張 川,于 濤,于小焱,朱 勇,王麗芳,張曉慧

(1.國家海洋標準計量中心,天津 300112; 2.海洋計量檢測技術(shù)創(chuàng)新中心,天津 300112; 3.自然資源部第二海洋研究所,浙江 杭州 310012; 4.自然資源部海洋生態(tài)系統(tǒng)動力學重點實驗室,浙江 杭州 310012; 5.廈門大學 近海海洋環(huán)境科學國家重點實驗室,福建 廈門 361102)

0 引言

磷是構(gòu)成生命體的基本元素,在海洋中磷元素是海洋初級生產(chǎn)力的主要影響因素[1],同時磷也是海水富營養(yǎng)化的主要因素之一[2]。磷含量不足會限制生物生長,反之則可導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化、生物繁殖過剩,進而造成生態(tài)災(zāi)害[3]。水體中磷以多種形態(tài)存在[4],包括溶解態(tài)無機磷/有機磷和顆粒態(tài)無機磷/有機磷。依據(jù)測定方法和操作步驟還可將其劃分為活性磷、可酸解磷、總磷等類別。其中,經(jīng)過濾后的樣品,未經(jīng)水解或消解,能通過磷鉬藍(Phospho Molybdenum Blue,PMB)分光光度法測得的稱為活性磷[4-6]。在海洋科學研究及日常監(jiān)測、調(diào)查工作中,磷酸鹽的測定非常重要,建有標準的操作規(guī)范[7-8]。測定方法可分為濕化學法、紫外光譜法及離子選擇性電極法[9]。為了保證測量結(jié)果的準確可靠,在測定過程中均需要使用標準物質(zhì)開展質(zhì)量控制[10-11]。

國內(nèi)研制生產(chǎn)磷酸鹽等營養(yǎng)鹽標準物質(zhì)的單位主要有自然資源部第二海洋研究所、國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心、中國計量科學研究院等。上述單位研制的標準物質(zhì)的基質(zhì)均為氯化鈉溶液或純水[12],將其用于測量海水樣品會影響結(jié)果的準確性。加拿大國家研究委員會和日本國家計量院研制的MOOS-1、MOOS-3、NMIJ7601-a、NMIJ7602-a、NMIJ7603-a等有證標準物質(zhì)(Certified Reference Material,CRM)以及韓國海洋科學技術(shù)研究所和荷蘭皇家海洋研究所研制的曾用于國際間交流比對活動的相關(guān)樣品,均采用大洋海水作為基質(zhì)[13]。

本研究采用西太平洋表層海水為基質(zhì),通過對海水進行前處理和定量配制來制備海水基質(zhì)磷酸鹽標準物質(zhì),并對定值方法進行了優(yōu)化,評估了制備樣品的均勻性及穩(wěn)定性,采用多實驗室聯(lián)合定值的方式確定了不同濃度的4個批次樣品的標準值,并對其不確定度進行了分析。該研究填補了國內(nèi)活性磷酸鹽海水基質(zhì)標準物質(zhì)制備領(lǐng)域的空白。

1 材料

1.1 基質(zhì)材料準備

海水采集自西太平洋(24°42′N,126°03′E),該區(qū)域為寡營養(yǎng)鹽海域[14],表層海水活性磷酸鹽濃度一般約為幾十納摩爾每升。采集時間為2017年7月,采水位置遠離大陸或其他潛在污染源,水深大于1 500 m。采用水泵直接抽取表層(5 m左右)海水分裝于25 L食品級聚乙烯塑料桶內(nèi)保存,同時通過現(xiàn)場溫鹽深測量儀(conductivity-temperrature-depth measuring instrument,CTD)測量海水水溫為28.5 ℃,鹽度為33.6。采集的大洋海水運回實驗室,儲存在陰涼避光處,陳化1 a以上備用。陳化后的海水中易降解的有機物降解完全,而活性磷酸鹽的濃度基本保持穩(wěn)定。采用固相萃取富集與分光光度法聯(lián)用技術(shù)測定采集海水的活性磷酸鹽本底值為31.6 nmol/L,大約為本研究中試制標準物質(zhì)濃度(最小為500 nmol/L)的1/17,該本底值對標準物質(zhì)后續(xù)定值可能產(chǎn)生的影響很小,基本可忽略。

1.2 儀器與試劑

本研究使用荷蘭斯卡拉(Skala)San++型營養(yǎng)鹽自動分析儀作為測定活性磷酸鹽的分析儀器。該儀器使用氣泡間隔連續(xù)流動分析系統(tǒng)搭配紫外分光光度檢測器進行磷酸鹽濃度的測定。該檢測器具備雙光束背景扣除功能。測定實驗中所用比色皿光程為5 cm。

實驗室所用超純水為自來水經(jīng)過美國密理博(Millipore)Milli-Q型超純水系統(tǒng)凈化而成,其電阻率為18.2 MΩ·cm?？箟难?VC)、四水合鉬酸銨[(NH4)6Mo7O24·4H2O]、酒石酸銻鉀[K(SbO)C4H4O6·H2O]均采購自Sigma-Aldrich公司,純度為“優(yōu)級純”。磷酸二氫銨中磷、氮成分標準物質(zhì)(GBW06502)采購自中國計量科學研究院。濃硫酸(97%)采購自天津化學試劑有限公司,純度為“優(yōu)級純”。

2 實驗方法

2.1 樣品制備

實驗采用0.45 μm混合纖維素微孔濾膜對天然大洋海水進行過濾,濾除海水中的懸浮物、不溶性顆粒。采用高溫滅菌設(shè)備對過濾后的海水在124 ℃下滅菌2 h,采用容器及包裝瓶分裝,并在同樣條件下滅菌 30 min。此過程可滅活天然海水中的各類活體以及容器內(nèi)可能存在的細菌等微生物,以避免儲存期間其生命活動導(dǎo)致水中活性磷酸鹽濃度發(fā)生變化。將處理后的天然海水作為溶液基質(zhì),定量加入磷酸二氫銨標準物質(zhì)(10 mmol/L)溶解混勻,調(diào)制后磷酸鹽濃度大約為0.5、1.0、2.0和4.0 μmol/L,分裝(批次代號分別為P1、P2、P3、P4)后進行均勻性檢驗和穩(wěn)定性檢驗,并用于定值研究。

2.2 活性磷酸鹽濃度測定方法

PMB分光光度法是一種測定水體中活性磷酸鹽較成熟的方法:在酸性介質(zhì)中,活性磷酸鹽在酒石酸銻鉀的催化下與鉬酸銨反應(yīng)生成磷鉬雜多酸,該絡(luò)合物被抗壞血酸還原為PMB絡(luò)合物,在710 nm或882 nm波長處可進行分光光度測定[15]。該方法不僅可測定微摩爾級別的樣品,結(jié)合氫氧化鎂共沉淀法[14,16]、流動分析-固相萃取法[17-19]等技術(shù),檢出限可達納摩爾級別,是海水中痕量磷元素分析的有力手段。此外,由于海水高鹽及共存離子復(fù)雜等特性會造成靈敏度或儀器操作受限,諸如化學發(fā)光法、色譜法、質(zhì)譜法等方法多用于測定淡水水體磷酸鹽含量。

2.3 樣品均勻性檢驗方法

均勻性用于描述標準物質(zhì)特性值的空間分布特征。根據(jù)《標準物質(zhì)的定值及均勻性、穩(wěn)定性評估》(JJF 1343—2022)[20]的要求,在分裝過程中采用分層隨機抽樣的方法抽取11瓶樣品用于檢驗,每瓶樣品平行測定 3次。采用單因素方差分析(F檢驗)進行統(tǒng)計,若統(tǒng)計量F值小于臨界值,則認為樣品均勻。

2.4 樣品穩(wěn)定性檢驗方法

穩(wěn)定性用于描述標準物質(zhì)特性值隨時間的變化,即樣品特性的時間分布特征。研制過程中通過穩(wěn)定性檢驗可分析評估穩(wěn)定性相關(guān)的不確定度分量,同時以此確定合適的保存和運輸條件以及有效期。檢驗主要分為長期穩(wěn)定性和短期穩(wěn)定性,前者考察標準物質(zhì)在一般保存條件下1年以上的穩(wěn)定性,后者考察運輸?shù)韧獠恳蛩匾鸬亩唐诜€(wěn)定性變化。長期穩(wěn)定性檢驗中,在樣品制備后第0、0.5、1、2、4、6、15個月,每次隨機抽取1組樣品(共7組)進行測定。短期穩(wěn)定性檢驗中,分別以不同環(huán)境條件保存樣品(環(huán)境溫度為-20、4、25、65 ℃),在樣品保存0、1、4、7天后,每次隨機抽取1組樣品進行測定。

按照JJF 1343—2022[20]的要求采用趨勢分析法進行穩(wěn)定性評估。作時間-測量值數(shù)據(jù)圖,并進行線性擬合。計算直線斜率β1的標準偏差s(β1),并作t檢驗。若滿足式(1)要求,則表明監(jiān)測數(shù)據(jù)隨時間沒有顯著性的趨勢變化,樣品穩(wěn)定性良好:

|β1|

(1)

式中:t95,n-2為雙邊檢驗置信概率95%下t分布臨界值。判定長期穩(wěn)定性時(n=7),t95,n-2查表為2.571;判定短期穩(wěn)定性時(n=4),t95,n-2查表為4.303。

2.5 定值誤差統(tǒng)計分析

采用多家實驗室聯(lián)合測試的方式進行定值,參與定值的實驗室均具有海水磷酸鹽檢測計量認證資質(zhì)。相關(guān)實驗室來自專業(yè)檢驗檢測機構(gòu)、海洋儀器設(shè)備研發(fā)機構(gòu)、科研院所、海洋水質(zhì)監(jiān)測業(yè)務(wù)部門等多個領(lǐng)域的多家單位。向上述單位發(fā)送隨機抽取的樣品及測試說明,由各實驗室自行獨立測定后按照統(tǒng)一的數(shù)據(jù)格式反饋結(jié)果及質(zhì)控信息。

對以上數(shù)據(jù)進行匯總,通過以下統(tǒng)計分析手段剔除異常值和離群值,并進行正態(tài)性檢驗,對符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù),同組取平均值作為定值結(jié)果。

1)格拉布斯檢驗

2)科克倫檢驗

接公式(2)計算各組數(shù)據(jù)的C值,查表獲得臨界值C(α,m,n),其中α為顯著性水平,取0.05或0.01;m為數(shù)據(jù)組數(shù);n為重復(fù)測量次數(shù)。若C≤C(0.05,m,n),表明各組數(shù)據(jù)平均值為等精度;若C(0.05,m,n)≤C≤C(0.01,m,n),仍按等精度處理;若C>C(0.01,m,n),則為不等精度。

(2)

3)狄克遜檢驗

將測定數(shù)據(jù)按由小到大的順序排列,第n個數(shù)據(jù)記為X(n),按照式(3)和式(4)計算r1和rn值。

(3)

(4)

查表獲得臨界值f(α,n),其中α為顯著性水平,n為數(shù)據(jù)序列數(shù)。若r1>rn,且r1>f(α,n),則判定X(1)為異常值;若rn>r1,且rn>f(α,n),則判定X(n)為異常值;若r1和rn值均小于f(α,n)值,則所有數(shù)據(jù)保留。

4)夏皮洛-威爾克正態(tài)分布檢驗

將數(shù)據(jù)按由小到大的順序排列,計算統(tǒng)計量W:

(5)

當W>W(n,p)時,則接受測定數(shù)據(jù)為正態(tài)分布。其中W(n,p)是與測量次數(shù)n和置信概率p有關(guān)的數(shù)值,可查表得到。

2.6 不確定度評定方法

本樣品特性值的不確定度由均勻性、穩(wěn)定性及定值過程三部分引入。通過分析不確定度來源,建立數(shù)學模型,對各類來源分別進行分析計算,按照公式(6)計算合成標準不確定度。合成標準不確定度乘以擴展因子k可以得到擴展不確定度(k=2),擴展不確定度除以測量值可以得到相對擴展不確定度。

(6)

式中:uCRM為標準物質(zhì)的合成標準不確定度,ubb為標準物質(zhì)的均勻性引入的不確定度,ults為標準物質(zhì)的穩(wěn)定性引入的不確定度,uchar為標準物質(zhì)的定值過程引入的不確定度。

2.6.1 均勻性引入的不確定度

對同一批次樣品進行均勻性檢驗,通過下列公式計算不確定度分量:

(7)

2.6.2 穩(wěn)定性引入的不確定度

統(tǒng)計穩(wěn)定性數(shù)據(jù),采用線性回歸假設(shè),通過下列公式計算不確定度分量:

ults=X×ub

(8)

式中:X為樣品保存時間;ub為時間(X)與測定磷酸鹽濃度值(Y)線性擬合后,曲線斜率的標準偏差(標準不確定度)。

2.6.3 定值過程引入的不確定度

對多家實驗室的測量結(jié)果進行統(tǒng)計分析,計算由多家實驗室聯(lián)合定值引入的不確定度分量,計算方式為

(9)

(10)

(11)

3 定值方法優(yōu)化研究

3.1 反應(yīng)溫度的優(yōu)化

在PMB生成的反應(yīng)中,溫度影響反應(yīng)熱力學[22-23],進而導(dǎo)致反應(yīng)效率變化。首先采用分析儀廠商推薦的試劑條件及儀器設(shè)定,考察不同反應(yīng)溫度下的測定效果。設(shè)置分析儀反應(yīng)池恒溫溫度在20～60 ℃范圍內(nèi)依次變化,分別記錄同一組樣品的測定結(jié)果。結(jié)果顯示在此溫度范圍內(nèi)未發(fā)現(xiàn)顯著的測量結(jié)果差異。因此后續(xù)實驗保證在室溫下進行測定,測定過程中儀器自帶反應(yīng)池恒溫器統(tǒng)一設(shè)定為30 ℃。

3.2 試劑質(zhì)量濃度的優(yōu)化

圖1 抗壞血酸質(zhì)量濃度條件優(yōu)化結(jié)果

圖2 鉬酸銨質(zhì)量濃度條件優(yōu)化結(jié)果

圖3 酒石酸銻鉀質(zhì)量濃度條件優(yōu)化結(jié)果

優(yōu)化后的測試條件:反應(yīng)溫度為30 ℃,抗壞血酸質(zhì)量濃度為4 g/L,混合酸中鉬酸銨質(zhì)量濃度為4 g/L,硫酸溶液體積分數(shù)為4%,酒石酸銻鉀質(zhì)量濃度為100 mg/L。

3.3 定值方法性能評價

配制系列標準溶液及空白溶液,測定后作標準曲線,校準范圍為(0～5) μmol/L,線性相關(guān)度R2為0.999 9。平行測定11次空白樣品并計算標準偏差(s),方法的檢出限VMDL按照公式VMDL=s·t(10,0.99)計算,其中t(10,0.99)=3.17,檢出限結(jié)果為0.03 μmol/L。

采用日本國家計量院制造的編號為NMIJ7603-a、NMIJ7602-a的高濃度和中濃度天然海水活性磷酸鹽標準物質(zhì)作為驗證樣品,對定值方法的可靠性和準確度進行驗證(見表1),結(jié)果顯示該定值方法誤差在0.05 μmol/L以內(nèi),可靠性良好。

表1 定值方法準確度和可靠性驗證結(jié)果

采用優(yōu)化后的定值方法對本研究制備的4種濃度的海水活性磷酸鹽標準物質(zhì)進行9次重復(fù)性測定,相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)值見表2。從數(shù)據(jù)可見,隨著樣品濃度值的減小,RSD基本呈增大趨勢,這與大多數(shù)痕量分析結(jié)果類似,即目標物濃度越接近方法檢出限,測量結(jié)果精密度越差。

表2 定值方法精密度驗證結(jié)果

4 標準物質(zhì)檢驗定值結(jié)果

4.1 均勻性檢驗結(jié)果

單因素方差分析結(jié)果(表3)顯示,4種濃度活性磷酸鹽標準物質(zhì)的均勻性檢驗的F值均小于臨界值(2.30),說明4種海水活性磷酸鹽標準物質(zhì)的均勻性良好,符合標準物質(zhì)樣品的要求。

表3 均勻性檢驗結(jié)果

4.2 穩(wěn)定性檢驗結(jié)果

長期穩(wěn)定性檢驗中對抽取的樣品在15個月內(nèi)先后測量7次,4種濃度活性磷酸鹽樣品在不同時間測定的結(jié)果及統(tǒng)計數(shù)據(jù)見表4和圖4。經(jīng)分析,全部樣品的穩(wěn)定性均滿足公式(1)要求,即隨時間推移,特性值沒有顯著變化趨勢,可認為是穩(wěn)定的。

表4 長期穩(wěn)定性檢驗結(jié)果

圖4 長期穩(wěn)定性檢驗結(jié)果

短期穩(wěn)定性是為了考察樣品在運輸、野外條件下可能受到的影響。將樣品保存在4個環(huán)境溫度中分別進行7天內(nèi)穩(wěn)定性評價(見圖5和表5)。經(jīng)分析,在包含高溫、低溫、常溫的全部環(huán)境條件下,所有樣品穩(wěn)定性均滿足公式(1)要求,即隨時間推移,特性值沒有顯著變化趨勢,可認為是穩(wěn)定的。

表5 短期穩(wěn)定性檢驗結(jié)果

圖5 短期穩(wěn)定性檢驗結(jié)果

4.3 定值結(jié)果及不確定度

本研究中共6家實驗室參與了聯(lián)合定值,均采用PMB分光光度法測定。其中兩家實驗室采用流動分析技術(shù),通過在線反應(yīng)方式完成分析,其余4家實驗室參照GB/T 12763.4—2007[7],采用手工離線方式完成顯色及測定。各實驗室數(shù)據(jù)經(jīng)過統(tǒng)計檢驗,均符合要求并被采納(表6和表7)。

表6 原始數(shù)據(jù)統(tǒng)計檢驗結(jié)果

表7 聯(lián)合定值測量結(jié)果

統(tǒng)計分析后得到所研制標準物質(zhì)的目標物標準值及各個不確定度分量,對各分量進行合成后計算得到標準不確定度,取包含因子k=2,得到相對擴展不確定度分別為10%、5%、3%和2%(表8)。

表8 不確定度分析結(jié)果

5 結(jié)論與展望

本研究以西太平洋表層海水為基質(zhì),制備了0.5～4.0 μmol/L系列濃度的海水活性磷酸鹽標準物質(zhì)。通過定值方法研究、驗證、應(yīng)用及均勻性、穩(wěn)定性統(tǒng)計檢驗等,對該標準物質(zhì)的相關(guān)性能進行了評價,結(jié)論如下。

1)通過對PMB分光光度法進行優(yōu)化和驗證,確認該方法檢出限為0.03 μmol/L,可滿足本研究中所制備的低濃度標準物質(zhì)的定值測量需求。

2)通過均勻性檢驗和穩(wěn)定性檢驗,確認所制備的標準物質(zhì)均符合批次內(nèi)均勻性要求,且長期穩(wěn)定性可達15個月,在高溫、低溫、常溫不同貯存環(huán)境下7天可保持特性值無顯著性變化。

3)經(jīng)不確定度分析,4個批次標準物質(zhì)最終定值的相對擴展不確定度為2%～10%。

本研究成果可直接用于海洋樣品分析中的質(zhì)控環(huán)節(jié),或用于校準海洋專用磷酸鹽分析儀器等方面,由于與分析目標物基質(zhì)一致,可有效減小基質(zhì)差異引起的測量誤差。鑒于目前樣品覆蓋濃度范圍較小,且不確定度指標與已有產(chǎn)品仍有差距,后續(xù)研究將繼續(xù)完善制備技術(shù)和定值技術(shù),針對不同海域特點研制更寬濃度范圍的樣品,以滿足我國海洋生態(tài)保護修復(fù)及環(huán)境監(jiān)測等多方面的需求。