王闖紅，常旭貞

（通渭縣人民醫(yī)院普外科1，病理科2，甘肅 通渭 743300）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種以結(jié)直腸黏膜及黏膜下?lián)p傷為主的連續(xù)性炎性腸道疾病，典型癥狀為反復(fù)腹痛、腹瀉、黏液膿血便以及里急后重和體重減輕等[1]。在世界范圍內(nèi)UC 患病率呈上升趨勢[2]。目前UC 患者經(jīng)常使用氨基水楊酸、糖皮質(zhì)激素、免疫調(diào)節(jié)藥物和生物制劑，但以上藥物易導(dǎo)致感染、骨質(zhì)疏松和抑郁等不良反應(yīng)，甚至還會引起抗原抗體反應(yīng)[3]。即使經(jīng)過規(guī)范的藥物治療，仍有20%～30%的患者由于藥物治療失敗或長期結(jié)腸炎繼發(fā)發(fā)育不良需接受手術(shù)治療[4]。姜黃素是姜黃、郁金等姜科姜黃屬中藥中的主要活性成份，具有較好的抗炎、改善免疫功能及抗氧化、抗腫瘤等多種藥理作用[5]。臨床研究發(fā)現(xiàn)[6]，補(bǔ)充姜黃素可顯著改善輕至中度UC 患者的臨床結(jié)局和生活質(zhì)量，然而姜黃素改善UC 機(jī)制至今尚未完全明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一門基于系統(tǒng)生物學(xué)、生物信息學(xué)和高通量組織學(xué)的全新學(xué)科，基于公共數(shù)據(jù)庫用于發(fā)現(xiàn)生物活性成分，預(yù)測藥物作用靶點以及從生物網(wǎng)絡(luò)平衡的角度分析藥物作用機(jī)制[7]。因此，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，預(yù)測姜黃素在UC 治療中的有效分子靶點和潛在機(jī)制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 姜黃素作用靶點獲取 將姜黃素英文名稱“curcumin”輸入TCMSP 數(shù)據(jù)庫（https://www.tcmsp-e.com/tcmsp.php）和Drugbank 數(shù)據(jù)庫（https://go.drugbank.com/）進(jìn)行檢索，收集姜黃素潛在作用靶點。將“curcumin”輸入PubChem 數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲得姜黃素的2D 化學(xué)結(jié)構(gòu)及SMILES 符號，上傳SDF 格式2D 化學(xué)結(jié)構(gòu)文件至PharmMapper 數(shù)據(jù)庫（http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/index.html）進(jìn)行模擬分子-靶蛋白對接，設(shè)置靶點類型為“human protein targets only”，獲得潛在作用靶點。同時將姜黃素SMILE 符號上傳至SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫（http://www.swisstargetprediction.ch/），選擇物種為“homo sapiens”，獲得潛在作用靶點，并從中篩選出可能性（probability）大于0的靶點。將上述靶點合并去重，利用Uniprot 網(wǎng)站（https://www.uniprot.org/）對剩余靶點進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換，得到目的基因名稱。

1.2 UC 疾病靶點檢索 利用GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫（https://www.disgenet.org/）、PharmGKB 數(shù)據(jù)庫（https://www.pharmgkb.org/）和TTD 數(shù)據(jù)庫（http://db.idrblab.net/ttd/），以“ulcerative colitis”為關(guān)鍵詞進(jìn)行人類基因檢索獲得疾病靶點。篩選GeneCards 數(shù)據(jù)庫中相關(guān)性得分大于1 的靶點及DisGeNET 數(shù)據(jù)庫評分大于0.1 的靶點。將4 個數(shù)據(jù)庫中符合疾病的基因合并去重，從而獲得最終疾病相關(guān)靶點基因。

1.3 UC 和姜黃素共同靶點的篩選 將“1.1”和“1.2”所獲取的姜黃素靶點基因與UC 疾病靶點基因?qū)隫enny2.1（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）在線作圖工具繪制韋恩圖，獲得姜黃素與UC 的共有靶點基因。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點篩選 將姜黃素與UC 的共有基因靶點導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫（https://cn.string-db.org/cgi/input.pl），設(shè)定物種為“homo sapiens”，最高置信度為0.9，構(gòu)建共有靶點基因的蛋白互作關(guān)系（protein-protein interaction,PPI）網(wǎng)絡(luò)，隱藏PPI 網(wǎng)絡(luò)中孤立的靶標(biāo)基因，導(dǎo)出tsv.相關(guān)信息文件，運用Cytoscape3.9.1 軟件進(jìn)行可視化分析，計算網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)并篩選核心靶點。

1.5 生物功能與通路富集分析 利用DAVID 數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/）將姜黃素與UC 的共有靶點基因進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）功能注釋和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。以＜0.05 作為顯著功能和通路的臨界值，按照值從小到大進(jìn)行排序，分析姜黃素治療UC 的主要生物功能以及信號通路。

1.6 核心靶點的分子對接驗證 選擇核心靶點蛋白分子進(jìn)行分子對接驗證。從Protein Data Bank 數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）下載核心靶點蛋白的3D 結(jié)構(gòu)。利用AutoDockTools 1.5.6 軟件將蛋白受體和姜黃素分子配體進(jìn)行分子對接，通過結(jié)合能評估配體和受體的結(jié)合能力，結(jié)合能小于-5.0 kcal/mol 時具有良好的對接活性。采用PyMol2.2.0 軟件進(jìn)行可視化展示。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素治療UC 的潛在靶點 基于TCMSP 數(shù)據(jù)庫收集到姜黃素中所包含的靶點2 個，Drugbank 數(shù)據(jù)庫中收集到5 個，PharmMapper 數(shù)據(jù)庫收集到291 個，SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫收集到47 個。合并去重后，最終得到姜黃素潛在作用靶點324 個。將GeneCards、DisGeNET、PharmGKB 和TTD 4 個數(shù)據(jù)庫中檢索到的UC 相關(guān)靶點基因合并去重，共收集到UC 相關(guān)基因2907 個。通過韋恩圖取交集，共獲得姜黃素治療UC 潛在靶點基因168 個，見圖1。

圖1 姜黃素和潰瘍性結(jié)腸炎共有靶點韋恩圖

2.2 蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 PPI 網(wǎng)絡(luò)中共有133 個節(jié)點，1082 條邊（在STRING 數(shù)據(jù)庫中設(shè)置最高置信度為0.9，并隱藏孤立節(jié)點，所以有35 個交集靶點基因未參與網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建），見圖2。以Degree 值＞50 為篩選條件，獲得姜黃素治療UC 的關(guān)鍵靶點有SRC、MAPK1、STAT3、AKT1、HSP90AA1及PTPN11，其網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)見表1。

表1 PPI 網(wǎng)絡(luò)核心靶點的拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)

圖2 姜黃素治療潰瘍性結(jié)腸炎潛在靶蛋白PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 GO 功能注釋分析 將藥物疾病共有靶點進(jìn)行蛋白功能注釋分析，包括生物過程、分子功能以及細(xì)胞成分，將校正＜0.05 的條目進(jìn)行篩選，分別選取值最小的前10 位作圖，結(jié)果顯示生物過程包括485 個條目，主要涉及凋亡過程的負(fù)調(diào)控、肽基酪氨酸磷酸化、蛋白質(zhì)磷酸化等；分子功能包括108 個條目，主要涉及跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、相同蛋白質(zhì)結(jié)合等；細(xì)胞成分包括66 個條目，主要涉及胞質(zhì)溶膠、細(xì)胞外外泌體、細(xì)胞外區(qū)等，見圖3。

圖3 姜黃素治療潰瘍性結(jié)腸炎作用靶點GO 功能分析

2.4 KEGG 通路富集分析 將藥物疾病共有靶點進(jìn)行KEGG 通路富集分析，將校正＜0.05 的條目進(jìn)行篩選，總共富集到147 條信號通路。將得到的結(jié)果按值進(jìn)行排序，選取值最小的前20 條通路進(jìn)行可視化分析，結(jié)果顯示這些靶點主要匯集在癌癥通路、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、癌癥中的蛋白聚糖、前列腺癌、內(nèi)分泌抵抗、PD-L1 在癌癥中的表達(dá)和PD-1 檢查點通路、C 型凝集素受體信號通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥等信號通路，見圖4。

圖4 姜黃素治療潰瘍性結(jié)腸炎作用靶點KEGG 富集氣泡圖

2.5 姜黃素與核心靶點蛋白分子對接情況 姜黃素與6個核心靶點蛋白的結(jié)合能均小于-5.0 kcal/mol，見表2。對接結(jié)果在PyMOL 軟件中進(jìn)行可視化處理，以姜黃素與SRC 對接為例，結(jié)果顯示姜黃素可通過GLN-3 與SRC 形成氫鍵；另外，姜黃素與SRC的結(jié)合能為-5.15 kcal/mol，提示姜黃素與核心靶點SRC 的生物親和力高，具有較高的藥效活性，見圖5。

表2 核心靶蛋白與姜黃素的分子對接結(jié)果

圖5 姜黃素與核心靶蛋白的分子對接結(jié)果圖

3 討論

目前，臨床對于UC 的發(fā)病機(jī)制尚未明確，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為其病機(jī)主要以本虛為主，是本虛標(biāo)實、虛實夾雜之證[8]。中醫(yī)藥治療UC 具有療效確切、多靶點調(diào)控、毒副作用小等優(yōu)勢。研究表明[9-11]，中藥有效成分及復(fù)方治療UC 的機(jī)制包括調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、維持抑炎促炎因子平衡、抗氧化及調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)等。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)諸如葛根、黃芩和黃連厚樸湯等多種中藥和方劑均具有抗UC 的作用靶點[12-14]。姜黃素是姜黃、郁金等姜科姜黃屬中藥中的主要活性成份，一項針對隨機(jī)對照臨床試驗的研究證實[15]，姜黃素輔助治療可有效緩解UC 患者的臨床癥狀，而不會引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)。然而，姜黃素在UC 治療中的調(diào)節(jié)機(jī)制尚未得到系統(tǒng)闡明。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討了姜黃素在UC 治療中可能的作用機(jī)制，從公共數(shù)據(jù)庫中篩選到168 個姜黃素治療UC 的潛在靶點。GO 功能富集分析顯示659 條通路，KEGG 通路富集分析顯示147 條信號通路，主要與細(xì)胞凋亡過程負(fù)調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化、癌癥相關(guān)通路、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、C 型凝集素受體信號通路等有關(guān)。血脂異常不僅與UC 等自身免疫性疾病的發(fā)病有關(guān)，而且會加速其進(jìn)展[16]。研究表明[17，18]，UC 患者血清HDL-C 水平顯著降低、LDL-C 水平顯著升高，而姜黃素能夠影響脂質(zhì)代謝，從而緩解高脂血癥和動脈粥樣硬化。C 型凝集素受體（C-type lectin receptors，CLRs）主要由抗原呈遞細(xì)胞表達(dá)，是識別內(nèi)源性分子和病原體上碳水化合物結(jié)構(gòu)的模式識別受體[19]，在調(diào)節(jié)腸道免疫穩(wěn)態(tài)和結(jié)腸炎癥中起著至關(guān)重要的作用。Mincle是一種主要由巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的CLR，介導(dǎo)宿主內(nèi)的各種促炎反應(yīng)，研究發(fā)現(xiàn)其可作為UC 的潛在治療靶點[20]，而姜黃素能夠通過抑制Mincle 維持的M1巨噬細(xì)胞表型從而減輕炎癥反應(yīng)[21]。

根據(jù)姜黃素與UC 共有靶點基因的PPI 網(wǎng)絡(luò)，篩選出6 個關(guān)鍵靶點基因：SRC、MAPK1、STAT3、AKT1、HSP90AA1 及PTPN11。分子對接結(jié)果表明，姜黃素對這些靶標(biāo)具有良好的親和力，其中STAT3結(jié)合度最高。SRC 是一類非受體酪氨酸激酶，通過催化ATP 末端的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到特定蛋白質(zhì)底物上的酪氨酸殘基來激活下游信號分子，從而轉(zhuǎn)導(dǎo)生物信號，是細(xì)胞生理過程的重要調(diào)節(jié)劑[22]。UC 的病理特征之一是杯狀細(xì)胞丟失導(dǎo)致粘蛋白分泌減少，有研究發(fā)現(xiàn)[23]，作為SRC 家族成員之一的SRC-3 可以通過增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子KLF4 的表達(dá)來改善葡聚糖硫酸鈉（dextran sodium sulfate，DSS）誘導(dǎo)的結(jié)腸炎，促進(jìn)結(jié)腸杯狀細(xì)胞分化和成熟。MAPK 信號通路是與UC 發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)的信號通路，其激活被認(rèn)為是導(dǎo)致UC 中細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)釋放的主要因素之一[24]。MAPK1 是MAPK 家族成員之一，在MAPK信號傳導(dǎo)中起主要作用。有研究表明[25]，DSS 誘導(dǎo)的UC 大鼠MAPK1 的表達(dá)增加，其被抑制后可減輕炎癥，促進(jìn)上皮屏障功能的恢復(fù)。處于活動期的UC 患者腸道固有層中IL-6 及其受體（IL-6Rα）水平升高，IL-6 與IL-6Rα 多肽結(jié)合，后者與膜相關(guān)gp130相互作用，進(jìn)而觸發(fā)Janus 激酶（Janus kinases，JAK）和下游效應(yīng)子、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子3（signal transducer and activator of transcription-3，STAT3）、Shp-2-Ras 和磷脂酰肌醇3'激酶（phosphatidyl inositol 3' kinase，PI3K）-AKT 信號[26]。STAT3 與特定的DNA 序列結(jié)合并調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、存活和血管生成調(diào)節(jié)因子的轉(zhuǎn)錄[27]。研究發(fā)現(xiàn)[28]，中藥提取物木犀草素可以通過蛋白質(zhì)磷酸絲氨酸磷酸酶-1（protein phosphoserine phosphatase-1，SHP-1）抑制STAT3 信號通路來保持腸道上皮屏障功能，從而緩解DSS 誘導(dǎo)小鼠UC 的癥狀。Shou X 等[29]研究發(fā)現(xiàn)，在青紫止痛湯治療UC 中絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（silk/threonine protein kinase 1，AKT1）是結(jié)合活性最好的靶蛋白，提示AKT1 可能是青紫止痛湯給藥后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要介質(zhì)。

根據(jù)分子質(zhì)量，Hsps 分為Hsp100、Hsp90、Hsp70、Hsp60 和Hsp20 家族。Hsp90AA1 是Hsp90s中研究最廣泛的成員，它在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中的主要作用是維持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)并實現(xiàn)細(xì)胞保護(hù)功能[30]。葛根芩連湯治療UC 在臨床上使用廣泛，且療效確切。Wei M 等[31]通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，HSP90AA1是葛根芩連湯治療UC 的靶標(biāo)之一。PTPN11 基因編碼含Src 同源結(jié)構(gòu)域的蛋白酪氨酸磷酸酶蛋白2（Src homology domain -containing protein -tyrosine phosphatase-2，SHP-2），由PTPN11 多態(tài)性引起的SHP-2 功能喪失的積累改變可能導(dǎo)致對T 細(xì)胞和B細(xì)胞活化的抑制作用降低，從而導(dǎo)致持續(xù)的慢性腸道炎癥和UC 的發(fā)作[32]。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)預(yù)測了姜黃素治療UC 的核心靶點和信號通路，表明姜黃素可以通過多靶點、多途徑系統(tǒng)地改善UC。以上研究結(jié)果為未來運用姜黃素治療UC 的新藥開發(fā)和臨床研究提供了理論依據(jù)，后續(xù)需進(jìn)一步研究和實驗驗證。