鄭高明 金育嬌 范超明

近年來(lái)，結(jié)核?。╰uberculosis，TB）發(fā)病呈上升趨勢(shì)，包括艾滋病在內(nèi)的免疫力低下人群以及重癥監(jiān)護(hù)室耐藥菌感染者是TB 發(fā)病的高危人群。世界衛(wèi)生組織發(fā)布的《2022 年全球結(jié)核病報(bào)告》顯示，2021 年全世界新發(fā)TB 患者1060 萬(wàn)例［1］。我國(guó)估算的新發(fā)結(jié)核病患者數(shù)為78.0 萬(wàn)，占全球結(jié)核病例的7.4%。結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）是結(jié)核病的病原體，單核巨噬細(xì)胞是消滅MTB 的“前線細(xì)胞”，活化的單核巨噬細(xì)胞吞噬并分解MTB，將MTB 抗原呈遞給T細(xì)胞，啟動(dòng)細(xì)胞免疫。但MTB 能通過(guò)各種機(jī)制長(zhǎng)期隱匿在單核巨噬細(xì)胞內(nèi)，二者之間的斗爭(zhēng)決定著疾病的轉(zhuǎn)歸［2］。p21 活化激酶5（PAK5）是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，通過(guò)與廣泛的細(xì)胞內(nèi)蛋白相互作用參與多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞活化、增殖、遷移等［3］。MTB感染患者時(shí)，單核細(xì)胞活化與PAK5 蛋白的關(guān)系尚不清楚。本文旨在評(píng)估肺結(jié)核患者外周血單核細(xì)胞活化與PAK5 的相關(guān)性，為借助PAK5 增強(qiáng)單核細(xì)胞活性輔助治療結(jié)核病提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017 年10 月至2023 年5 月杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院65 例確診為活動(dòng)性肺結(jié)核患者（結(jié)核組），以及65 例健康體檢者（對(duì)照組）。結(jié)核組納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥18 歲的活動(dòng)性肺結(jié)核患者；排除標(biāo)準(zhǔn)：免疫缺陷者、糖尿病、心血管疾病、其它感染性疾病和腫瘤?；顒?dòng)性結(jié)核是基于結(jié)核病相關(guān)的臨床癥狀和體征，及結(jié)核分枝桿菌病原學(xué)、病理學(xué)、影像學(xué)等檢查有活動(dòng)性結(jié)核診斷的證據(jù)，所有患者通過(guò)痰培養(yǎng)出結(jié)核分枝桿菌確診。結(jié)核組中男45 例，女20 例；年齡（51±20）歲。對(duì)照組中男35 例，女30 例；年齡（32±10）歲。

1.2 方法 （1）血常規(guī)檢測(cè)：空腹采集EDTA-K2 抗凝外周血，采用邁瑞B(yǎng)C-6900 全自動(dòng)血液分析儀（邁瑞，中國(guó)）檢測(cè)白細(xì)胞數(shù)量，檢測(cè)按儀器規(guī)程進(jìn)行。（2）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)：取EDTA-K2 抗凝全血100μL 加至流式分析管，溶血后洗滌，加入PBS 10μL、 5×Binding buffer 2.5μL，CD45-FITC 0.5μL，CD14-APC 0.5μL，HLA-DR-PB 熒光抗體0.5μL（BioLegend，美國(guó)），室溫避光孵育15 min，再加入二抗，室溫避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀（Navios，Beckman Coulter，美國(guó)）上機(jī)檢測(cè)單核細(xì)胞數(shù)量和比例。細(xì)胞固定后行透膜處理，加入PAK5 一抗（Abnova，中國(guó)臺(tái)灣）或兔源IgG 同型對(duì)照抗體（Invitrogen，美國(guó)），室溫避光孵育30 min，加入山羊抗兔IgG-AF488 二抗（Thermo，美國(guó)），室溫避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)單核細(xì)胞內(nèi)PAK5 蛋白。（3）熒光定量PCR 檢測(cè)：①單核細(xì)胞分離：取新鮮EDTA 抗凝全血2.5 mL，加入等體積PBS 稀釋全血；在15 mL 離心管中加入5 mL Ficoll 分離液（Biochrom，Germany），4℃ 1,000 g 離心30 min；吸取血漿與分離液之間的白膜層細(xì)胞至15 mL 離心管中，加入PBS 10 mL洗滌白膜層細(xì)胞，4℃ 250 g 離心10 min，棄上清液；加入Percoll 分離液4 mL（1.8 mL Percoll + 2 mL Minimal Essential Medium Eagle + 0.2 mL 10×Earle Balanced Salt Solution，Pharmacia，Germany），4℃ 420 g 離心30 min，收集中間層富集的單核細(xì)胞。②單核細(xì)胞RNA 提取和定量PCR：采用核酸提取純化試劑盒（湖南圣湘公司，中國(guó)），按說(shuō)明書(shū)要求提取并純化單核細(xì)胞總RNA。采用TAKARA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR037A），按說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行RNA 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。采用TAKARA 定量PCR 試劑盒（RR820A），按說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行熒光定量PCR 反應(yīng)，獲得靶基因PAK5 和ACTB（內(nèi)參基因）的Ct 值，并計(jì)算2-ΔΔCT值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。相關(guān)引物序列見(jiàn)表1。

表1 熒光定量PCR使用的引物

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS23.0 統(tǒng)計(jì)軟件。正態(tài)分布的計(jì)量資料采用（±s）表示，兩組比較用t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 單核細(xì)胞比例及單核/淋巴細(xì)胞比值 與對(duì)照組比較，結(jié)核組外周血中單核細(xì)胞占全部白細(xì)胞的比例11.1%±2.3%高于對(duì)照組單核細(xì)胞占比5.3%±1.4%，結(jié)核組外周血中單核/淋巴細(xì)胞比值（0.49±0.20）高于對(duì)照組單核/淋巴細(xì)胞比值（0.16±0.05），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.452，P＜0.001；t=9.870，P＜0.001）。見(jiàn)圖1。

圖1 兩組外周血單核細(xì)胞比例和單核細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比值

2.2 單核細(xì)胞活化比和活化數(shù) 結(jié)核組單核細(xì)胞活化比93.9%±4.6%高于對(duì)照組單核細(xì)胞活化比72.9%±15.2%，結(jié)核組單核細(xì)胞活化數(shù)（970±334）個(gè)/L 高于對(duì)照組（281±149）個(gè)/L，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.258，P＜0.001；t=11.511，P＜0.001）。見(jiàn)圖2。

圖2 兩組外周血單核細(xì)胞活化比和活化數(shù)

2.3 活化單核細(xì)胞的PAK5 蛋白表達(dá)陽(yáng)性率 結(jié)核組活化單核細(xì)胞PAK5 蛋白表達(dá)陽(yáng)性率84.71%±11.15%高于對(duì)照組75.33%±11.64%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.207，P=0.035）。見(jiàn)圖3。

圖3 兩組活化單核細(xì)胞PAK5蛋白表達(dá)陽(yáng)性率

2.4 活化單核細(xì)胞PAK5 基因mRNA 表達(dá)水平 結(jié)核組活化單核細(xì)胞PAK5 mRNA 表達(dá)水平（0.97±0.06）高于對(duì)照組（0.16±0.07），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.519，P＜0.001）。見(jiàn)圖4。

圖4 兩組活化單核細(xì)胞PAK5基因mRNA表達(dá)水平

3 討論

結(jié)核病是嚴(yán)重威脅全球公共衛(wèi)生的重大傳染病，防治形勢(shì)日趨嚴(yán)峻。MTB 是導(dǎo)致結(jié)核病的病原體，而單核巨噬細(xì)胞是機(jī)體抵抗MTB 感染的主要效應(yīng)細(xì)胞?；罨膯魏司奘杉?xì)胞不僅可啟動(dòng)固有免疫應(yīng)答，分泌炎性因子殺傷或直接吞噬MTB，還可以通過(guò)抗原遞呈作用，激活獲得性免疫應(yīng)答［2］。機(jī)體感染MTB 后，單核細(xì)胞可經(jīng)MCP-1、IFN-γ、TNF-α 等細(xì)胞因子刺激而活化，并向感染部位聚集，進(jìn)入組織發(fā)育為組織特異性巨噬細(xì)胞，獲得強(qiáng)大的吞噬殺菌能力，從而清除或攜帶MTB［4］。脂阿拉伯甘露聚糖（lipoarabinomannan，LAM）是MTB 細(xì)胞壁的一種糖脂，可與單核細(xì)胞膜上的Toll樣受體2（TLR2）結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)通路，誘導(dǎo)單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化［5］。而在感染早期，MTB分泌的小分子抗原CFP10、ESAT6 等也可與單核細(xì)胞表面結(jié)合，激活相應(yīng)的信號(hào)通路而活化單核細(xì)胞［6］?；罨膯魏司奘杉?xì)胞首先吞噬MTB，然后遷移至局部淋巴結(jié)，表達(dá)和通過(guò)MHC 分子遞呈抗原而激活T 細(xì)胞［7］，但MTB 也可以阻礙單核巨噬細(xì)胞抗原遞呈［8］，這些單核巨噬細(xì)胞不能殺滅細(xì)胞內(nèi)的MTB，且其顯著的遷移能力將有助于MTB 從感染部位向其它組織播散［9］。有研究發(fā)現(xiàn)，單核細(xì)胞膜上表達(dá)的模式識(shí)別受體，能幫其識(shí)別MTB 病原體相關(guān)分子模式而使其激活，活化后的單核巨噬細(xì)胞增加表面MHC I、MHC II 及協(xié)同刺激分子的表達(dá)，導(dǎo)致MTB 抗原更好遞呈給T 細(xì)胞，使得T 細(xì)胞對(duì)MTB 發(fā)揮更有效的殺傷作用［10］。同時(shí)活化的單核巨噬細(xì)胞也能通過(guò)產(chǎn)生一氧化氮（NO）、促進(jìn)吞噬小體向吞噬溶酶體及自噬溶酶體成熟等發(fā)揮著抗結(jié)核作用［11］。因此，單核細(xì)胞的活化對(duì)于機(jī)體清除MTB 非常重要。單核細(xì)胞活化的表面標(biāo)志物主要是HLA-DR、CD25、CD69 等。本研究結(jié)果顯示，結(jié)核患者外周血中單核細(xì)胞膜上的HLA-DR 等活化標(biāo)志物的表達(dá)陽(yáng)性率高于體檢健康者，提示結(jié)核患者單核細(xì)胞活化比更高，結(jié)核分枝桿菌可以通過(guò)某種信號(hào)通路激活單核細(xì)胞，誘導(dǎo)其向巨噬細(xì)胞分化，進(jìn)而參與機(jī)體對(duì)MTB 的殺滅和清除。

PAK5 是一個(gè)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，在多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮作用。研究表明，單核細(xì)胞活化與p65-NFκB 通路激活密切相關(guān)［12］，提示PAK5 蛋白可能通過(guò)磷酸化p65-NFκB，促進(jìn)HLA-DR 表達(dá)而活化單核細(xì)胞。本研究中，活動(dòng)性肺結(jié)核患者的外周血中單核細(xì)胞比例增高，這個(gè)現(xiàn)象可能是由于結(jié)核病時(shí)，血循環(huán)中的單核細(xì)胞被激活而募集到肺部形成肉芽腫來(lái)控制MTB 感染所致。此外，活動(dòng)性肺結(jié)核患者單核細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比值也增高，這可能是由于MTB 感染人體后，骨髓造血干細(xì)胞有著向髓系分化的傾向，導(dǎo)致髓系及淋巴系比例增高［13］。與體檢健康者相比較，活動(dòng)性肺結(jié)核患者外周血中的活化單核細(xì)胞的PAK5 蛋白表達(dá)陽(yáng)性率增高，同時(shí)PAK5 基因mRNA 表達(dá)水平增高，這進(jìn)一步提示PAK5 蛋白參與單核細(xì)胞活化，誘導(dǎo)單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化增殖，并向感染灶遷移，發(fā)揮消滅MTB 的生物學(xué)功能。

綜上所述，活動(dòng)性肺結(jié)核患者單核細(xì)胞比例、單核細(xì)胞活化比和活化數(shù)、PAK5 蛋白表達(dá)陽(yáng)性率和PAK5基因mRNA 表達(dá)水平均增高，提示結(jié)核分枝桿菌感染時(shí)，PAK5 蛋白具有促進(jìn)單核細(xì)胞向活化單核細(xì)胞轉(zhuǎn)變的潛能，這為今后通過(guò)PAK5 蛋白增強(qiáng)單核細(xì)胞功能控制結(jié)核病提供可能，且為目前抗結(jié)核輔助治療提供新的方向。