胡芳，朱閩，張澤朝，楊青云，張禹姝

1 廣西中醫(yī)藥大學(xué) 廣西南寧 530000

2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院 廣西南寧 530000

BPH是中老年男性最常見的疾病之一[1]，因前列腺上皮和基質(zhì)細胞的過度增殖導(dǎo)致腺體增大引起的下尿路癥狀是其主要臨床表現(xiàn)[2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療BPH 的常用藥物是5α 還原酶抑制劑和α 受體阻滯劑，均需要長期用藥，且有一定的不良反應(yīng)發(fā)生[3]。BPH 屬中醫(yī)“癃閉”“精癃”范疇，諸多古代文獻及現(xiàn)代研究表明，中醫(yī)藥治療本病有一定的優(yōu)勢和潛力[4]。

腎虛血瘀證的BPH 最常見的臨床證型，以溫補腎陽、活血化瘀為治療原則[5]。肉桂-黃芪是張春和教授治療腎虛瘀阻的BPH 喜用藥對且是根據(jù)數(shù)據(jù)挖掘治療前列腺增生支持度最高的藥對[6]，有臨床研究發(fā)現(xiàn)用黃芪和肉桂配對使用的如前列通竅膠囊、補腎消癃方治療腎虛血瘀證的BPH 安全有效[7-8]。但當前黃芪和肉桂兩味配對治療BPH 的作用機制尚未完全清楚，因此本研究將應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接揭示黃芪-肉桂治療BPH 的活性成分及藥效機制，為其臨床使用提供生物學(xué)信息支持和為后續(xù)基礎(chǔ)研究提供參考。

材料及方法

1 中藥化學(xué)成分與靶點的搜集

從TCMSP 平 臺（http：//lsp，nwu.edu.cn/tcmsp.php）中以及文獻補充檢索黃芪、肉桂，篩選條件設(shè)置為口服利用度（oral availability，OB）≥30%及類藥性（drug-likeness ，DL）≥0.18，再將篩選得到有效成分通過其MOL.ID 號搜尋單味藥成分作用靶點。剔除重復(fù)作用靶點后將靶點信息經(jīng)Uniport 數(shù)據(jù)庫標準化。

2 構(gòu)建“中藥-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖

利用Cytoscape 3.8.2 軟件將得到黃芪-肉桂有效成分和作用靶點的相互作用制作中藥“有效成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖。

3 中藥與BPH 共有靶點的收集

以“Benignprostatichyperplasia”為 關(guān) 鍵 詞，分別 運 用GeneCards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//www.omim.org/）、Durgback（https：//go.drugbank.com/）平臺檢索 BPH 相關(guān)靶點。將篩選得到的BPH 靶點刪除重復(fù)靶點后和黃芪、肉桂靶點 導(dǎo) 入Venny2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）網(wǎng)站得到交集靶點。

4 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及網(wǎng)絡(luò)拓撲分析

將黃芪- 肉桂與BPH 的交集基因?qū)隨tring（https：//string-db.org/）數(shù)據(jù)庫，設(shè)置對象為（homo sapiens）、取最高置信度0.900，隱藏游離基因節(jié)點，然后得到蛋白互作關(guān)系。結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape3.8.2 軟件中，選擇”network Analyzer”，得到網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)參數(shù)。介度中心值（Betweennesscentr ality.BC）最短路徑穿過單個節(jié)點的次數(shù)，緊密中心值（closeness centrality.CC）是節(jié)點間溝通的難易程度。把Degree 值的二倍中位數(shù)以上，BC 和CC 的中位數(shù)上作為衡量標準篩選養(yǎng)中藥與疾病的核心成分靶點，并制作PPI 網(wǎng)絡(luò)互做圖。

5 GO 和KEGG 富集分析

通過Metascape（http：//metascape.org/）平臺進行GO（gene ontology）功能、KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路富集分析，將所得交集靶點導(dǎo)入基因列表中，設(shè)置對象為”human”，選擇個性化分析，設(shè)置最小重疊為（Min Overlap）為3、P值取0.05、最低濃縮度為1.5。得到結(jié)果后，制作GO 富集分析圖和KEGG Pathway 通路圖。

6 分子對接

通 過Cytoscape3.8.2 軟 件 中”network Analyzer”功能分析得到degree 值和中間介度值排名第一的中藥成分選為中藥大分子受體。通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫獲取成分小分子配體結(jié)構(gòu)，并利用PDB（http：//www1.rcsb.org/）平臺獲取核心蛋白大分子受體結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì) 晶 體 結(jié) 構(gòu) 由RCSB PDB 數(shù)據(jù) 庫（http：//www.rcsb.org/）獲取（PDB 編號：）。將大分子和小分子導(dǎo)入AutodockTools1.5.6 軟件中進行對接驗證。經(jīng)過去水，加氫處理后，并進行受體結(jié)構(gòu)準備工作。使用Open Babel 及Autodock vina 程序?qū)π》肿訋爝M行拆分等準備工作。最后導(dǎo)入pymol 進行對接結(jié)果的可視化。

結(jié) 果

1 黃芪、肉桂有效成分和靶點的獲取

從TCMSP 數(shù)據(jù)庫中，以O(shè)B ≥30%和DL ≥0.18為篩選條件，得到20 種符合條件的有效成分。通過文獻搜索肉桂有3 個成分，雖不符合篩選條件，但具有較好的抗前列腺增生的作用，也納入研究。黃芪-肉桂成分作用靶點經(jīng)合并去重后得到206 個靶點。黃芪-肉桂有效成分基本信息見表1。

表1 黃芪-肉桂有效成分表格

2 構(gòu)建中藥“有效成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖及關(guān)鍵化合物篩選

采用Cytoscape3.8.2 軟件，繪制中藥“有效成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖（見圖1），共221 個節(jié)點（Nodes），434 條邊（Edges）。根據(jù)Degree 值排序得到前3 的成分化合物為懈皮素、山柰酚、油酸。見表2。

圖1 中藥“有效成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖

表2 前3 化合物Degree 值表

3 疾病和交集基因的獲取

經(jīng)GeneCards、OMIM、Durgback 平 臺 獲 取BPH靶點4468 個，其中最大score 評分為94.51，最小評分為0.14。對所得數(shù)據(jù)卡兩次中位數(shù)和刪除重復(fù)值后得到3951 個疾病靶點。黃芪-肉桂與BPH 靶點取交集，得到交集基因165 個。韋恩圖見圖2。

圖2 中藥-疾病靶點韋恩圖

4 PPI 網(wǎng)絡(luò)制作和核心蛋白的獲取

經(jīng)String 平臺分析隱藏游離節(jié)點后得到114 個節(jié)點，1721 條邊，平均節(jié)度點為9.28。下載TSV 文件導(dǎo)入Cytoscape3.8.2 后經(jīng)網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)分析，把Degree值的二倍中位數(shù)以上，BC 和CC 的中位數(shù)上靶點作為中藥復(fù)方的核心作用靶點，根據(jù)拓撲學(xué)參數(shù)分析，前五靶點基因為AKT1、IL-6、INS、TP53、TNF。隨著Degree 值和連接分數(shù)的增高，節(jié)點的形狀越大，顏色越鮮明、線條越粗，蛋白的地位也就越重要。見圖3。

5 GO 與KEGG Pathway 富集分析

經(jīng)Metascape 平臺分析，GO分析結(jié)果顯示：生物過程（Biological Processes.BP）4172 條、分子功能（Molecularfunction.MF）503 條和細胞成分（Cellular Components.CC）共285 條。BP、MF 和CC 分別前10條見圖4。BP排名靠前的為活性氧代謝過程、對藥物的反應(yīng)、對類固醇激素的反應(yīng)、細胞對化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)等。MF 主要涉及核受體活性、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性等。CC 主要由突觸后膜、受體復(fù)合體、細胞質(zhì)核周區(qū)域、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體等構(gòu)成。提示黃芪-肉桂可能通過調(diào)控細胞核轉(zhuǎn)錄因子、參與脂多糖等反應(yīng)來干預(yù)治療BPH。

圖4 GO 富集分析圖

為了探討黃芪-肉桂在BPH 治療中的信號通路機制，我們進行了KEGG 富集分析。如圖5 所示，顯示了前20 條信號通路，包括IL-17 信號通路、TNF 信號通路等。

圖5 KEGG Pathway 富集分析圖

6 化合物靶點-核心蛋白分子對接驗證

將篩選得到黃芪-肉桂的拓撲學(xué)參數(shù)排名第一的中藥化合物小分子槲皮素，PPI 核心蛋白拓撲學(xué)參數(shù)第一的大分子受體（AKT1、IL-6、INS、TP53、TNF）由AutodockTools1.5.6 軟件進行分子對接。化合物與蛋白質(zhì)的對接結(jié)果見表3。結(jié)合能＜-1kcal.mol-1，提示具有結(jié)合活性。隨著結(jié)合能越低，受體與配體之間的親和力越高，構(gòu)象越穩(wěn)定。根據(jù)結(jié)果顯示，分子對接結(jié)合熱能都＜-1kcal.mol-1，說明自發(fā)間可以相互結(jié)合，其中槲皮素與TNF（-7.16）的結(jié)合熱能最低，表示結(jié)合活性較最好，導(dǎo)其入pymol 進行對接結(jié)果的可視化，結(jié)果見圖6。

圖6 槲皮素與TNF 的分子對接示意圖

表3 分子對接結(jié)果

討 論

BPH 是一種良性增生性疾病，在臨床上治療本病有癥狀復(fù)雜和纏綿難愈的難點[4]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)BPH 的發(fā)病機制尚未完全揭示，可能與激素、炎性反應(yīng)、血管生長和細胞增殖與凋亡障礙有關(guān)[9]。然而，臨床上缺乏特殊的治療方法[10]。BPH 在中醫(yī)上屬“癃閉”“精癃”范疇，腎虛血瘀是其發(fā)病的基本病機也是臨床上最常見的證型[8]，以溫補腎陽，活血化瘀為治則。黃芪在《本草逢源》中記載黃芪有“補腎中氣不足”和“而能通調(diào)血脈，流行經(jīng)絡(luò)”之效，因此其能益氣活血。肉桂有補火助陽，引火歸原，散下焦之陰寒，助膀胱氣化之功，因而黃芪和肉桂配合使用則能達溫補腎陽，活血化瘀之功。但黃芪-肉桂治療BPH 的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)確切作用機制尚不明確。因此，有必要利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接探索該藥對在BPH 治療中的作用機制。

通過對黃芪-肉桂“有效成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，我們得到黃芪-肉桂化合物治療BPH 的主要活性成分包括槲皮素、山柰酚、油酸等。槲皮素和山柰酚均屬于黃酮類藥物，都具有抗炎和抗氧化的功效[11]，研究表明，槲皮素可降低BPH 患者前列腺癥狀評分和提高尿流量[12]，山柰酚能明顯降低BPH 大鼠前列腺指數(shù)，改善BPH 大鼠的病理結(jié)構(gòu)[13]。兩者都能減少前列腺上皮細胞的增殖，降低PSA 水平和AR 基因的表達[13-14]。油酸可抑制BPH 大鼠的LNCaP 增殖[15]和5a-還原酶活性（5AR）[16]。

在黃芪-肉桂對BPH 起治療作用的114 個靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò)中，AKT1、IL6、P53、TNF 等是基于節(jié)點度前5 個靶點。根據(jù)分子對接也證明AKT1、IL6、P53、TNF 與黃芪-肉桂具有結(jié)合活性，因此這些靶點可能在黃芪-肉桂治療BPH 中發(fā)揮重要作用。上述靶點主要與細胞增生與凋亡、炎性反應(yīng)有關(guān)。Akt1 是一種多功能蛋白質(zhì)，與細胞生長，存活和增殖的調(diào)節(jié)有關(guān)[17]。Akt1 在正常的前列組織中有表達[18]，AkT-1 表達升高會增加BPH 患者的前列腺大小[19]。p53 蛋白是一種抗凋亡蛋白，在BPH 大鼠中p53 的mRNA 表達較正常組大鼠會下降[20]，p53 的表達下降會促進BPH 上皮細胞生長[21]。IL6 和TNF-α 是促進前列腺上皮細胞增生的促炎蛋白[14]，臨床上發(fā)現(xiàn)BPH 患者IL-6、TNF-α 的水平顯著升高[22]，并且有研究發(fā)現(xiàn)IL-6 水平與PSA、PSAD 表達[23]以及TNF-α 濃度與PV 、前列腺癥狀評分均呈正相關(guān)[24]。有研究表明肉桂中的肉桂醛可顯著降低BPH 大鼠IL-6、TNF-α 水平，降低前列腺增生指數(shù)和減輕前列腺結(jié)構(gòu)組織病理學(xué)變化[25]。

根據(jù)KEGG 分析得到黃芪-肉桂治療BPH 主要途徑包括IL-17 信號通路、TNF 信號通路、HIF 1 信號通路、MAPK 信號通路、PI3K-Akt 信號通路等。在IL-17 信號通路[26]和TNF 信號通路[27]中，IL-17 和TNF-α 都是多功能促炎細胞因子，參與宿主防御、炎性反應(yīng)疾病等過程。與健康患者相比，BPH 患者IL-17、TNF-α 表達明顯升高[28]。IL-17[29]和TNF-α[30]的表達升高可以通過刺激 IL-6 和 IL-8 的產(chǎn)生，從而促進BPH 中基質(zhì)和上皮生長[29]。HIF-1 信號通路促進血管生成，它有助于包括BPH 在內(nèi)的諸多增生性疾病的進展[31]。升高的HIF-1α 能上調(diào)BPH 大鼠前列腺組織中VEGF 和 bFGF 的表達進而誘導(dǎo)血管內(nèi)皮誘導(dǎo)增殖、遷移、存活、發(fā)芽并最終擴展原始血管網(wǎng)絡(luò)[32]，為生長中的前列腺細胞的存活提供營養(yǎng)支持和氧化作用[7]。PI3K-Akt 信號通路有促進細胞增殖且抑制細胞凋亡的作用[33]，研究發(fā)現(xiàn)BPH 患者前列腺組織中P13 和AKT 表達水平升高，并與前列腺體積正相關(guān)[12]。MAPK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在細胞生長、分化、凋亡等生物過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[34]。MAPK 信號通路分支包括ERK、p38 和JNK 等。其中ERK 激活主要控制細胞增殖和分化及抗細胞凋亡的功能，p38 和 JNK 激活往往與促細胞凋亡的作用相關(guān)[35]。實驗表明BPH條件下ERK 表達水平明顯升高，p-JNK 和p-p38 表達水平顯著下降[36]。p38 表達升高能抑制BPH-1 的生長并增加細胞凋亡[34]。

綜上所述，黃芪-肉桂中的槲皮素、山柰酚、油酸等有效成分可能通過作用于AKT1、IL6、P53、TNF 等靶 點，調(diào) 控IL-17、TNF、 HIF 1、MAPK 和PI3K-Akt等信號通路以影響可能會導(dǎo)致前列腺增生的原因如雄激素/AR 信號通路激活升高、炎性反應(yīng)及血管增生來抑制前列腺體積的異常增大和改善BPH 患者臨床癥狀等作用。