20℃保存。全自動生化分析儀檢測血清中堿性磷酸酶、鈣、磷、Ⅰ型前膠原氨基末端肽（PINP）、BMP-2 蛋白［10,11］。

1.5.3 骨密度檢測

連續(xù)灌胃12 周后，1% 戊巴比妥鈉麻醉，剝離股骨，PBS 溶液進行清洗，放入無菌EP 管中，做好標記冷藏保存。在室溫下平衡5 min，雙能線骨密度測定儀對股骨上端和全部股骨骨密度進行測定。

1.5.4 生物力學檢測

采用小動物骨骼強度測定儀（濟南益延科技發(fā)展有限公司）對股骨樣本進行三點測試，將兩側(cè)支架間距調(diào)整為2.5 cm，固定股骨兩端，進行扭轉(zhuǎn)剛度實驗。同樣固定股骨后用載荷機頭對骨干中間以2 mm/min 的速度進行三點彎曲試驗，并自動記錄計算出最大位移、強度、剛度等［12］。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，資料呈正態(tài)分布時，采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法；資料呈非正態(tài)分布時，采用秩和檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 動物一般情況

手術(shù)組大鼠切口愈合良好，未出現(xiàn)出血、感染。所有大鼠實驗期間飲食、飲水正常，無死亡大鼠。模型組大鼠毛發(fā)干枯、怠惰思臥、身體蜷曲、肢冷。補益組及右歸組大鼠毛法光亮、精神佳。實驗前各組間體重差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。處死時，各組大鼠體重均顯著大于實驗前（P＜0.05），其中假手術(shù)組、模型組、右歸組均顯著低于補益組（P＜0.05）。見表1。

表1 四組動物體重（g，±s，n=12）與比較Table 1 Comparison of animal body weight among four groups(g,±s,n=12)

指標實驗前處死時P 值假手術(shù)組258.3±16.8 364.6±14.5＜0.001模型組257.4±15.7 365.6±15.4＜0.001補益組258.8±11.9 415.7±15.3＜0.001右歸組256.1±15.7 379.3±14.2＜0.001 P 值0.992＜0.001

2.2 尿液標志物檢測

尿液檢測結(jié)果見表2，模型組尿Ca/Cr、尿P/Cr顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05）。右歸組Ca/Cr、P/Cr 與假手術(shù)組的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。補益組Ca/Cr、P/Cr 顯著低于右歸組和假手術(shù)組（P＜0.05）。

表2 四組動物檢測結(jié)果（±s，n=12）與比較Table 2 Comparison of urine and blood assay consequences among four groups(±s,n=12)

表2 四組動物檢測結(jié)果（±s，n=12）與比較Table 2 Comparison of urine and blood assay consequences among four groups(±s,n=12)

指標尿液檢測Ca/Cr P/Cr血液檢測s-Ca(mmol/L)s-P(mmol/L)ALP(U/L)PINP(pg/ml)BMP-2(pg/ml)假手術(shù)組模型組補益組右歸組P 值0.4±0.1 0.5±0.1 0.6±0.3 0.7±0.2 0.3±0.1 0.3±0.2 0.5±0.2 0.6±0.3 0.043＜0.001 2.4±0.1 76.4±6.1 128.6±10.4 238.9±18.6 15.8±0.2 2.4±0.2 76.4±5.2 193.4±9.2 186.5±20.3 10.5±0.1 2.4±0.3 76.2±6.5 110.4±9.8 235.9±18.6 15.7±0.3 2.3±0.2 77.4±5.6 128.9±8.5 207.6±21.1 13.2±0.4 0.577 0.931＜0.001＜0.001＜0.001

2.3 血液標志物檢測

血液檢測結(jié)果見表2，各組大鼠血Ca、P 濃度比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），模型組ALP 水平顯著高于其他組（P＜0.05）。右歸組、假手術(shù)組的ALP 水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。但補益組的ALP 水平顯著低于其他組（P＜0.05）。

除假手術(shù)組，其他組PINP、BMP-2 均有不同程度下降。模型組PINP、BMP-2 顯著低于其他各組（P＜0.05）。補益組PINP、BMP-2 濃度顯著高于右歸組（P＜0.05），而與假手術(shù)組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.4 骨密度與生物力學檢測

骨密度與生物力學檢測檢測結(jié)果見表3。模型組的骨密度、最大載荷、最大位移及剛度顯著低于其他組（P＜0.05）。補益組骨密度、最大載荷、最大位移顯著高于模型組、右歸組（P＜0.05），而與假手術(shù)組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。假手術(shù)組、右歸組、補益組的剛度差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表3 四組動物骨密度與生物力學檢測結(jié)果（±s，n=12）與比較Table 3 Comparison of results of bone mineral density and biomechanincal test among four groups (±s,n=12)

表3 四組動物骨密度與生物力學檢測結(jié)果（±s，n=12）與比較Table 3 Comparison of results of bone mineral density and biomechanincal test among four groups (±s,n=12)

指標骨密度(g/cm2)最大載荷(N)最大位移(mm)剛度(N/m)假手術(shù)組18.1±2.9 85.2±5.1 0.7±0.1 199.5±4.9模型組12.3±3.3 73.6±6.1 0.5±0.3 154.3±3.5補益組17.9±4.2 84.9±5.4 0.8±0.2 196.8±2.6右歸組15.1±3.2 75.3±6.1 0.6±0.1 195.6±4.2 P 值＜0.001＜0.001 0.003＜0.001

3 討 論

骨質(zhì)疏松癥屬中醫(yī)學“骨痿”、“骨枯”的范疇。在中醫(yī)理論中腎虛是骨質(zhì)疏松發(fā)生的根本原因。《素問·痿論》“腎主身之骨髓……骨枯而髓減，發(fā)為骨痿”，“腎者水臟也，今水不勝火，則骨枯而髓虛，故足不任身，發(fā)為骨痿”，故大部分中藥治療骨質(zhì)疏松集中于補腎壯骨方劑，如李智奎等［13］應用補腎活血方治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松，結(jié)果表明可降低CRP、TNF-α 及IL-6、10 的表達，同時抑制ALP、骨鈣蛋白、N 端骨鈣素，提高N 端骨鈣素水平，改善骨代謝平衡?，F(xiàn)代研究也發(fā)現(xiàn)一些補腎壯骨中藥不僅能夠抑制破骨細胞活性，而且部分藥物中存在植物類雌激素——黃酮類化合物，發(fā)揮雌二醇作用。如淫羊藿［14］、芹菜素［15］、骨碎補等［16］。但近年來研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生態(tài)與骨代謝存在顯著相關(guān)性［17］，腸道菌群的代謝產(chǎn)物——短鏈脂肪酸（SCFAs）通過降低腸腔內(nèi)的pH 值，增加鈣在大鼠結(jié)腸段的吸收［18］。該研究印證了中醫(yī)理論中關(guān)于“脾主運化”論述，“脾為后天之本”，主四肢肌肉。若脾胃虧虛，水谷精微化生不足，肌肉得不到水谷精微的充養(yǎng)，而腎失所藏，腎精不足，筋骨失養(yǎng)，則骨骼與肌肉協(xié)調(diào)性下降而骨痿不用［19］。本研究中右歸丸為基礎(chǔ)方藥，補腎壯骨，結(jié)合參苓白術(shù)散方義中的黨參、白術(shù)、薏苡仁等健脾，發(fā)揮調(diào)整腸道微生物環(huán)境的作用，最后添加大補精血的炙龜板、紫河車、阿膠等益精填髓，該方是中西醫(yī)理論結(jié)合的基礎(chǔ)組方，以脾腎兩臟虧虛為切入點，取得良好臨床效果。

研究結(jié)果顯示，實驗結(jié)束時，雖然各組大鼠血Ca、P 差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但補益組Ca/Cr、P/Cr 顯著低于其他組（P＜0.05），而右歸組Ca/Cr、P/Cr 與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。這可能與補益組中添加健脾中藥對腸道菌群的調(diào)節(jié)有關(guān)［20］。進一步研究顯示補益組大鼠PINP、BMP-2 水平顯著高于模型組、右歸組（P＜0.05），而與假手術(shù)組無顯著差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。BMP-2 是參與調(diào)控骨形成過程中的重要途徑之一，其中BMP-2 誘導成骨活性最強，是經(jīng)典BMPs/Smad通路的重要配體，不僅能誘導未分化的骨間質(zhì)細胞經(jīng)過趨化期、分化期、骨質(zhì)形成及重塑期4 個環(huán)節(jié)，而且在異位骨/軟骨形成過程中促進軟骨內(nèi)骨化［21］。葉大林等［22］將小鼠的BMP-2 基因敲除，發(fā)現(xiàn)其成骨細胞的功能以及骨骼發(fā)育均存在缺陷。本研究中補益組大鼠的BMP-2 水平顯著升高，提示補腎健脾、益精填髓法能夠顯著促進BMP-2 蛋白的分泌，從而調(diào)控骨細胞的增殖和分化，促進骨的正常和修復。PINP 是原膠原聚合形成I 型膠原過程中，去除下來的羧基端附加肽段，反映成骨細胞合成骨膠原的能力，為監(jiān)測成骨細胞活力和骨形成的重要指標［23］。補益組PINP、BMP-2 水平的增加，可能是由于有效的中藥成分作為一種良性的刺激，使BMP-2 與細胞膜上的受體BMPRⅠ、Ⅱ結(jié)合成復合物，被自身磷酸化所激活后，將信息傳遞到細胞核，通過對相關(guān)物質(zhì)加以轉(zhuǎn)錄促進骨髓基質(zhì)細胞分化成成骨細胞，增強了成骨細胞活性［24］。

對各組大鼠骨密度和生物力學指標分析結(jié)果顯示，模型組的骨密度、最大載荷、最大位移及剛度顯著低于其他組別（P＜0.05），而補益組的骨密度、最大載荷、最大位移顯著高于右歸組（P＜0.05），與假手術(shù)組無顯著差異。這反映了補益組在改善骨代謝、防止礦物質(zhì)丟失方面的作用效果。柴爽等［25］研究補腎、健脾、活血方劑干預骨質(zhì)疏松癥大鼠模型，亦發(fā)現(xiàn)其在改善大鼠骨密度方面能夠取得滿意的效果。

綜上所述，補腎健脾、益精填髓法具有對抗骨質(zhì)疏松的效果，且作用機制可能與其調(diào)整腸道微生態(tài)環(huán)境，減少骨礦物質(zhì)丟失，上調(diào)骨組織中BMP-2 表達，增加成骨細胞活性有關(guān)。