李正媛,陳 瓊,唐振洲,黃炳耀,高程海,劉永宏,柴 玲,林 霄**

(1.廣西中醫(yī)藥大學海洋藥物研究院,廣西南寧 530200;2.廣西中醫(yī)藥研究院,廣西中藥質(zhì)量標準研究重點實驗室,廣西南寧 530022)

海洋真菌是指生活在海洋環(huán)境中的真菌,按來源可分為動物來源、紅樹林來源、海藻來源、珊瑚礁來源、海水來源及沉積物來源等[1]。由于長期處在高鹽、高壓、寡營養(yǎng)等獨特的海洋生境下,海洋真菌形成了獨特的代謝途徑和防御機制。與海洋細菌相比,海洋真菌的生命層次更高,具有更復雜的代謝能力,能產(chǎn)生大量骨架多樣、結(jié)構(gòu)新穎的代謝產(chǎn)物,具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒等多種生物活性[2-4]。因此,海洋真菌一直以來都是化學和藥學等領(lǐng)域研究的焦點,是藥物研發(fā)新型先導化合物的重要資源寶庫[5-7]。

廣西管轄的北部灣海域位于中國南海的西北部,地處熱帶和亞熱帶,海域面積2.8萬平方千米,分布有紅樹林、珊瑚礁和海草床三大典型海洋生態(tài)系統(tǒng),是海洋微生物生長的理想溫床[8,9]。雖然蘊含著豐富的海洋微生物資源,但是關(guān)于北部灣廣西海域海洋真菌的物種多樣性及其生物活性潛力的研究起步較晚。徐新亞等[10]統(tǒng)計顯示北部灣已發(fā)現(xiàn)海洋細菌1 843種,而真菌僅197種,且這些真菌絕大部分來源于紅樹林植物及其根際土壤,針對海綿、海藻和珊瑚等海洋生物相關(guān)的微生物研究相對較少[11,12]。近年來,盧護木等[13]從潿洲島珊瑚和海藻等生物樣本中分離獲得了40株海洋真菌,其中5株真菌具有豐富的次生代謝產(chǎn)物和顯著的抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-ResistantStaphylococcusaureus,MRSA)活性。陸春菊等[14]采用4種培養(yǎng)基從10個潿洲島柳珊瑚樣本中分離得到191株共附生真菌,其中11種真菌具有抑菌活性,尤其是7種真菌可抑制表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)生物被膜形成。上述研究表明北部灣廣西海域中的微生物資源有著廣闊的開發(fā)前景。基于此,本研究對北部灣廣西海域海綿、珊瑚和沉積物等樣品的真菌進行分離,并對其抗腫瘤、抗菌能力進行評估,為發(fā)現(xiàn)海洋來源的新型藥物先導化合物奠定材料基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來源

海底沉積物、海綿、海螺和珊瑚等樣品分別采集于潿洲島(21.028 939 89°N, 109.075 839 17°E)、沙田鎮(zhèn)(21.503 406 99°N,109.619 726 78°E)及北海附近(21.559 623 72°N,108.928 553 71°E)的海域(圖1),樣品于水下裝入無菌封口袋密封,置于冰盒中保存,運輸至實驗室后于4 ℃冰箱中低溫保藏并用于真菌的分離。

圖1 采樣區(qū)域位置示意圖

1.1.2 儀器與試劑

MLS-3781L-PC高壓蒸汽滅菌鍋(SANYO公司),N-1300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本東京理化器械株式會社),KQ-800DE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司),SHP-250生化培養(yǎng)箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司),C1002 PCR擴增儀(美國Bio-Rad公司),DYY-6D核酸電泳儀(北京六一生物科技有限公司),ZWYR-2102立式恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智誠分析儀器制造有限公司)。Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR試劑盒[寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司],buffer、ITS1/ITS4引物、Taq酶[生工生物(上海)工程股份有限公司],提取用試劑乙酸乙酯、甲醇等均為分析純(廣東光華科技股份有限公司),細胞培養(yǎng)級二甲基亞砜(DMSO,北京索萊寶科技有限公司)。

1.1.3 培養(yǎng)基

真菌分離馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基:馬鈴薯提取粉6.0 g,葡萄糖20.0 g,瓊脂粉20.0 g,海鹽20.0 g,萘啶酮酸0.025 g,新生霉素0.025 g,蒸餾水1 L,置121 ℃高壓滅菌20 min,待溫度降至60 ℃以下,于超凈工作臺中倒平板,冷卻后待用。

馬鈴薯葡萄糖肉湯(PDB)培養(yǎng)基:馬鈴薯提取粉6.0 g,葡萄糖20.0 g,海鹽20.0 g,蒸餾水1 L,置121 ℃高壓滅菌20 min后待用。

大米培養(yǎng)基:于1 L的三角瓶中加入大米80.0 g,海鹽2.0 g,蒸餾水120 mL,透氣膜封口后,置于121 ℃高壓滅菌20 min后待用。

溶菌肉湯(LB)培養(yǎng)基:胰蛋白胨10.0 g,酵母提取物5.0 g,瓊脂粉20.0 g,蒸餾水1 L,置121 ℃高壓滅菌20 min,待溫度降至60 ℃以下,于超凈工作臺中倒平板,冷卻后待用。

1.1.4 指示菌及細胞株

病原菌:表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis),金黃色葡萄球菌(S.aureus),耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-ResistantS.aureusATCC-25923,MRSA),甘蔗梢腐鐮刀菌(Fusariumsp.LD-12)。

細胞:人結(jié)直腸癌細胞SW480,人結(jié)直腸癌細胞HT29,人正常肝細胞LO-2。

1.2 方法

1.2.1 樣品預(yù)處理及真菌的分離培養(yǎng)

海洋生物樣品:在超凈臺取海綿、珊瑚、海螺樣品的新鮮組織,剪成約1 cm×1 cm大小的碎片;用無菌人工海水洗滌后,在研缽中充分研磨;采用無菌人工海水按1∶10的比例逐級稀釋。沉積物:稱量海泥樣品1.0 g,加入1 mL 無菌人工海水按1∶10的比例逐級稀釋。

取不同稀釋度(原漿,10-1,10-2)的菌懸液200 μL分別均勻涂布于分離PDA平板上,每個稀釋度涂布3個平板,于28 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3-10 d。待平板上菌落長出后,挑取形態(tài)、顏色不同的單菌落至無萘啶酮酸和新生霉素的PDA平板中繼續(xù)純化培養(yǎng)。將純化好的菌株一份接入斜面培養(yǎng)基,存放于4 ℃冰箱;另一份接入含20%甘油的液體培養(yǎng)基中,于-80 ℃冰箱保藏。

1.2.2 海洋真菌的分子鑒定

用無菌牙簽挑取少量真菌菌絲體,置于1.5 mL離心管中,采用Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR試劑盒對菌體進行裂解,采用真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進行PCR擴增[15]。PCR反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性45 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,共30個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測?；驕y序委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。將測序結(jié)果在美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)數(shù)據(jù)庫中進行基本局部比對搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool,BLAST)分析,根據(jù)檢索序列的相似性初步鑒定菌株的種屬。結(jié)合形態(tài)學觀察和序列比對結(jié)果對真菌進行排重,采用Mega-X構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 真菌發(fā)酵粗提物的制備

將純化培養(yǎng)所得的菌株接種于PDB培養(yǎng)基中。透氣封口膜封口后置于搖床中,28 ℃、180 r/min條件下活化3-5 d。取10 mL菌液接種至大米培養(yǎng)基中,室溫下靜置發(fā)酵30 d。發(fā)酵結(jié)束后,將大米培養(yǎng)基搗碎,加入600 mL乙酸乙酯,40 kHz超聲提取3次,每次1 h。真空抽濾,合并濾液,減壓濃縮后得到發(fā)酵粗提物。粗提物用DMSO溶液溶解,配置成10 mg/mL的供試品溶液,備用。

1.2.4 粗提物的抑菌活性測試

采用濾紙片瓊脂擴散法測試粗提物對表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、甘蔗梢腐鐮刀菌的抑菌活性。將上述指示菌均勻涂布到LB培養(yǎng)基上,并用鑷子將直徑為6 mm的無菌濾紙片貼于培養(yǎng)基表面,輕按固定。用移液器吸取粗提物供試品溶液3 μL于濾紙片上,并以氨芐霉素或青霉素作為陽性對照,DMSO為陰性對照。加藥后的平板于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)12-24 h,觀察有無抑菌圈產(chǎn)生。

1.2.5 粗提物的細胞毒活性測試

采用MTT比色法[16]測試粗提物對人結(jié)直腸癌細胞SW480、HT29和人正常肝細胞LO-2的細胞毒活性。將真菌發(fā)酵粗提物供試品溶液稀釋至100 μg/mL并給藥,以0.1% DMSO作為陰性對照,實驗設(shè)3個重復。給藥72 h后,用酶標儀測定490 nm處的吸光度(OD值),計算各組細胞增殖抑制率。抑制率(%)=[(OD陰性-OD粗提物)/OD陰性]×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定結(jié)果及多樣性分析

從來源于北部灣廣西海域的7份海綿、2份珊瑚、1份海螺和2份沉積物樣品中分離得到54株海洋真菌,經(jīng)菌落形態(tài)差異排重后得到45株?；贜-J法的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)顯示45株真菌分布在17個屬(表1),其中青霉屬(Penicillium)和曲霉屬(Aspergillus)為優(yōu)勢種群,分別占26.7%和24.4%,其次為木霉屬(Trichoderma),占11.1%。此外,菌株MyrotheciumgramineumGXIMD01018與其近緣菌株ITS基因的最高相似度低于97%,推測其是潛在的新種。

表1 海洋真菌菌株的物種鑒定

圖2 基于ITS測序的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 細胞毒活性篩選

45株真菌大米發(fā)酵后的乙酸乙酯粗提物對人結(jié)直腸癌細胞SW480、HT29及人正常肝細胞的細胞毒活性見表2。結(jié)果表明菌株P(guān)enicilliumoxalicumGXIMD01021對SW480和HT29兩種人結(jié)直腸癌細胞均有顯著的細胞毒活性,抑制率大于79%,且對正常細胞(LO-2)的毒性較低(抑制率<50%);AspergillusjaponicusGXIMD01014、TalaromycespurpureogenusGXIMD01024、Trichodermasp.GXIMD01026、FusariumsolaniGXIMD01034、Trichodermasp.GXIMD01038對SW480具有較顯著的細胞毒活性;菌株P(guān)enicilliumoxalicumGXIMD01004、AspergillusnigerGXIMD01012、Paraphaeosphaeriasp.GXIMD01025、Sarocladiumsp.GXIMD01031對癌細胞和正常細胞均有毒性。

表2 海洋真菌大米發(fā)酵產(chǎn)物的細胞毒活性篩選結(jié)果

2.3 抑菌活性篩選

測試45株真菌大米發(fā)酵后的粗提物對金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌及甘蔗梢腐致病菌的抑制作用,共篩選出6株真菌對至少一種病原菌具有一定的抑菌作用,其中菌株TalaromycespurpureogenusGXIMD01024和菌株P(guān)enicilliumoxalicumGXIMD01004的發(fā)酵產(chǎn)物分別對MRSA菌株、甘蔗梢腐鐮刀菌具有一定的抑制作用(表3)。

表3 海洋真菌大米發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌活性篩選結(jié)果

3 結(jié)論

本研究采用稀釋分離法從北部灣廣西海域采集的海綿、珊瑚等樣品中,分離純化獲得45株真菌,其中MyrotheciumgramineumGXIMD01018是一潛在新種。通過濾紙片瓊脂擴散法和MTT法對菌株代謝產(chǎn)物的抗菌、抗腫瘤活性進行初步篩選,發(fā)現(xiàn)菌株P(guān)enicilliumoxalicumGXIMD01021對兩種人結(jié)直腸癌細胞均具有顯著的細胞毒活性,AspergillusjaponicusGXIMD01014等5株菌株對人結(jié)直腸癌細胞SW480具有顯著的細胞毒活性,菌株TalaromycespurpureogenusGXIMD01024的發(fā)酵產(chǎn)物具有一定的抗MRSA活性,P.oxalicumGXIMD01004對甘蔗梢腐鐮刀菌具有一定的抑制效果。然而,目前僅對菌株的發(fā)酵粗提物進行了活性研究,菌株中具體的藥效物質(zhì)仍需要進行系統(tǒng)的化學和生物活性評價研究。后續(xù)將對上述菌株的次級代謝產(chǎn)物進行深入研究,為北部灣廣西海域來源的新型藥物先導化合物的發(fā)現(xiàn)提供理論基礎(chǔ)和參考依據(jù)。