侯曉麗，張亞慧，唐迎樂(lè)

（1.揚(yáng)州市職業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225000；2.揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225000）

帕金森?。≒arkinson's disease，PD）的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，目前認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制可能涉及氧化應(yīng)激、線粒體功能缺陷、環(huán)境及遺傳等因素[1]。已有證據(jù)表明[2，3]，氧化應(yīng)激反應(yīng)和自由基損害在PD 等神經(jīng)變性疾病中起重要作用。另有研究表明[4]，PD 患者中腦黑質(zhì)內(nèi)存在鐵離子濃度升高、線粒體功能下降、抗氧化保護(hù)系統(tǒng)如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）等功能異常，導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，氧自由基產(chǎn)生過(guò)多，引起蛋白質(zhì)、脂質(zhì)過(guò)氧化損害和斷裂，導(dǎo)致神經(jīng)元發(fā)生凋亡。此外，PD 患者黑質(zhì)區(qū)脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛（maleic dialdehyde，MDA）和過(guò)氧化脂質(zhì)的濃度高于正常10 倍之多[5]。上述研究表明氧化應(yīng)激參與了多巴胺能神經(jīng)元的損傷。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-PX）可特異催化GSH 對(duì)過(guò)氧化氫（H2O2）的還原反應(yīng)，對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整具有重要的保護(hù)作用，GSH-PX 活力的高低直接反映了機(jī)體清除自由基的能力[6]。SOD 對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著重要作用，它能清除超氧陰離子和自由基而保護(hù)細(xì)胞免受損傷，其活力高低間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力[7，8]。機(jī)體產(chǎn)生的氧自由基能攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸，產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化物，如MDA、羥基、羰基等而引起細(xì)胞死亡，故MDA 可反映體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，從而間接反映細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。人參皂苷-Rg3為祖國(guó)傳統(tǒng)中藥人參中分離提純的四環(huán)三萜類人參二醇型皂苷單體，研究發(fā)現(xiàn)[9，10]，20（S）-Rg3 具有良好的抗腦缺血及神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用。據(jù)報(bào)道[11，12]，Rg3能使SOD 和GSH-PX 生成增加，而使MDA 產(chǎn)生減少，從而對(duì)腦缺血損傷具有保護(hù)作用。但有關(guān)人參皂苷Rg3 對(duì)PD 模型大鼠的保護(hù)作用及其分子機(jī)制研究較少，基于此，本研究以R-NLC 制備PD 大鼠模型，測(cè)定黑質(zhì)區(qū)域MDA 濃度及SOD、GSH-PX 活力，檢測(cè)Rg3 對(duì)R-NLC 誘導(dǎo)的黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元氧化應(yīng)激的影響，初步探討Rg3 保護(hù)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組 SD 成年雄性大鼠24 只，體重（185±20）g，由揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，SPF 級(jí)，許可證號(hào)：SYXK（蘇）2007-0005，自由飲食飲水及活動(dòng)。SD 大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、Rg3 組和陽(yáng)性藥物組，每組6 只，分別編號(hào)1～6 號(hào)。各組大鼠均于造模前3 d 開(kāi)始給藥，1 次/d，連續(xù)31 d，Rg3 組給予6 mg/kg Rg3 灌胃，陽(yáng)性藥物組給予11 mg/kg 司來(lái)吉蘭灌胃，對(duì)照組及模型組給予6 mg/kg 羧甲基纖維素鈉CMC-Na 灌胃。灌胃3 d 后除對(duì)照組外，其余3 組大鼠均皮下注射魚(yú)藤酮納米脂質(zhì)載體（R-NLC），首劑量給予0.5 mg/kg，第2 次給予0.8 mg/kg，此后每次1 mg/kg，2 d/次，連續(xù)28 d，對(duì)照組皮下注射同等劑量空白納米脂質(zhì)載體。

1.2 試劑 人參皂苷Rg3（純度98%）購(gòu)自吉林大學(xué)植化室；鹽酸司來(lái)吉蘭片購(gòu)自南京思科藥業(yè)有限公司；羧甲基纖維素鈉購(gòu)自天津光復(fù)精細(xì)化工研究所；魚(yú)藤酮購(gòu)自廣東省豐順化工廠；魚(yú)藤酮納米脂質(zhì)載體（R-NLC）為自制；丙二醛（MDA）試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；冰醋酸、EDTA 等試劑購(gòu)自北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司。

1.3 儀器設(shè)備 使用儀器：普通臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；高速冷凍離心機(jī)（5475R，德國(guó)Eppendorf 公司）；電子天平（METTLER，AE240，瑞士）；高速均質(zhì)乳化機(jī)（PT-3100，瑞士POLYTRON）；恒溫水浴箱（HH-2，國(guó)華電器有限公司）；超凈工作臺(tái)（上海潔凈設(shè)備廠）；磁力攪拌器（中國(guó)南匯電訊器材廠）；DY89-Ⅱ型電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)（寧波新芝科器研究所）；Synergy2 酶標(biāo)儀（Bio-Tek 公司）；MilliQ plus 超純水系統(tǒng)（Millipore）；超低溫冰箱（-86 ℃，美國(guó)Thermo Scientific Revco）。

1.4 大鼠外觀行為表現(xiàn) 根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[13]開(kāi)展對(duì)大鼠的行為表現(xiàn)評(píng)分，具體評(píng)分方式為：若大鼠出現(xiàn)拒捕行為變?nèi)酰笫竺兣K變黃，弓背，主動(dòng)活動(dòng)減少行為學(xué)評(píng)分記為1 分；若大鼠出現(xiàn)動(dòng)作遲緩，有震顫或有步態(tài)不穩(wěn)行為學(xué)評(píng)分記為2 分；若大鼠步態(tài)不能成一條直線前進(jìn)，且出現(xiàn)單側(cè)旋轉(zhuǎn)行為學(xué)評(píng)分記為4 分；若大鼠出現(xiàn)單側(cè)癱瘓，行走困難，且進(jìn)食困難行為學(xué)評(píng)分記為6 分；若大鼠出現(xiàn)完全癱瘓，且不能進(jìn)食行為學(xué)評(píng)分記為8 分；若大鼠出現(xiàn)瀕臨死亡或死亡行為學(xué)評(píng)分記為10 分。

1.5 樣品處理 末次注射后24 h 處死大鼠，迅速取出腦部黑質(zhì)稱重，低溫下勻漿，制成10%的組織勻漿液，離心（2000 r/min，5 min），取上清待測(cè)。

1.6 黑質(zhì)中MDA 含量及SOD、GSH-PX 活性的測(cè)定采用黃嘌呤氧化酶法和二硫代二硝基苯甲酸法測(cè)定組織勻漿中SOD、GSH-PX 活力，采用硫代巴比妥縮合法測(cè)定MDA 含量，具體操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），計(jì)量資料以（）表示，組間比較采用檢驗(yàn)，以＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠外觀行為表現(xiàn)評(píng)分比較 對(duì)照組大鼠外觀行為表現(xiàn)正常；與對(duì)照組相比，模型組大鼠出現(xiàn)毛色發(fā)黃、姿態(tài)不穩(wěn)的情況，且大鼠會(huì)出現(xiàn)弓背狀屈曲體姿，四肢部分或全部出現(xiàn)癱瘓，個(gè)別有震顫現(xiàn)象，精神萎靡；與模型組相比，Rg3 組大鼠出現(xiàn)毛色較白，姿態(tài)穩(wěn)定的情況，且均未表現(xiàn)弓背狀屈曲體姿，無(wú)四肢部分或全部出現(xiàn)癱瘓，步態(tài)正常穩(wěn)定，精神正常，自發(fā)活動(dòng)較多，與陽(yáng)性藥物組情況相似；各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)行為學(xué)評(píng)分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠外觀行為表現(xiàn)評(píng)分比較（，分）

表1 各組大鼠外觀行為表現(xiàn)評(píng)分比較（，分）

注：與對(duì)照組比較，*＜0.05；與模型組比較，#＜0.05

2.2 各組大鼠黑質(zhì)MDA 含量比較 與對(duì)照組相比，模型組大鼠黑質(zhì)MDA 含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）；與模型組相比，Rg3 組及陽(yáng)性藥物組黑質(zhì)MDA 含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠黑質(zhì)MDA 含量比較（，nmol/mgprot）

表2 各組大鼠黑質(zhì)MDA 含量比較（，nmol/mgprot）

注：與對(duì)照組比較，*＜0.05；與模型組比較，#＜0.05

2.3 各組大鼠黑質(zhì)SOD 活性比較 與對(duì)照組相比，模型組大鼠黑質(zhì)SOD 活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）；與模型組相比，Rg3 組及陽(yáng)性藥物組黑質(zhì)SOD活性升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠黑質(zhì)SOD 活性比較（，U/mgprot）

注：與對(duì)照組比較，*＜0.05；與模型組比較，#＜0.05

2.4 各組大鼠黑質(zhì)GSH-PX 活性比較 與對(duì)照組相比，模型組大鼠黑質(zhì)GSH-PX 活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）；與模型組相比，Rg3 組及陽(yáng)性藥物組黑質(zhì)GSH-PX 活性升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05），見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠黑質(zhì)GSH-PX 活性比較（，U/mgprot）

表4 各組大鼠黑質(zhì)GSH-PX 活性比較（，U/mgprot）

注：與對(duì)照組比較，*＜0.05；與模型組比較，#＜0.05

3 討論

氧化應(yīng)激指細(xì)胞產(chǎn)生和清除自由基的能力失衡，使被氧化修飾的大分子在細(xì)胞內(nèi)堆積，過(guò)量自由基還可以引起生物膜上的不飽和脂肪酸形成過(guò)氧化脂質(zhì)，生成大量MDA，對(duì)蛋白質(zhì)、DNA、RNA 及多糖高分子物質(zhì)等產(chǎn)生氧化、交聯(lián)、變性和降解，導(dǎo)致膜流動(dòng)性降低、通透性增高、線粒體腫脹、溶酶體釋放生物酶、細(xì)胞器及酶的結(jié)構(gòu)和功能破壞。此外，氧化應(yīng)激可參與脂質(zhì)過(guò)氧化，從而促進(jìn)PD 的病理過(guò)程，目前已在PD 患者的腦內(nèi)找到氧化應(yīng)激損傷的證據(jù)，包括GSH 水平下降、脂質(zhì)過(guò)氧化增加、多巴醌生成、DNA 損害等[13-15]。

本研究采用R-NLC 構(gòu)建PD 動(dòng)物模型，其有助于魚(yú)藤酮更好地發(fā)揮作用。魚(yú)藤酮是一種廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)的殺蟲(chóng)劑，主要抑制線粒體復(fù)合物I，導(dǎo)致機(jī)體ATP 合成障礙，小動(dòng)物如小鼠、大鼠等長(zhǎng)期接觸魚(yú)藤酮等線粒體復(fù)合酶Ⅰ抑制劑可出現(xiàn)類似PD 樣病理學(xué)及行為學(xué)改變，包括黑質(zhì)紋狀體DA 能神經(jīng)元減少等[16]。魚(yú)藤酮抑制線粒體后引起氧化應(yīng)激，而線粒體是細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激最敏感的細(xì)胞器，自由基可造成線粒體損傷，線粒體損傷反過(guò)來(lái)進(jìn)一步加劇氧化應(yīng)激。實(shí)際上，ROS 是魚(yú)藤酮在體內(nèi)慢性抑制復(fù)合體Ⅰ的本質(zhì)特征[17]。腦組織是機(jī)體氧化代謝最活躍的器官，且含有大量易氧化的不飽和脂肪酸，但腦組織內(nèi)抗氧化相關(guān)酶的活性及抗氧化小分子谷胱甘肽的含量較低，特別是在紋狀體和黑質(zhì)內(nèi)含有大量的多巴胺，多巴胺在自發(fā)的或經(jīng)酶催化的代謝過(guò)程中產(chǎn)生氧自由基、過(guò)氧化氫等神經(jīng)毒性物質(zhì)[18]。實(shí)驗(yàn)證明[19]，在PD 模型大鼠黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)受損發(fā)生氧化應(yīng)激的過(guò)程中，自由基對(duì)生物膜的破壞起了重要作用，使生物膜中的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，產(chǎn)生MDA，生物膜結(jié)構(gòu)及通透性改變，生物酶的活性喪失，線粒體、溶酶體等細(xì)胞器發(fā)生裂解，細(xì)胞死亡。在正常的生理狀態(tài)下，人體代謝產(chǎn)生的自由基可以經(jīng)自由基清除系統(tǒng)滅活。人體清除自由基的酶主要包括SOD、過(guò)氧化氫酶（CAT）、GSH-PX及抗氧化非酶小分子GSH[20]。本研究結(jié)果顯示，PD大鼠黑質(zhì)內(nèi)GSH-PX、SOD 活性降低，而MDA 含量升高，這是由于脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)增強(qiáng)的結(jié)果；而Rg3組以及陽(yáng)性藥物組SOD、GSH-PX 活性高于模型組，MDA 含量低于模型組，以上研究結(jié)果反映了PD 模型大鼠黑質(zhì)內(nèi)抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)功能的減弱，MDA 含量的升高則反映了黑質(zhì)內(nèi)氧自由基含量的增多及細(xì)胞正處于脂質(zhì)過(guò)氧化的階段，而人參皂苷Rg3 可能是通過(guò)提高機(jī)體清除自由基的酶的活力而抑制過(guò)氧化反應(yīng)的。

綜上所述，氧化應(yīng)激參與了PD 的發(fā)病機(jī)制，Rg3 可以提高機(jī)體的抗氧化能力。隨著對(duì)氧化應(yīng)激介導(dǎo)的PD 發(fā)病機(jī)制的深入研究，對(duì)PD 抗氧化應(yīng)激的治療將得到更多的認(rèn)識(shí)和發(fā)展，也為臨床治療和預(yù)防PD 提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。