程輝 章俞昕 陳濱海 陳衛(wèi)建*

腎癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，以腎細(xì)胞癌為主，其中約70%為腎透明細(xì)胞癌（ccRCC），其預(yù)后差異較大，早期ccRCC 的預(yù)后較好，但相當(dāng)一部分患者在初診時已經(jīng)發(fā)生了轉(zhuǎn)移，其5 年生存率僅12%左右，故ccRCC 患者病死率仍然居高不下［1］。目前進展期ccRCC 的治療以靶向治療和免疫治療單用或聯(lián)合為主，為晚期不可切除及轉(zhuǎn)移性ccRCC 提供更多選擇，但耐藥的出現(xiàn)等局限性嚴(yán)重影響ccRCC 預(yù)后［2］。新靶點、新信號通路和相關(guān)生物標(biāo)志物的挖掘可能對ccRCC耐藥和免疫逃逸機制進行解釋，也為治療和預(yù)測預(yù)后帶來更精準(zhǔn)和多樣的選擇。炎癥是繼發(fā)于各種原因?qū)е碌慕M織損傷后的機體防御措施，是一種公認(rèn)的腫瘤危險因素［3］。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，炎癥參與包括細(xì)胞轉(zhuǎn)化、增殖、侵襲、血管生成和轉(zhuǎn)移等各個途徑，并有破壞免疫反應(yīng)、干預(yù)組織修復(fù)、參與表觀遺傳學(xué)的變化及影響藥物療效等作用［4］。本研究篩選ccRCC 的炎癥相關(guān)基因，并構(gòu)建具有獨立預(yù)后價值的預(yù)后模型風(fēng)險評分，并進行驗證。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集 從TCGA 數(shù)據(jù)庫下載ccRCC 的轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)及臨床資料，共下載611 個樣本，其中包含539 個腎透明細(xì)胞癌組織和72 個正常組織。采用Active Perl（版本5.26，64-bit）對基因表達數(shù)據(jù)和臨床資料進行提取和整理。

1.2 數(shù)據(jù)分析 （1）炎癥相關(guān)基因差異表達分析：使用R 軟件包limma、ggplot2、pheatmap 對腫瘤組與正常組數(shù)據(jù)進行DEGs 的表達分析和可視化處理。（2）建立預(yù)后風(fēng)險模型：通過R 軟件包“survival”對炎癥相關(guān)的DEGs 進行單因素COX 回歸分析。通過多因素COX回歸分析建立預(yù)后風(fēng)險模型并構(gòu)建風(fēng)險評分公式，然后根據(jù)中位數(shù)將患者分為高風(fēng)險組和低風(fēng)險組，采用R 軟件包“regplot”繪制列線圖對預(yù)后模型進行可視化。（3）預(yù)后模型評價：采用 Kaplan-Meier 生存曲線分析高風(fēng)險組及低風(fēng)險組的生存差異。在單因素和多因素COX回歸模型中納入風(fēng)險評分及臨床病理因素，如TNM 分期、組織分級、病理分期、年齡（≤65 歲，>65 歲）和性別，以分析影響ccRCC 患者生存的因素，并采用ROC 曲線評估預(yù)后風(fēng)險模型的準(zhǔn)確性。（4）預(yù)后模型驗證：采用SPSS 軟件將ccRCC 樣本隨機分為訓(xùn)練集與測試集，根據(jù)風(fēng)險評分分為高風(fēng)險組與低風(fēng)險組，采用Kaplan-Meier 生存曲線、ROC 曲線對預(yù)后風(fēng)險模型進行驗證。（5）功能分析：通過GSEA 軟件進行GO 富集分析、KEGG 集分析，以此來比較預(yù)后風(fēng)險模型所分類的亞組間基因功能和途徑的差異。（6）免疫分析：基于R軟件包“GSVA”對亞組間的免疫細(xì)胞功能差異進行分析?；贑ibersort 算法對亞組間的免疫檢查點進行差異分析。使用ESTIMATE 算法估計腫瘤組織中的基質(zhì)和免疫細(xì)胞計算基質(zhì)評分、免疫評分和腫瘤純度。

2 結(jié)果

2.1 ccRCC 組織與正常組織間炎癥相關(guān)DEGs 的鑒定 從TCGA 數(shù)據(jù)庫中提取611 個樣本數(shù)據(jù)，包括539個ccRCC 組織和72 個正常組織，比較其中188 種與炎癥相關(guān)的基因表達水平，并由此鑒定出包括ABCA-1，ADM 在內(nèi)的113 種DEGs（P＜0.05），其中表達上調(diào)的DEGs 有96 個，下調(diào)的有17 個。見圖1。

圖1 A. 火山圖（紅色為上調(diào)基因，綠色為下調(diào)基因）；B. 正常組織（N，藍(lán)色）和腫瘤組織（T，紅色）間的炎癥相關(guān)DEGs分布熱圖

2.2 炎癥相關(guān)DEGs 預(yù)后風(fēng)險評分模型的建立 共得到526 個ccRCC 樣本。單因素COX 回歸分析顯示113個炎癥相關(guān)DEGs 與ccRCC 預(yù)后存在相關(guān)性（P＜0.01），從而初步篩選出與該腫瘤生存相關(guān)的炎癥基因。見圖2A，共獲得39 個與ccRCC 預(yù)后相關(guān)的炎癥基因，其中APLNR、BTG2、CALCRL、CX3CL1、EDN1、TACR1、TLR3 這7 個基因與ccRCC 較好的預(yù)后相關(guān)（HR＜1），可能是保護性基因，而包括AQP9、AXL 在內(nèi)的32 個基因則與ccRCC 較差的生存相關(guān)，可能是高風(fēng)險基因。對這39 種炎癥基因進行多因素COX 比例風(fēng)險回歸分析，見圖2B，10 種炎癥基因可能是ccRCC 的獨立預(yù)后因子，其中包括APLNR、BTG2、CX3CL1、SPHK1 在內(nèi)的四個基因是ccRCC 良好預(yù)后的獨立預(yù)測因素，而CSF1、GABBR1、HAS2、ICAM1、P2RY2、TIMP1 等6個基因是ccRCC不良預(yù)后的獨立預(yù)測因素，并構(gòu)建風(fēng)險評分公式如下：（-0.0153×APLNR）+（-0.0073×BTG2）+0.0225×CSF1+（0.0107×CX3CL1）+0.1888×GABB R1+0.1528×HAS2+0.0088×ICAM1+0.3952×P2RY2+（-0.0442×SPHK1）+0.0006×TIMP1。對526 個ccRCC樣本按該公式打分，以中位數(shù)作為閾值，將樣本分為高低風(fēng)險兩組，每組263 個樣本。對高低風(fēng)險組進行Kaplan-Meier 生存分析，結(jié)果顯示高風(fēng)險組生存率低于低風(fēng)險組（P＜0.001），見圖2C。根據(jù)計算的風(fēng)險評分，將樣本分為高、低危組，與低危組相比，隨著風(fēng)險評分的升高，高危組患者死亡人數(shù)更多，生存時間更短，見圖2D?；诩{入樣本生存狀態(tài)的散點圖見圖2E。不同臨床特征及炎癥基因在不同亞組間的表達以熱圖形式見圖2F，其中APLNR、BTG2、CX3CL1 在低風(fēng)險評分組中富集表達，CSF1 等7 個基因則傾向于在高風(fēng)險組中高表達。且更高的風(fēng)險評分對應(yīng)更晚的TNM 分期和組織學(xué)分級。同時，為了提高預(yù)后風(fēng)險評分模型結(jié)果的可視化效果，構(gòu)建一個臨床病理因素與風(fēng)險評分的列線圖，見圖2G，結(jié)果顯示，高風(fēng)險組對應(yīng)更高的評分，意味著更短的生存時間及更差的預(yù)后。

圖2 A. 炎癥相關(guān)DEGs與ccRCC 預(yù)后的單因素COX回歸分析；B. 炎癥相關(guān)DEGs與ccRCC預(yù)后的多因素COX回歸分析；C. 高風(fēng)險和低風(fēng)險組患者總生存的Kaplan-Meier曲線；D.基于納入樣本的風(fēng)險評分的風(fēng)險曲線；E. 基于納入樣本生存狀態(tài)的散點圖（綠點和紅點分別表示生存和死亡）；F. 高風(fēng)險和低風(fēng)險組臨床特征和炎癥相關(guān)DEGs的熱圖（藍(lán)色代表低風(fēng)險組，紅色代表低風(fēng)險組，而紅色代表高表達，綠色代表低表達）；G. 基于臨床病理因素和風(fēng)險評分的列線圖

2.3 預(yù)后風(fēng)險評分模型的獨立預(yù)后價值 單因素COX回歸分析顯示，年齡、分級、階段、TNM 分期、風(fēng)險評分（P＜0.001，HR=1.157）均與ccRCC 的預(yù)后相關(guān)，見圖3A。多因素回歸分析顯示風(fēng)險評分是ccRCC 預(yù)后不良的獨立預(yù)后因素（P＜0.01，HR=1.100），見圖3B。ROC 曲線評估預(yù)后風(fēng)險評分模型的預(yù)測價值。曲線下面積（AUC）為0.770，具有良好的預(yù)測價值。為評估預(yù)后風(fēng)險評分模型的預(yù)測精度，分別在第1、3、5 年進行ROC 分析，其AUC 分別為0.770，0.742，0.757，見圖3C。多指標(biāo)ROC 曲線分析各臨床因素對ccRCC 5 年生存預(yù)測價值，其中該預(yù)后風(fēng)險評分模型ROC 曲線的AUC 值最高，為0.757，提示該預(yù)后風(fēng)險評分模型預(yù)測預(yù)后能力良好，見圖3D。

圖3 A. 臨床因素（包括預(yù)后風(fēng)險評分模型）與ccRCC總生存之間的單變量COX回歸分析；B. 臨床因素（包括預(yù)后風(fēng)險評分模型）與ccRCC總生存之間的多變量COX回歸分析；C. 基于預(yù)后風(fēng)險評分模型的第1、3、5年總生存的ROC曲線分析；D. 多指標(biāo)ROC曲線分析

2.4 預(yù)后風(fēng)險評分模型的驗證 將526 名ccRCC 樣本隨機分為訓(xùn)練集與測試集。根據(jù)風(fēng)險評分公式計算訓(xùn)練集和測試集中ccRCC 患者的風(fēng)險評分，按照中位風(fēng)險評分值將訓(xùn)練集和測試集的患者分為高風(fēng)險或低風(fēng)險組（見圖4A、B），并對訓(xùn)練集和測試集樣本的生存狀態(tài)分別進行了分析（見圖4C、D），訓(xùn)練集和測試集生存狀態(tài)分布基本與整體一致，即低風(fēng)險組相對高風(fēng)險組在一段時間的隨訪后展現(xiàn)出更優(yōu)的生存率和更長的生存時間。KM 生存曲線分析顯示，訓(xùn)練集與測試集中兩個風(fēng)險組間的總生存率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）（見圖4E、F），高風(fēng)險組生存率低于低風(fēng)險組。1 年、3年和5 年生存的AUC 在訓(xùn)練集中分別為0.763、0.705、0.730，在測試集中分別為0.780、0.784、0.781（見圖4G、H）。

圖4 A. 基于訓(xùn)練集風(fēng)險評分的風(fēng)險曲線；B. 基于測試集風(fēng)險評分的風(fēng)險曲線；C. 訓(xùn)練集的生存狀態(tài)分布圖；D. 訓(xùn)練集的生存狀態(tài)分布圖；E. 訓(xùn)練集總生存的 KM生存曲線；F. 測試集總生存的 KM生存曲線；G. 訓(xùn)練集總生存的時間相關(guān)ROC曲線；H. 測試集總生存的時間相關(guān)ROC曲線

2.5 基于預(yù)后風(fēng)險評分模型的Gsea GO 分析結(jié)果分為生物過程（BP），細(xì)胞組分（CC），生物功能（MF）三個方面，GO 分析顯示（見圖5A），在高危組中，纖毛運動，微管束形成，細(xì)胞因子活性，纖毛或鞭毛依賴性細(xì)胞運動，減數(shù)分裂I 細(xì)胞周期過程富集，對比之下，細(xì)胞頂端脂質(zhì)氧化，頂端質(zhì)膜，微體，腎系統(tǒng)過程等在低風(fēng)險組樣本中富集。鑒定KEGG 通路（見圖5B），發(fā)現(xiàn)同源重組，α 亞麻酸代謝，甘油磷脂代謝在高風(fēng)險組富集，而加壓素調(diào)節(jié)水重吸收、過氧化物酶體、近端小管再吸收、纈氨酸亮氨酸和異亮氨酸降解、脂肪酸代謝等通路則被發(fā)現(xiàn)在低風(fēng)險組富集。

2.6 高風(fēng)險組與低風(fēng)險組在ccRCC 微環(huán)境及腫瘤異質(zhì)性的差異，高危組和低危組在APC 共刺激、內(nèi)生肌酐清除率、檢查點、溶細(xì)胞活性、人類白細(xì)胞抗原、炎癥促進、副炎癥、T 細(xì)胞功能包括共抑、共刺激以及II型干擾素反應(yīng)有顯著差異，除II 型干擾素反應(yīng)外，高風(fēng)險組其余9 種免疫通路活性均高于低分險組（見圖6A）。基于TIMER、CIBERSORT、QUANTISEQ、MCP counter、XCELL、EPIC 繪制免疫應(yīng)答熱圖（見圖6B）。免疫檢查點是免疫細(xì)胞表達的分子標(biāo)志物，是腫瘤微環(huán)境的一部分，鑒于當(dāng)前ccRCC 治療中免疫檢查點抑制劑的重要性，進一步分析兩組免疫檢查點表達的差異（見圖6C），結(jié)果顯示高低風(fēng)險組在36 個免疫檢查點的表達差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，除HHLA2、KIR3DL1、TNFSF18、NRP1 表達在低風(fēng)險組中較高外，其余包括PD-1、CTLA-4、LAG3、BTLA、TIGIT 在內(nèi)的32 個免疫檢查點在高風(fēng)險組表達量均高于低風(fēng)險組。ccRCC 腫瘤微環(huán)境的差異在宏觀上構(gòu)成腫瘤的異質(zhì)性。為進一步判斷腫瘤樣本的異質(zhì)性，判斷腫瘤微環(huán)境中非腫瘤細(xì)胞的浸潤差異，利用ESTIMATE 工具評價了高風(fēng)險與低風(fēng)險組樣本中的腫瘤純度。ImmuneScore 顯示，ccRCC 中高風(fēng)險組的免疫細(xì)胞含量高于低風(fēng)險組（P＜0.001）（見圖6D），而StromalScore 則顯示兩組間的基質(zhì)細(xì)胞沒有差異（見圖6E）。ESTIMATE score 顯示綜合得分高風(fēng)險組高于低風(fēng)險組（見圖6F）。通過ESTIMATE score 計算腫瘤純度，結(jié)果顯示高風(fēng)險組腫瘤純度較低風(fēng)險組低，異質(zhì)性更大（見圖6G）。

圖6 A. 低風(fēng)險組和高風(fēng)險組在13種免疫途徑中的富集；B. 低風(fēng)險和高風(fēng)險組的免疫應(yīng)答熱圖；C. 36個免疫檢查點在低風(fēng)險和高風(fēng)險人群中的基因表達；D.低風(fēng)險和高風(fēng)險組的免疫評分；E. 低風(fēng)險和高風(fēng)險組的基質(zhì)評分；F. 低風(fēng)險和高風(fēng)險組的ESTIMATE評分；G. 低風(fēng)險和高風(fēng)險組的腫瘤純度

3 討論

ccRCC 是腎細(xì)胞癌中最常見的亞型，進展期治療方法主要為靶向治療和免疫治療，其部分改善患者生存，但后線治療選擇缺乏加上療效欠佳，其死亡率仍居高不下［5-6］。目前分子生物學(xué)和癌癥基因組學(xué)的發(fā)展為晚期ccRCC 治療帶來希望，但仍缺乏良好的預(yù)后模型，以預(yù)測ccRCC 的預(yù)后并為有潛力的相關(guān)治療靶點的篩選帶來啟示［7］。ccRCC 作為一種異質(zhì)性較高的瘤種，與單一生物標(biāo)志物相比，將多個相關(guān)基因標(biāo)志物納入同一預(yù)后模型，可以提高對預(yù)后預(yù)測的準(zhǔn)確性［8］。炎癥被發(fā)現(xiàn)在癌癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，有研究顯示癌細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞與炎性細(xì)胞相反應(yīng)，形成炎性腫瘤微環(huán)境（TME），因其強大的可塑性，能夠動態(tài)干預(yù)腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移等途徑，其成員基因在ccRCC 中的生物標(biāo)志物作用也在逐漸被揭示［9-10］。

本研究中，應(yīng)用TCGA 數(shù)據(jù)庫篩選出10 個ccRCC的獨立預(yù)后炎癥相關(guān)基因，目前有研究揭示其中部分基因與ccRCC 預(yù)后相關(guān)，APLNR 在高級別、高分期和轉(zhuǎn)移性ccRCC 腫瘤中表達降低，與腫瘤的侵襲性呈負(fù)相關(guān)［11］；BTG2 與ccRCC 負(fù)相關(guān)，過表達BTG 2 可抑制人ccRCC 的增殖、遷移和侵襲［12］；而CSF1 的高表達會導(dǎo)致腎切除術(shù)后ccRCC 患者復(fù)發(fā)和預(yù)后不良等［13］。構(gòu)建預(yù)后模型風(fēng)險評分公式，并對該模型中的高低風(fēng)險人群進行分層分析，結(jié)果顯示低風(fēng)險組生存時間更長，證實了該預(yù)后風(fēng)險評分模型對ccRCC 的預(yù)后有獨立且較穩(wěn)定的預(yù)測價值，在遠(yuǎn)期預(yù)后的預(yù)測方面優(yōu)于其他臨床特征，并對其進行內(nèi)部驗證。

基于該預(yù)后風(fēng)險評分模型，進行基因富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在GO 分析中高風(fēng)險組主要富集于細(xì)胞器的形成和細(xì)胞周期中，當(dāng)前研究揭示部分環(huán)節(jié)和腫瘤發(fā)生的關(guān)系，如纖毛由微管核心軸突構(gòu)成作為一種孤立細(xì)胞器能夠?qū)е履[瘤的進展及耐藥的出現(xiàn)［14］；部分細(xì)胞因子如IL-30 能促進癌癥發(fā)生［15］，低氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）能通過調(diào)節(jié)靶基因參與腫瘤生長，免疫逃逸、代謝和耐藥［16］。高危組進行KEGG 分析顯示其在同源重組、α-亞麻酸代謝、甘油磷脂代謝等通路聚集，以往研究認(rèn)為同源重組缺陷（HRD）會導(dǎo)致包括ccRCC 在內(nèi)多種腫瘤的發(fā)生［17-18］，基于此機制研制的PARP 抑制劑展現(xiàn)出強大的泛抗癌作用，陸續(xù)在多個瘤種中獲批［19］。故炎癥相關(guān)基因可能通過對細(xì)胞因子的表達和細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)變等，參與DNA 的損傷及修復(fù)障礙和代謝變化，最終導(dǎo)致ccRCC 的發(fā)生。

本研究結(jié)果提示高風(fēng)險組PD-1、CTLA-4、LAG3等熱點免疫檢查點表達量均高于低風(fēng)險組，提示高風(fēng)險組可能在應(yīng)用相關(guān)免疫檢查點抑制劑時有更好的療效，這也部分解釋了目前最新指南僅將靶免聯(lián)合或免疫聯(lián)合治療作為轉(zhuǎn)移性或不可切除的中高風(fēng)險ccRCC 一線治療1A 類推薦，而低風(fēng)險人群的一級推薦仍是靶向治療的原因［20］。同時，高風(fēng)險組ccRCC 免疫細(xì)胞含量更高，腫瘤純度更低，異質(zhì)性高，ARAN 等［21］研究提示隨著ccRCC 的進展，包括更晚的分期和更高的組織學(xué)分級，其腫瘤純度降低，同時對應(yīng)較差的預(yù)后，這與本研究結(jié)果一致。

綜上，本研究基于TCGA 數(shù)據(jù)庫，建立一個ccRCC炎癥基因相關(guān)的預(yù)后風(fēng)險評分模型，其對ccRCC 有獨立預(yù)后價值，并探討其在包括基因及通路富集、免疫細(xì)胞功能、免疫檢查點和腫瘤微環(huán)境中的價值，為進一步挖掘相關(guān)治療靶點和揭示炎癥基因在ccRCC 及泛癌領(lǐng)域的作用提供了基礎(chǔ)。